B型尿钠肽检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种B型尿钠肽检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了B型尿钠肽抗体的金纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，所述金纳米颗�：涂固逯柿勘任�50：20–60。还本发明还提供该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，稳定性好的特点，反应后不产生沉淀，便于生化仪的清洗，延长了生化仪的使用寿命。
【专利说明】B型尿钠肽检测试剂盒及其制备
【技术领域】
[0001]本申请涉及一种基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒及其制备。
【背景技术】
[0002]B型尿钠肽(BNP)是一种心脏神经激素，在血容量增加和压力负荷增加时反应性的从心室分泌。血浆BNP是近来研究较多的化学因子，BNP水平的升高可反映左室舒张末压的升高，收缩功能不全和舒张功能减低引起的心力衰竭均有此改变，对于心力衰竭的诊断有很大的意义。同时，BNP升高的水平与心力衰竭的NYHA分级存在正相关性，LVEF降低的患者，LVEF越低，BNP水平升高的越显著，对于心力衰竭的进展和近期及长期心性预后有很好的预测价值，BNP水平持续升高，心性事件发生率和心性死亡率升高，预后较差，经治疗后BNP降低的患者，预后可能会改善。
[0003]B型尿钠肽的常用检测有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，免疫比浊法随着全自动生化仪的普及而普及。但传统免疫比浊法的检测灵敏度仍然不能达到临床要求，于是出现了乳胶颗粒增强免疫比浊法。乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是，首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。然而，乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，干扰试验结果，且乳胶制造成本较高，导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法，如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合，以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了，表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。本发明研究表明，许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求，比如:氧化铁等磁性纳米颗粒在40nm以上时由于顺磁性和比重等因素而容易聚沉无法达到应有的稳定性；金纳米颗粒在粒径80-150nm的范围内稳定性太差而不合适等。根据中国专利CN102749454的教导，本发明以直径为35nm-60nm的胶体金颗粒进行试验，发现，灵敏度较差，无法满足临床中对灵敏度小于Ing/mL的要求，和最低检测限5ng/mL的要求，且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间，因此常常造成假阴性的结果；同时还存在反应时间长(平衡时间5-10min)，无法达到快速检验的要求。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术存在的错误教导，解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高，反应快捷，制造成本低，反应后不产生沉淀，方便生化仪清洗。
[0005]根据本发明的一方面，提供一种基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了 B型尿钠肽抗体的金纳米颗粒的溶液，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.lnm,优选67.2nm-72.4nm ;所述金纳米颗粒和抗体质量比在 50:20 - 60，优选 50:40-60ο
[0006]具体来讲，所述试剂R2为PH值5.0-9.5，优选6.0-8.5的溶液。
[0007]进一步地，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，促凝剂为重量体积比0.4%以内的PEG20000，稳定剂为重量体积比2%以内的BSA，蔗糖的重量体积比为20%以下，甘油的重量体积比为20%以下。
[0008]作为优�。鲜鯮2为含有粒径为72.4± 1.5nm且标记了 B型尿钠肽抗体的金纳米颗粒、重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2% PEG20000、重量体积比0.5% BSA和重量体积比5%甘油的，pH7.2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗�：涂固宓闹亓勘任�50:40-60。
[0009]更进一步地，所述基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒还包括起缓冲和稳定作用的试剂Rl，所述试剂Rl为含有重量体积比0.2 % BSA、重量体积比0.1 %的NaN3和重量体积比0.05% Tween20的，pH7.2的磷酸盐缓冲液。在本发明的试剂盒中，发明点主要在试剂R2，试剂Rl也可以使用现有免疫比浊法中检测试剂盒的试剂R1。
[0010]上述试剂R2通过如下方法制备:
[0011]制备金纳米颗粒；
[0012]将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液；
[0013]偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂；
[0014]2800rpm 离心 2 小时；
[0015]离心沉淀用含重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2% PEG20000、重量体积比
0.5%BSA和重量体积比5%甘油，pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬，调整浓度至OD54tlnm为0.2。
[0016]抗体的活性容易受到蛋白酶的分解、高温变性、渗透压等影响，可加入稳定剂来稳定抗体的结构和活性。所述稳定剂可以是蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种；其中，所述蛋白质优选牛血清白蛋白(BSA)或明胶；所述糖可以是单糖、二糖或者多糖，其中，单糖优选甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖；二糖优选乳糖和/或蔗糖；多糖优选海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种；所述无机盐优选齒素碱金属和碱土金属的无机盐，更优选氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。
[0017]本发明的试剂盒中，试剂R2还可以加入促凝剂，以增加抗原抗体反应速率。
[0018]本发明所提供试剂盒中R2可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种缓冲液体系；优选磷酸盐缓冲液体系。
[0019]本发明至少实现了如下有益效果:
[0020]本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，稳定性好的特点，反应时间短，显色反应时间小于30s，平衡时间小于2min，可用于检测血清或血浆中B型尿钠肽含量，适用于临床全自动生化分析仪。本发明试剂盒检测B型尿钠肽的灵敏度可以达到0.2ng/mL，检测线性范围达 0.0 ?16.0ng/mLo
[0021]本发明试剂盒反应后不产生沉淀，便于生化仪的清洗，延长了生化仪的使用寿命。[0022]本发明的试剂盒采用胶体金标记抗体，降低了胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒的制造成本，具有较大的市场竞争力。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1:本发明实施例1-7检测的标准曲线。
[0024]图2:本发明实施例9-15检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0025]以下，将详细说明本发明的具体实施例，以便本领域技术人员能够更详细地理解本发明。
[0026]金纳米颗粒以类似胶体状态存在，又称胶体金。
[0027]本发明所提供基于胶体金免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒中，试剂Rl可以使用现有技术中免疫比浊法的B型尿钠肽检测试剂盒中的试剂R1，即已有的商用品。具体来讲，试剂Rl可以是含有0.2% BSA (w/v)作为稳定剂、0.1 % NaN3 (w/v)作为防腐剂和0.05%Tween20(w/v)作为促凝剂的，50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2),是一种促使脑钠肽抗原位点暴露促进抗原抗体反应的缓存液。
[0028]以下各实施例仅制备试剂R2。
[0029]实施例1
[0030]本实施例试剂R2的制备分为三步，首先制备胶体金溶液，然后将抗体偶联到金纳米颗粒上，最后和缓冲盐、促凝剂和防腐剂等混溶成完整的体系。
[0031]具体过程如下:
[0032]I) 50nm的胶体金的制备按如下步骤:
[0033]在清洗干净的IOOOml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子I枚，加入500ml超纯水；
[0034]加入5ml浓度为1% (w/v)氯金酸，600rpm左右高速搅拌，并加热至溶液沸腾，然后迅速将6ml浓度为1% (w/v)柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中，保持加热和剧烈搅拌lOmin，溶液颜色先变黑色，然后逐渐变紫红色；
[0035]关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢复到原体积 500ml ；
[0036]使用透射电镜观察制得的胶体金颗粒的大�。�1000粒进行统计后直径约为50.4±1.2nm,超滤除掉小分子后备用。
[0037]2)将抗体偶联到金纳米颗粒上，具体过程如下:
[0038]将待标记的抗体移入透析袋内，在IOmM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中透析，以除去抗体溶液中的其他小分子物质；
[0039]透析后的抗体转移到离心管内，15000rpm离心60min，收集上清；
[0040]在紫外-可见分光度计上测量溶液OD26tol吸收值，计算出溶液中抗体的浓度，并用IOmM磷酸盐缓冲液将抗体稀释至lmg/ml(w/v)；
[0041]取10支1.5毫升的离心管，加入I毫升制备好的胶体金溶液；
[0042]用10 %的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH9 ；
[0043]将l、2、4、8、10、20、40、60、80、100ul的抗体分别加到上述10支离心管中，震荡30分钟，此时每支试管中金纳米颗�：涂固宓闹柿勘确直鹞�50:1,50:2,50:4,50:8、50:10、50:20,50:40,50:60、50:80、50:100 ；
[0044]向上述溶液中加入IOOul浓度为10%的NaCl溶液，混匀，静置2h后观察各管，发现在金纳米颗�：涂固宓闹柿勘却锏�50:100时，有颜色改变和少量的沉淀析出，这表明当比例达50:100时,是标记蛋白的最大需求量,金纳米颗�：涂固宓闹柿勘刃∮�50:100无颜色改变和无沉淀析出，；
[0045]根据以上结果，将500ml胶体金溶液加入三角瓶中，边搅拌边用10%的碳酸钾调整溶液的PH值至9 ;
[0046]将小于50ml的抗体加入到上述溶液中，继续搅拌30分钟，在此过程中抗体同纳米颗粒在库仑力和范德华力的作用下，突破胶体颗粒表面的水化层实现接触，在静电力和范德瓦尔德力的相互作用，胶体颗粒同蛋白质分子实现偶联；
[0047]3)试剂R2的配制按如下步骤进行:
[0048]在偶联后的胶体金溶液中加入一定量的BSA作为稳定剂，终浓度为1% (w/v)，搅拌5min使之完全溶解；
[0049]在上述溶液中加入一定量的PEG20000，终浓度为0.2% (w/v)，搅拌10分钟；
[0050]将上述溶液移至离心管中，用2800rpm离心2h，弃上清，保留沉淀；
[0051]用浓度为20%蔗糖作为稳定剂、0.2% PEG20000作为促凝剂、0.5% BSA作为稳定剂、和5%甘油作为稳定剂的IOmmol的磷酸盐缓冲液(pH7.2)重悬沉淀物，调整浓度至OD540nm 为 0.2 ;
[0052]得到R2溶液，分装备用。
[0053]实施例2
[0054]实施例2与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例2制备的胶体金颗粒粒径为55nm。
[0055]制备55nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.6ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为56.2±1.5nm。
[0056]实施例3
[0057]实施例3与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例3制备的胶体金颗粒粒径为62.2nm。
[0058]制备62.2nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.4ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为62.2±1.lnm。
[0059]实施例4
[0060]实施例4与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例4制备的胶体金颗粒粒径为67nm。
[0061]制备67nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.2ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为67.2±1.5nm。
[0062]实施例5
[0063]实施例5与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例5制备的胶体金颗粒粒径为72nm。
[0064]制备72nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.1ml0透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为72.4±1.5nm。
[0065]实施例6
[0066]实施例6与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例6制备的胶体金颗粒粒径为79nm。
[0067]制备79nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为4.9ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为79.l±1.6nm。
[0068]实施例7
[0069]实施例7与实施例1的差别仅在于，通过调整所加入还原剂的量，使得实施例7制备的胶体金颗粒粒径为83nm。
[0070]制备83nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为4.7ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒，直径约为83.5±1.6nm。
[0071]实施例8
[0072]基于胶体金免疫比浊的B型尿钠肽检测试剂盒的临床使用效果测定:
[0073](I)本发明试剂盒的测试条件及参数如下
[0074]a)测定步骤:先加入240ul试剂R1，然后加入3ul样本，37°C孵育5min后加入60ul试剂R2，在540nm波长测量吸光度，三秒后读取第一点数据，反应5分钟后读取另一点，得到吸光度值的差值。
[0075]b)计算方法:6点定标法，以样条函数为计算模式。根据吸光度与参考血清的值做工作曲线，样品含量可根据其吸光度值在工作曲线上算出。
[0076](2)检测标准曲线
[0077]通过本发明的方法，采用日立7180型自动分析仪检测6种不同含量的B型尿钠肽参考品，根据结果做标准曲线，X轴表示B型尿钠肽的含量，Y轴表示吸光度差值。
[0078](3)通过上述的方法对上述实施例中制备的7个试剂盒测定标准曲线，分析最优粒径。结果如下:
[0079]金纳米颗粒大小为50.4nm 时，y = -0.0004x+l.5896，R2 = 0.2993 ；
[0080]金纳米颗粒大小为56.2nm 时，y = -0.0029x+l.5936，R2 = 0.5812 ；
[0081]金纳米颗粒大小为62.2nm 时，y = -0.0676x+l.5744，R2 = 0.9309 ；
[0082]金纳米颗粒大小为67.2nm 时，y = -0.0646x+l.5668，R2 = 0.9729 ；
[0083]金纳米颗粒大小为72.4nm 时，y = -0.0698x+l.5942，R2 = 0.9889 ；
[0084]金纳米颗粒大小为79.1nm 时，y = -0.066χ+1.4889，R2 = 0.9119 ；
[0085]金纳米颗粒大小为83.5nm 时，y = -0.0519x+0.9958，R2 = 0.3743。
[0086](4)对上述结果，进行灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性分析。
[0087]灵敏度定义为测试体系对不同浓度的标准样品测试值的差异，差异越大表明约灵敏，没有差异则表明体系过于稳定，不能引起比浊改变。灵敏度可以通过拟合后的标准曲线的斜率的绝对值表征。
[0088]线性相关系数即相关性方程的R值，表明试验测试结果和拟合曲线的重合度，R值越高，表明线性越好。
[0089]线性范围即测试对应的结果中呈线性关系的区间，线性范围宽有利于测试更大范围浓度的样品。[0090]稳定性是指在该体系中胶体金稳定存在、不发生团聚或沉淀的程度，一般来讲颗粒越大越容易聚沉，引起浊度的改变，颗粒越小越稳定，对待测试剂浓度变化不敏感，即灵敏度差。将待测试剂放置在40°C的环境中，以稳定性时间的时间长短来表示稳定性的好坏，测试时间是12月。
[0091]通过上述四个参数的对比，我们可以从中选出最适合的粒径范围，将各种金颗粒尺寸条件下的结果汇总于表1。
[0092]表1
[0093]
【权利要求】
1.一种B型尿钠肽检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了 B型尿钠肽抗体的金纳米颗粒的溶液，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.lnm，所述金纳米颗�：涂固逯柿勘任�50:20 - 60。
2.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为67.2nm-72.4nm。
3.权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述金纳米颗�：涂固逯柿勘任�50:40-60。
4.权利要求2或3任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为PH值5.0-9.5的溶液。
5.权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为PH值6.0-8.5的溶液。
6.权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油，其中，所述稳定剂为蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种；所述蛋白质为牛血清白蛋白或明胶；所述糖为单糖、二糖或者多糖；所述无机盐为卤素碱金属和碱土金属的无机盐；试剂R2为是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种的组合。
7.权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述促凝剂为重量体积比0.4%以内的PEG20000,所述稳定剂为重量体积比2%以内的牛血清白蛋白，所述蔗糖的重量体积比为20 %以下，所述甘油的重量体积比为20 %以下。
8.权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为含有粒径为72.4± 1.5nm且标记了 B型尿钠肽抗体的金纳米颗粒、重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2% PEG20000、重量体积比0.5% BSA和重量体积比5%甘油，pH7.2的磷酸盐缓冲液，其中，金纳米颗�：涂固宓闹亓勘任�50:40-60。
9.权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试剂R1，所述试剂Rl为含有重量体积比0.2 % BSA、重量体积比0.1 %的NaN3和重量体积比0.05 % Tween20的，pH7.2的磷酸盐缓冲液。
10.制备权利要求1-9任意一项所述试剂盒的方法，其特征在于，所述方法包括: 制备金纳米颗粒； 将抗体偶联到金纳米颗粒，得偶联抗体的纳米金颗粒溶液； 偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂； 2800rpm离心2小时； 离心沉淀用含重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2% PEG20000、重量体积比0.5%BSA和重量体积比5%甘油，pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬，调整浓度至OD54tol为0.2。
【文档编号】G01N33/531GK103995137SQ201410193223
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月8日 优先权日:2014年5月8日
【发明者】侯淑霞, 王万霞 申请人:北京玖佳宜科技有限公司
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