专利名称：生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒，更确切地说本发明利用生物发光法快速检测微生物总量或者特定微生物数量的方法及检测试剂盒，属于微生物检测领域。
背景技术：
快速检测和识别致病菌不管是在临床诊断方面，还是在食源性致病菌监测方面， 甚至生物武器防察方面都是当今社会的一个重要议题。食源性致病微生物种类繁多，缺乏灵敏、便捷、特异的快速检测技术，是食品安全和人民健康无法得到有效保障的主要原因之一。由于缺乏有力的监测技术，据WHO报告，世界各国食源性疾病报告的发病率不到实际发病率的10%。因此开发针对致病菌的快速、灵敏、可靠的检测方法和现场、便携的检测仪器和配套试剂，是食品安全、人民健康和国家安全保障的迫切需要。水和食品中细菌的检测，特别是致病性细菌的检测，对于控制传染病、保护环境卫生和人民群众身体健康都有着重要的意义。目前水体菌落总数测定采用国标平板计数法即 37°C恒温培养Mh，因为这种方法结果可靠，被视为微生物检测的金标准。但是，传统的微生物培养法耗时长、步骤繁琐、需要多种培养基和试剂，无法满足当今社会一些突发事件对微生物现场快速检测的迫切需求。ATP生物发光法是近年来发展最快的定量微生物检测分析技术之一，具有快速、简便、灵敏等特点，主要是通过间接测定活菌总数来监测样品清洁度或卫生状况。生物发光计数法利用ATP与虫荧光素-荧光素酶(Luciferin-Luciferase)复合物的反应来测定是否存在三磷酸腺苷(ATP)。荧光素酶在镁离子存在的条件下，与还原荧光素和ATP结合形成荧光素酶-荧光素-单磷酸腺苷的复合物，该复合物与氧结合时发出荧光D-Luciferln + ATP + Oz^Oxy-Lncifeiin 4 AMP + ppi + H2O + hw实质上，虫荧光素酶促进的生物发光反应，使用了 ATP分子内的化学能，激发了荧光素氧化脱羧作用，然后产生发光。萤火虫荧光素酶几乎唯一以ATP为特异的底物，来自自然界其它核苷的影响可被忽略发光试剂于饱和量下，每一 ATP分子能释放出一个光子，因此光子的数量与ATP含量成正比。发出的光及ATP含量可使用相对发光强度(RLUs)来衡量，这些单位均可直接使用，而不必计算具体的ATP量或菌落形成单位(CFUs)。光子的数量可采用ATP荧光仪进行测量。ATP生物发光法存在的首要问题是灵敏度有时达不到卫生学要求。从灵敏度角度讲，ATP生物发光法要求样品中细菌浓度最低不少于1000CFU/ml，但这种灵敏度有时达不到卫生学要求，需要一定时间的预培养。而免疫磁分离技术是一种行之有效的浓缩方法，可以将细菌数浓度提高10倍甚至100倍，从而节省了预培养的时间，大大缩短检测时间。因此将ATP生物发光法与免疫磁分离技术结合起来，检测大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌，将具有快速、特异性好、灵敏度高等特点，在食品、环境、化工、医药等领域将有广阔的发展前景。本发明针对目前饮用水和食品监测和控制中缺乏快速、灵敏、可靠检测致病菌的现状，本发明拟采用生物发光法结合免疫磁分离技术实现快速检测总菌和目标致病菌，为后期开发的便携式生物传感器提供配套的试剂。
发明内容
本发明的目的是提供生物发光检测特种致病菌使用的检测方法和检测用试剂盒， 本发明提供了一种快速检测特定食源性致病菌数量的方法，建立特异性的生物发光检测试剂盒，为卫生监督和食品安全提供可靠保障。本发明提供的快速检测微生物数量的试剂盒，包括包被抗体的免疫磁珠、微生物裂解液、荧光素酶及保护剂、检测缓冲液等试剂。检测方法是利用生物发光法结合免疫磁珠识别特种致病菌，具体是利用免疫磁珠上的单克隆抗体或者多克隆抗体，通过抗原抗体反应捕获菌悬液或者样品中的特异性致病菌，然后加入裂解液释放细菌内的三磷酸腺苷 (ATP)，最后通过荧光素(D-Luciferin)-荧光素酶(Luciferase)检测ATP含量来判断样品中是否存在特定致病菌，并通过ATP标准曲线的测定来推测含有特定致病菌的数量。(1)本发明提供的生物发光检测特种致病菌使用的检测方法的检测步骤是a)先制作标准ATP曲线，即对ATP标准品进行等比稀释，浓度范围在10_12-10_7mol/ 1。加入生物发光剂进行检测，得到ATP标准品浓度与其发光值之间的关系曲线。b)然后参照国标方法对样品进行预处理，制备成体积为0. 2-10ml的样品溶液。c)将一定量的免疫磁珠加入到样品溶液中，共孵育30-100min，充分反应后，磁分离除去上清液。然后加入少许检测缓冲液洗涤，磁分离除去上清液，重复一次，得到浓缩的目标微生物溶液。d)在上述浓缩的溶液中加入少量的微生物裂解液(10-100μ 1)，室温作用 l_5min。e)加入检测缓冲液(50-200 μ 1)，在避光的条件下加入生物发光试剂 (50-100 μ 1)，然后立即置发光检测仪中测定发光值。f)样品中相应致病菌ATP含量的计算根据测定的发光值和a)中所得的标准曲线，推算样品中相应的ATP浓度和致病菌数量。(2)本发明所述的快速检测微生物数量试剂盒，具体由包被抗体的免疫磁珠 (0. l-5ml)、ATP标准品(50-500 μ 1)、微生物裂解液(I-IOOml)、生物发光试剂(l_50ml)、检测缓冲液(10-500ml)等试剂组成。其中包被抗体的免疫磁珠按照Iml计，含有1-100 μ g的单克隆抗体或者多克隆抗体、 0. I-Img的聚合物修饰的超顺磁狗304或者γ -Fe2O3纳米颗粒，含有I-IOmg牛血清白蛋白和吐温80的缓冲液；ATP 标准品含有 1 X l(T7mol/l ATP ；微生物裂解液按照体积百分比计，含有0. 5-5%的三氯乙酸(TCA)、十二烷基三甲基溴化铵、曲拉通(Triton X-100)、二甲亚砜(DMSO)、苯甲烷胺中至少一种裂解试剂；检测缓冲液包含l_20mM可溶性无机镁盐和三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液 (pH = 7. 6-7. 8)
生物发光剂按照Iml计，含有0. 01-5mg的荧光素、0. OOl-Img的荧光素酶、 0. 5-10mg的牛血清白蛋白、0. 5-10mg海藻糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH = 7. 6-7. 8)本发明提供的特定致病菌快速检测方法，无需增菌或者过滤，大大缩短了检测时间，在2小时内可完成检测，与国家标准规定中采用的平板计数法相比，具有快速、操作简便、灵敏度高，特异性强等优点，有利于构建简单、快速、灵敏、使用界面友好的分析系统，适合于食品、环境样品的现场快速检测及基层普及应用。
图1生物发光快速检测特种致病菌的流程图。图2生物发光法ATP标准曲线的测定。
具体实施例方式下面通过具体实施例的介绍，进一步阐明本发明实质性特点和显著的进步，但本发明决非仅局限于实施例。实施例1 生物发光法快速检测E. coli0157:H7试剂盒的构建生物发光法快速检测E. coli0157:H7试剂盒包括包被抗体的免疫磁珠5瓶，每瓶 100 μ 1 ；标准ATP溶液(1 X 10_7mOl/l) 1瓶，每瓶100 μ 1 ；微生物裂解液1瓶IOml ；检测缓冲液5瓶，每瓶20ml ；生物发光试剂5瓶，每瓶1ml。其中，①试剂的配制包括a)免疫磁珠取500 μ g羧基磁珠于1. 5ml离心管中，加入Iml清洗缓冲液，混合均勻并超声15min，磁分离洗涤两遍后，重悬在250 μ 1 2_(Ν_吗啉基)乙磺酸(MES)中，再分别加入500 μ gl-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和750 μ gN-羟基琥珀酰亚胺(MB)，37°C活化磁珠表面的羧基15min，然后用MES清洗两次，重悬后加入50ug的抗体，室温反应池，将抗体偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。用PBS洗涤偶联后磁珠2遍，加入50ul含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，保存于4°C冰箱。b)标准ATP试剂用检测缓冲液10倍倍比稀释ATP标准样(1 X I(TmoVl)，获得不同浓度的ATP标准品。c)微生物裂解液采用三氯乙酸作为ATP提取剂，浓度为0. 5% 2%，经过高压灭菌处理(12rC，30min)后在4°C下保存。d)检测缓冲液以Tris-Acetate作为缓冲液。称取一定量的Tris碱，使定容后的浓度为0. 1M，定容前需要先调节pH值。将pH计插入Tris溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值为7. 75，然后定容，经过高压灭菌处理(12rC，30min)后在4°C下保存。e)生物发光试剂取5mg的牛血清白蛋白和5mg海藻糖溶解于0. IM的Tris-HAc 缓冲液(PH = 7. 6-7. 8)，然后加入Img的荧光素、0. 5mg的荧光素酶，轻轻摇晃(不能振荡) 使其溶解。使用前在室温下放置1小时，使其温度恢复到室温，不用时避光储存于-20°C的冰箱中。实施例2 采用生物生物发光法快速检测特种致病菌试剂盒检测食品中的大肠杆菌 0157:H7采用实施例1中的检测试剂盒用于实施例2的检测CN 102183648 A
说明书
4/4页检测流程示意图如图1所示。具体步骤如下a)先制作标准ATP曲线，即对ATP标准品进行等比稀释，浓度范围在10-12-l(T7mOl/ 1。加入生物发光剂进行检测，得到ATP标准品浓度与其发光值之间的关系。b)然后对样品进行预处理，制备成合适的样品溶液。c)将免疫磁珠加入到样品溶液中，共孵育，充分结合后除去上清液。d)加入少量的微生物裂解液，室温作用lmin。e)加入检测缓冲液lOOul，加入生物发光试剂50ul，然后立即置发光检测仪中测
定发光值。f)样品中相应致病菌ATP含量的计算根据测定的发光值和a)中所得的标准曲线，推算样品中相应的ATP浓度和致病菌数量。结果表明该方法检测限可达IO2CFU · πιΓ1.
权利要求
1.一种生物发光快速检测特种致病菌使用的检测方法，其特征在于利用免疫磁珠上的单克隆抗体或者多克隆抗体，通过抗原抗体反应捕获菌悬液或者待测试样中的致病菌，然后加入微生物裂解液释放细菌内的三磷酸腺苷，最后通过荧光素-荧光素酶检测ATP含量， 以判断样品中是否存在特定致病菌，并通过ATP标准曲线的测定来推测含有特定致病菌的数量。
2.根据权利要求1所述的方法，特征在于按照下述步骤进行(1)标准ATP曲线的制作对ATP标准品进行等比稀释，浓度范围在10_12 10_7mol/L，加入生物发光剂进行检测， 获得ATP标准品浓度与其发光值之间的关系曲线；(2)待测样品的预处理按照不同样品的性质参照国标对待测样品进行相应的预处理，制备成体积为0. 2-10ml 的样品溶液；(3)特异性致病菌的磁珠富集将免疫磁珠加入到待测样品溶液中，共孵育30-100min，充分反应后，磁分离除去上清液；(4)致病菌裂解在步骤(3)所述的待测样品中加入10-100 μ 1微生物裂解液，室温作用l-5min。(5)ATP生物发光测试在步骤(4)所述的溶液中加入检测缓冲液50-200 μ 1，加入生物发光试剂50-100μ 1， 然后立即置发光检测仪中测定发光值；(6)试样中相应致病菌ATP含量的计算根据步骤(5)测定的发光值和步骤⑴中所得的标准曲线，推算样品中相应的ATP浓度和致病菌数量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包被抗体的免疫磁珠按照Iml计，含有1-100 μ g的单克隆抗体或者多克隆抗体、0. I-Img的聚合物修饰的超顺磁!^e3O4或者 Y -Fe2O3纳米颗�：秃蠭-IOmg牛血清白蛋白和吐温80的缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的微生物裂解液按照体积百分比计，含有0. 5-5%的三氯乙酸、十二烷基三甲基溴化铵、曲拉通、二甲亚砜、苯甲烷胺中至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于检测缓冲液包含l_20mM可溶性无机镁盐和三羟甲基氨基甲烷，缓冲液的PH = 7. 6-7. 8。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于生物发光剂按照Iml计，含有0.01-5mg 的荧光素、0. OOl-Img的荧光素酶、0. 5-10mg的牛血清白蛋白、0. 5-10mg海藻糖和pH为 7. 6-7. 8的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
7.由权利要求1_3、5或6中任一项所述的方法配套构建的试剂盒，其特征在于具体由包被抗体的免疫磁珠0. l-5ml、ATP标准品500-500 μ m、微生物裂解液I-IOOml、生物发光试剂1-50ml、检测缓冲液10-500ml组成。
8.按权利要求7所述的试剂盒，其特征在于用于快速检测E.coli0157:H7试剂盒包括包被抗体的免疫磁珠5瓶，每瓶100 μ 1 ；标准ATP溶液(1 X 10_7mol/l) 1瓶，每瓶100 μ 1 ；微生物裂解液1瓶IOml ；检测缓冲液5瓶，每瓶20ml ；荧光素酶及保护剂5瓶，每瓶Iml ；其中①免疫磁珠取500μ g羧基磁珠于1. 5ml离心管中，加入Iml清洗缓冲液，混合均勻并超声15min，磁分离洗涤两遍后，重悬在250 μ 1 2-(N-吗啉基)乙磺酸中，再分别加入 500 μ gl-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750 μ g N-羟基琥珀酰亚胺，37°C条件下活化磁珠表面的羧基15min，然后用2- (N-吗啉基)乙磺酸清洗两次，重悬后加入50ug 的抗体，室温反应池，将抗体偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。用PBS洗涤偶联后磁珠2遍， 加入50 μ 1磷酸盐缓冲液中，保存于4°C冰箱。②标准ATP试剂用检测缓冲液10倍的倍比稀释ATP标准样，获得10-12-10-7mol/L 浓度的ATP标准品；③微生物裂解液采用三氯乙酸作为ATP提取剂，浓度为0.5% 2%，经过高压灭菌处理后在4°C下保存；④检测缓冲液以Tris-Acetate作为缓冲液，配制方法是称取一定量的Tris碱，使定容后的浓度为0. 1M，定容前需要先调节pH值；将pH计插入Tris溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值为7. 75，然后定容，经过高压灭菌处理后在4°C下保存；⑤生物发光试剂取5mg的牛血清白蛋白和5mg海藻糖溶解于0.IM的pH为7. 6-7. 8 的Tris-HAc缓冲液，然后加入Img的荧光素、0. 5mg的荧光素酶，轻轻摇晃使其溶解，避光储存于-20°C的冰箱中。
9.按权利要求8所述的试剂盒，其特征在于a)①中磷酸盐缓冲液含有0.牛血清蛋白；b)③和④中灭菌处理条件下121°C、30min；c)⑤中所述的摇晃不能振荡；d)⑤中所述的生物发光试剂使用前从-20°C的冰箱中取出后，在室温下放置1小时，使温度恢复到室温。
10.按权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于检测时无需增菌或过滤，在2小时内完成检测食品中大肠杆菌0157:H7，检测限可达IO2CFU · πιΓ1。
全文摘要
本发明涉及一种利用生物发光法结合免疫磁珠识别检测特种致病菌的方法及检测用试剂盒。本方法利用免疫磁珠上的单克隆抗体或者多克隆抗体，通过抗原抗体反应捕获菌悬液或者样品中的细菌，然后加入裂解液释放细菌内的三磷酸腺苷(ATP)，最后通过荧光素(D-Luciferin)-荧光素酶(Luciferase)检测ATP含量来判断样品中是否存在特定微生物，并通过ATP标准曲线的测定来推测含有特定微生物的数量。本发明提供的试剂盒，包括包被抗体的免疫磁珠、微生物裂解液、荧光素酶及保护剂、检测缓冲液等试剂。通过本发明能够大大缩短检测时间(2小时以内)，无需增菌或者过滤，操作简便，灵敏度高，特异性强，适合于食品、环境样品的现场快速检测及基层普及应用。
文档编号G01N33/577GK102183648SQ20111002994
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者周洪波, 葛玉卿, 赵建龙, 金庆辉 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所
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