专利名称：植物叶片气孔活体的三维显微观测方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术与光学图像构建领域，涉及一种植物叶片气孔活体的三维显微观测方法。
背景技术：
叶片作为植物体重要的器官，能比其他器官更灵敏地反映植物的状况，故叶片的生理反应备受关注。气孔是植物叶片的重要组成成分之一，由两个保卫细胞构成，细胞尺寸均为微米量级，是空气中CO2进入植物体和植物体内水分蒸发的主要通道。植物叶片气孔主要控制植物的两个生理过程，即控制光合作用中吸收CO2分子的平衡和控制蒸腾作用中水分子的丢失。此外，气体通过气孔进出叶子的扩散过程中，气孔受到其生物学特性以及生理活动的控制而开闭。因此，植物的气孔是连接大气和陆地植物的重要角色。在生物学研究的基础上，已有人进行了部分相关研究，并结合解剖学与微尺寸观察方法对植物叶片微状态进行观测。但植物叶片气孔由于其尺寸及分布位置特殊等原因， 目前仅在叶片离体状态下，通过制作生物切片才可观测到，而未见在非离体状态下，活体直接观测叶面气孔的显微仪器或方法。离体状态下测得的气孔状态信息量有限，且无法对同一气孔在不同时刻内的生理反应进行比较，所提供的信息量非常有限。生物检测领域采用的光学系统直接得到的是观测对象的二维图像，方法简便，操作易行，但远不如三维图像清晰直观，信息量大。然而，如何由二维图像与信息构建观测对象的三维形态是个技术上的难题。综上，如何在非离体状态下准确测得气孔状态，进而由二维图像与信息构建出植物叶片气孔的三维形态，已成为目前生物学、光学及其交叉学科领域亟需研究和解决的重大课题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种植物叶片气孔活体的三维显微观测方法，该方法可在叶片非离体条件下，连续采集气孔状态图像，检测植物正常生长状态或特定实验状态下叶片气孔变化状况，保证叶片气孔的最大信息量。为达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下
1)将光学放大组件通过套筒与调焦导轨相连，变焦物镜与CXD图像采集传感器相连， 组成图像放大采集系统；调焦导轨与连接板相连，连接板通过第一升降机构与水平微调导轨连接；
2)将栽有被测植物的花盆置于被测物承载平台上，被测叶片通过叶片夹紧装置固定一处观测区域，被测物承载平台与第二升降机构相连，实现上下位置调整；被测物承载平台通过第二升降机构固定于底面的水平微调导轨上；
3)CCD图像采集传感器通过USB数据传输线与上位机连接，通过图像采集软件对叶片气孔进行实时采集观测；4)通过自动调焦或手动调焦的方法，每隔一定步长获取叶片表面的一幅图像，对采集到的数据经过图像去噪、曲线平滑、曲线拟合后，得到被测叶片表面的各区域高度值的信息，结合由长工作距离金相物镜与变焦物镜测得的二维数据，就可以对被测叶面进行三维重建和渲染，得到叶片表面气孔状态的三维图像；
所述的光学放大组件由长工作距离金相物镜与变焦物镜组成，其中，长工作距离金相物镜的光学工作距离为6. 8mm 12mm，长工作距离金相物镜安装在变焦物镜之前，并使得光学放大组件可在IOx 50x的光学放大倍率内调节；
连接板和第一升降机构之间通过紧固螺钉活动连接，所述的紧固螺钉可实现光学放大组件的观测角度在-45° +45°角度范围内调节；
所述的叶片夹紧装置可固定被测叶片的局部区域，并分为前夹板与后夹板，其中前夹板用于固定并整平观测区域叶面，前夹板上设计有直径为5mm IOmm的圆形光孔作为植物叶片气孔观测区域，后夹板与叶片的背部紧贴；前夹板和后夹板分别设置磁铁，前夹板上的磁铁可与后夹板上的磁铁吸合。所述的光学放大组件的变焦物镜上安装有同轴照明器，观测过程中以同轴光照明方式提供光源；
所述的长工作距离金相物镜正对植物叶片气孔观测区域放置。本发明具有的有益效果是可在植物叶片非离体条件下，连续采集气孔状态图像， 并二维观测植物正常生长状态或特定实验状态下叶片气孔变化状况，保证叶片气孔的最大信息量，实现了对植物叶片气孔的活体观测。对直接得到的植物叶片二维图像与信息进行分析处理，构建植物叶片气孔的三维图像。实现了对植物叶片气孔实时状态观测、信息采集及由植物叶片二维图像构建三维图像的后续处理。
图1是植物叶片气孔活体显微观测方法流程图； 图2是植物叶片气孔活体显微观测方法原理框图； 图3是植物叶片气孔活体显微观测方法示意图中1. CCD图像采集传感器；2.变焦物镜；3.套筒；4.同轴照明器；5.长工作距离金相物镜；6.夹紧装置；7.被测叶片；8.花盆；9.承载平台；10.调焦导轨；11.连接板； 12.紧固螺钉；13.第一升降机构；14.第二升降机构；15.水平微调导轨；16. USB数据传输线；17.上位机。图4是某日8:00 a. m实验测量并经过灰度处理后的花生气孔图片； 图5是某日10:00 a. m实验测量并经过灰度处理后的花生气孔图片；
图6是某日12:00 a. m实验测量并经过灰度处理后的花生气孔图片； 图7是某日14:00 p. m实验测量并经过灰度处理后的花生气孔图片； 图8是某日17:00 p. m实验测量并经过灰度处理后的花生气孔图片； 图9是某日19:00 p. m实验测量并经过灰度处理后的花生气孔图片。
具体实施例方式如图1所示，选用该测量方法进行植物叶片气孔活体显微观测实验开始之后，首先安装光学放大组件，包括长工作距离金相物镜与变焦物镜。其次夹紧被测叶片，使用前后夹板上的磁铁吸合，保证观测区域叶面平整。在上位机上进行相关参数的设置，例如采样频率、采集时间等。然后进行自动或手动调焦，使长工作距离金相物镜正对植物叶片气孔观测区域，调整直至视场清晰明亮。如此即可进行气孔二维图像的采集。将采集到的气孔二维图像进行图像去噪、曲线平滑、曲线拟合等步骤后，得到被测叶片表面的各区域高度值的信息，再结合气孔二维信息，构建气孔三维图像。如图2所示，该测量方法的原理即待观测叶片的气孔图像信息通过光学放大组件放大足够倍数达到可视效果，同时结合机械调焦机构进行自动或手动调整，保证视场清晰明亮。完整的气孔二维显微图像被图像采集传感器采集，再传入上位机图像处理系统进行图像去噪、曲线平滑、曲线拟合等后续处理及图像存储，最终达到植物叶片气孔活体三维显微可观测的效果。如图3所示，该测量方法的步骤如下
1)将光学放大组件通过套筒3与调焦导轨10相连，变焦物镜2与CXD图像采集传感器 1相连，组成图像放大采集系统；调焦导轨10与连接板11相连，连接板11通过第一升降机构13与水平微调导轨15连接；
2)将装有被测植物的花盆8置于被测物承载平台9上，被测叶片7通过叶片夹紧装置 6固定一处观测区域，被测物承载平台9与第二升降机构14相连，实现上下位置调整；被测物承载平台9通过第二升降机构14固定于底面的水平微调导轨15上；
3)CXD图像采集传感器1通过USB数据传输线16与上位机17连接，通过图像采集软件对叶片气孔进行实时采集观测。4)通过自动调焦或手动调焦的方法，每隔一定步长获取叶片表面的一幅图像，对采集到的数据经过图像去噪、曲线平滑、曲线拟合后，得到被测叶片表面的各区域高度值的信息，结合由长工作距离金相物镜5与变焦物镜2测得的二维数据，就可以对被测叶面进行三维重建和渲染，得到叶片表面气孔状态的三维图像。所述的光学放大组件由长工作距离金相物镜5与变焦物镜2组成，其中，长工作距离金相物镜5的光学工作距离为6. 8mm 12mm，长工作距离金相物镜5安装在变焦物镜2 之前，并使得光学放大组件可在10f50X的光学放大倍率内调节；
连接板11和第一升降机构13之间通过紧固螺钉12活动连接，所述的紧固螺钉12可实现光学放大组件的观测角度在-45° +45°角度范围内调节；
所述的叶片夹紧装置6可固定被测叶片的局部区域，并分为前夹板与后夹板，其中前夹板用于固定并整平观测区域叶面，前夹板上设计有直径为5mnTl0mm的圆形光孔作为植物叶片气孔观测区域，后夹板与叶片的背部紧贴；前夹板和后夹板分别设置磁铁，前夹板上的磁铁可与后夹板上的磁铁吸合。所述的光学放大组件的变焦物镜2上安装有同轴照明器4，观测过程中以同轴光照明方式提供光源；
所述的长工作距离金相物镜5正对植物叶片气孔观测区域放置。如图4所示，利用上述测量方法得到的某日8:00 a. m实验测量并经过后续灰度处理的花生气孔图片。如图5所示，利用上述测量方法得到的某日10:00 a. m实验测量并经过后续灰度处理的花生气孔图片。如图6所示，利用上述测量方法得到的某日12:00 a. m实验测量并经过后续灰度处理的花生气孔图片。如图7所示，利用上述测量方法得到的某日14:00 p. m实验测量并经过后续灰度处理的花生气孔图片。如图8所示，利用上述测量方法得到的某日17:00 p. m实验测量并经过后续灰度处理的花生气孔图片。如图9所示，利用上述测量方法得到的某日19:00 p. m实验测量并经过后续灰度处理的花生气孔图片。上述具体实施方式
用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
权利要求
1.植物叶片气孔活体的三维显微观测方法，其特征在于该方法包括如下步骤1)将光学放大组件通过套筒⑶与调焦导轨(10)相连，变焦物镜(2)与C⑶图像采集传感器(1)相连，组成图像放大采集系统；调焦导轨(10)与连接板(11)相连，连接板(11) 通过第一升降机构(13)与水平微调导轨(15)连接；2)将栽有被测植物的花盆(8)置于被测物承载平台(9)上，被测叶片(7)通过叶片夹紧装置(6)固定一处观测区域，被测物承载平台(9)与第二升降机构(14)相连，实现上下位置调整；被测物承载平台(9)通过第二升降机构(14)固定于底面的水平微调导轨(15) 上；3)CXD图像采集传感器(1)通过USB数据传输线(16)与上位机(17)连接，通过图像采集软件对叶片气孔进行实时采集观测；4)通过自动调焦或手动调焦的方法，每隔一定步长获取叶片表面的一幅图像，对采集到的数据经过图像去噪、曲线平滑、曲线拟合后，得到被测叶片表面的各区域高度值的信息，结合由长工作距离金相物镜(5)与变焦物镜(2)测得的二维数据，就可以对被测叶面进行三维重建和渲染，得到叶片表面气孔状态的三维图像。
2.根据权利要求1所述的植物叶片气孔活体的三维显微观测方法，其特征在于所述的光学放大组件由长工作距离金相物镜(5)与变焦物镜(2)组成，其中，长工作距离金相物镜(5)的光学工作距离为6. 8mm 12mm，长工作距离金相物镜(5)安装在变焦物镜(2)之前，并使得光学放大组件可在IOx 50x的光学放大倍率内调节。
3.根据权利要求1所述的植物叶片气孔活体的三维显微观测方法，其特征在于连接板(11)和第一升降机构(13)之间通过紧固螺钉(12)活动连接，所述的紧固螺钉(12)可实现光学放大组件的观测角度在-45° +45°角度范围内调节。
4.根据权利要求1所述的植物叶片气孔活体的三维显微观测方法，其特征在于所述的叶片夹紧装置(6)可固定被测叶片的局部区域，并分为前夹板与后夹板，其中前夹板用于固定并整平观测区域叶面，前夹板上设计有直径为5mm IOmm的圆形光孔作为植物叶片气孔观测区域，后夹板与叶片的背部紧贴；前夹板和后夹板分别设置磁铁，前夹板上的磁铁可与后夹板上的磁铁吸合。
5.根据权利要求1所述的植物叶片气孔活体的三维显微观测方法，其特征在于所述的光学放大组件的变焦物镜(2)上安装有同轴照明器(4)，观测过程中以同轴光照明方式提供光源。
6.根据权利要求2所述的植物叶片气孔活体的三维显微观测方法，其特征在于所述的长工作距离金相物镜(5)正对植物叶片气孔观测区域放置。
全文摘要
本发明涉及一种植物叶片气孔活体的三维显微观测方法。本发明首先将光学放大组件与调焦导轨相连，变焦物镜与CCD图像采集传感器相连；调焦导轨与连接板相连，连接板与水平微调导轨连接；其次将被测植物置于被测物承载平台上，被测叶片固定一处观测区域；然后CCD图像采集传感器与上位机连接，通过图像采集软件对叶片气孔进行实时采集观测；最后通过自动调焦或手动调焦的方法，获取叶片表面的一幅图像，对采集到的数据经过图像去噪、曲线平滑、曲线拟合后得到叶片表面气孔状态的三维图像。本发明可在植物叶片非离体条件下，连续采集气孔状态图像，并二维观测植物正常生长状态或特定实验状态下叶片气孔变化状况，保证叶片气孔的最大信息量。
文档编号G01B11/24GK102221347SQ20111007700
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者张雯, 李东升, 郭冲冲, 郭天太, 郭琳, 陈爱军 申请人:中国计量学院
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