专利名称：一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物检测技术领域，具体涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法定量检测人体血液中降钙素原PCT的试剂盒。
背景技术：
降钙素原(procalcitonin，PCT)为降钙素CT的前体物质，由116个氨基酸组成，分子量13kD，由N末端-降钙素-C末端三部分组成，其结构稳定，不受体内激素水平的影响，在人体内的半衰期为25-30小时，具有良好稳定性。体内产生PCT的主要部位在肝脏，其他如外周血单核细胞、脾、肺或小肠的神经内分泌细胞也是产生PCT的重要场所。内毒素、细胞因子可刺激PCT的释放。PCT作为一种临床标志物，具有独特的优势。PCT在健康人血液中含量极低 0.05ng/ml),0.5ng/ml被认为是全身性感染(脓毒症)诊断的分界值。PCT在脓毒症患者中浓度显著增高，可达1000ng/ml。PCT与炎症的严重程度成正比，在SIRS (系统炎症反应综合征)、脓毒症(败血症)、严重脓毒症(败血症)及脓毒症(败血症)休克病人中PCT浓度有明显差异。PCT可在感染2小时后检测到，在感染后12-24小时达到高峰，在炎症消失后恢复正常。PCT在体内、外稳定性好，不受慢性炎症或自身免疫疾病影响，不受临床用药影响(0KT3除外)，对于系统性细菌感染和脓毒症等具有高度敏感性和特异性。临床研究表明，PCT检测在不同医学领域对多种疾病的诊断和治疗有很高的价值，可应用于I⑶、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科和治疗实验室等众多科室。与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息，涉及下列多种疾病的诊断、治疗项目:对败血症、系统性严重细菌感染(腹膜炎或软组织感染等)做早期诊断；对败血症和SIRS作鉴别诊断、细菌感染和非细菌性炎症反应(自 身免疫性疾病等)的鉴别诊断、细菌感染和病毒感染的鉴别诊断(脑脊膜炎等)、器官移植术后鉴别诊断(细菌感染、病毒感染、排斥反应、真菌感染等)、对不明原因发烧(UFO)诊断及对特殊感染高危患者(重症监护室、器官移植术后、免疫抑制期)监测、脓毒性休克和非脓毒性休克的鉴别诊断。PCT与其他细菌感染的传统诊断指标，如:白细胞计数、血沉、C反应蛋白、细菌培养等比较，可实现早期、快速、更高的灵敏度和特异性；作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标更有助于医生及时准确了解患者的疾病状况，跟进疾病的进程，准确预后以及对治疗方法进行指导，为制定合理的抗生素应用方案提供依据，减少患者不必要的医疗支出和防止抗生素的滥用。目前，检测PCT的方法有很多，不仅可以定性，亦可以定量，常用的方法有:凝胶层析及高效液相色谱分析、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、放射免疫测定(Radioimmunoassay，RIA)、免疫发光法和胶体金层析法。其中，凝胶层析及高效液相色谱分析费时且不易自动化；ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；RIA法既能检测游离PCT，又能检测结合型PCT，也可检测降钙素基因相关前体(Pro-CGRP)，此法可信敏感度为4pg/ml，能检测正常人血清PCT，较双抗夹心法敏感，RIA缺点是所需时间较长，检测结果不稳定，重复性比ELISA差，且存在放射性污染危险。金标方法虽稳定性较好，但灵敏度较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。免疫发光法采用两个抗原特异性抗体分别结合在PCT的不同位点。一株抗体是光标记(不踪物)，而另一株则结合于试管内壁的包被物上。在孵育过程中，抗体与标本中的降钙素原分子结合形成夹心复合物，而光标抗体则结合于试管表面的包被物。反应完成后，清洗，将过剩的示踪物弃去，应用适当的光度计和发光检测试剂测量光信号，计算结合到管壁包被物上的剩余示踪物的量。光信号强度与PCT浓度成正比。应用已知的抗原浓度建立标准曲线，通过它就可求得血清或血浆中未知的PCT浓度。该方法特异性强，敏感性高，但需要昂贵的仪器设备和经验丰富的操作人员，一般多在特定医疗机构使用。免疫比浊法的基本原理是当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。胶乳颗粒增强免疫比浊法(particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，在高分子胶乳微球的表面交联特异性抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。PETIA检测是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定，抗原抗体反应后可直接测定反应液的吸光度值，省去了 ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些，但足以检测到健康人血液中许多标志蛋白的下限值，而且可用于自动化仪器检测。目前市售各种胶乳免疫比浊检测产品检测低限多限于0.1 μ g/ml，而这一检测低限对于降钙素原比浊产品应用于临床是远远不够的，降钙素原0.5ng/ml是全身性感染(脓毒症)诊断的分界值，下呼吸道细菌感染患者PCT浓度可能还低于这一临界值(彡0.25ng/ml且〈0.5ng/ml),因此开发灵敏度更高、特异性更强、稳定性更好、抗干扰能力更强的PCT免疫比浊产品，仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。在免疫检测技术中，采用改善的包被技术，提高检测试剂中载体上连接的与待检标本发生免疫反应的成份的浓度，是提高临床检测产品的灵敏度的重要途径。生物素-亲和素系统是一种在多种免疫检测技术中连接检测试剂中载体和检测抗体(或抗原)的包被系统。生物素分子有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物一活化生物素。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。亲和素主要包括卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素及类亲和素等。后两种因其特异性亲和力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。亲和素(avidin, AV)和链亲和素(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合物,二者均为大分子蛋白。亲和素亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pi为1(Γ10.5，耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用。每个亲和素能结合4个分子的生物素，其亲和常数Ka高达1015mol/L。链亲和素与亲和素具有类似生物学特性，由Streptomyces avidin链霉菌在培养过程中分泌,分子量为65kD，每个SA分子也具有4个可与生物素分子结合的位点，其亲和常数Ka与AV相同，约为抗原抗体间Ka (IO5 10nmol/L)的I万倍以上。SA与AV的ka虽然相同，但在实际应用中其检测灵敏度明显优于AV。AV的高pi及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组织细胞DNA结合时，易产生一定程度的非特异性结合，造成较高的显色背景，而SA较AV在应用中明显克服了这一缺点。生物素-亲和素(链亲和素)系统具有以下显著特点:高特异性、高灵敏度、简易、快速、安全、稳定和适用性。生物素亲和素的结合反应因亲和力而呈现高度专一性。生物素-亲和素系统(BAS)可通过4个结合位点多价桥联生物素化的大分子衍生物和标记物，极大提高检测方法的灵敏度。BAS可与多种标记系统如酶、荧光素、铁蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等联合用于抗原、抗体、蛋白、激素、受体、核酸系统等多种生物学反应体系，也可作为亲合介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。因此，BAS有着极广的研究与应用价值。另外，生物素化的大分子蛋白、核酸、酶等物质不仅保持其活性不受影响，更因生物素化形成许多“触手”的多价制剂，使整个反应体系出现多级放大效应，因而赋予BAS极高的灵敏性。同时，BAS的高度特异性及灵敏性，使其在反应体系应用中用量极微，故成本低廉。生物素-亲和素(链亲和素)系统成为免疫学、分子生物学领域中广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术系统之一。在免疫诊断领域，生物素-亲和素(链亲和素)系统应用于ELISA、免疫组化及放射免疫、金标技术已开发出多种有助于灵敏度提高的检测产品。
发明内容本实用新型的目的在于提供一种定量检测降钙素原PCT的胶乳增强免疫比浊试剂盒。本实用新型包括盒体、Rl试剂瓶、R2试剂瓶和校准品溶液瓶。所述Rl试剂瓶、R2试剂瓶和降钙素原校准品溶液瓶位于盒体内，所述Rl试剂瓶中装有Rl试剂，所述Rl试剂的组成为f 10mg/ml保护 剂、质量体积比为f 5%的反应增强剂、质量体积比为0.03、.2%的防腐剂和2(T200mM缓冲液；所述R2试剂瓶中装有R2试剂，所述R2试剂的组成为riOmg/ml保护剂、质量体积比为0.03、.2%的防腐剂、20 200禮缓冲液和质量体积比为
0.04、.16%的聚苯乙烯胶乳-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物；所述降钙素原校准品溶液瓶装有降钙素原校准品，所述降钙素原校准品的组成为0.5^8mg/ml保护剂、质量体积比为0.03、.2%的防腐剂、2(T200mM缓冲液及0.2-100ng/ml降钙素原重组蛋白。所述Rl试剂中的保护剂可选自牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和明胶。所述Rl试剂中的反应增强剂可选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000。所述Rl试剂中的防腐剂可选自叠氮钠、硫柳汞和Proclin 300。所述Rl试剂中的缓冲液可选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液。所述R2试剂中的保护剂可选自BSA、OVA和明胶。[0015]所述R2试剂中的防腐剂可选自叠氮钠、硫柳汞和Proclin 300。所述R2试剂中的缓冲液可选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液。所述降钙素原校准品溶液中的保护剂为牛血清白蛋白(BSA)。所述降钙素原校准品溶液中的防腐剂可选自叠氮钠和Proclin 300。所述降钙素原校准品溶液中的缓冲液可选自Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液。本实用新型可采用以下方法制备:1、制备Rl试剂将保护剂、反应增强剂和防腐剂溶于缓冲液中，制得Rl试剂。所述保护剂选自BSA、0VA和明胶中的一种或多种，优选BSA ;所述保护剂的浓度为I 10mg/ml,优选 2 5mg/ml ；所述反应增强剂选自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的一种或多种，优选PEG6000 ;所述反应增强剂的质量体积比为1飞％，优选5% ；所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞和Proclin 300中的一种或多种，优选叠氮钠，所述防腐剂的质量体积比为0.03^0.2%，优选0.1% ；所述缓冲液选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种 ，优选Tris-HCl缓冲液或硼酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为2(T200mM，优选5(Tl00mM，所述缓冲液的pH为6 10，优选8 8.5。2、制备R2试剂I)胶乳粒子的活化、洗涤将商品化的聚苯乙烯胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1% ;所述洗涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种；所述聚苯乙烯胶乳颗�？晌然虬被木郾揭蚁┙喝榭帕＃叛◆然木郾揭蚁┙喝榭帕�。羧基化胶乳颗粒经碳化二亚胺(EDAC)活化或氨基化胶乳颗粒经戊二醒活化后再进行链亲和素包被，胶乳颗粒的粒径范围为40-500nm。2)链亲和素包被胶乳颗粒将链亲和素与聚苯乙烯胶乳颗粒交联，得到链亲和素-聚苯乙烯胶乳复合物。所述链亲和素与聚苯乙烯胶乳颗粒交联可采用以下具体方法:①取活化洗涤后的胶乳溶液，加入链亲和素，使链亲和素终浓度为0.f lmg/ml，混匀后，置4 37°C摇床以220rpm转速包被4 18h ；②用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的链亲和素，重复3次；③封闭:将洗涤后的包被链亲和素的胶乳颗粒溶于包含保护剂的R2试剂缓冲液中，得到链亲和素包被的胶乳颗粒溶液，所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.Γ0.3% ；所述保护剂选自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一种或两种，优选牛血清白蛋白，所述保护剂的浓度为l"10mg/ml,优选4、mg/ml ；所述缓冲液选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，优选甘氨酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液的浓度为20 200禮，优选50 100禮，pH为7 9，优选8 8.5。3)抗人降钙素原抗体的生物素化将生物素与抗人降钙素原抗体混合孵育，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清透析去除游离生物素。生物素化反应中所述生物素选用商品化的已活化产品；所述PCT抗体为市售商品化抗人PCT抗体，选自多克隆抗体和单克隆抗体中的一种，优选多克隆抗体。所述降钙素原抗体可为鼠源、兔源或羊源抗体，优选羊源抗体；所述抗人降钙素原抗体与生物素的摩尔比为I1: 100，优选1:10 ;所述孵育优选在室温下进行；孵育时间为l_4h，优选Ih ；所述透析为在0_4°C下置于PBS缓冲液中透析过夜。4)生物素化降钙素原抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接在步骤2)中所得的链亲和素包被的胶乳颗粒溶液中加入步骤3)中所得的生物素化抗人降钙素原抗体，混匀后孵育，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物；所述孵育温度为37°C ;所述孵育时间为0.5 2h。5)清洗 将步骤4)中形成的胶乳颗粒-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物溶液离心，弃上清，重复清洗3次；将末次沉淀溶于含保护剂和防腐剂的R2试剂缓冲液中，使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04、.16%。所述保护剂选自牛血清白蛋白和卵清蛋白中的一种或两种，优选牛血清白蛋白，所述保护剂的浓度为l"10mg/ml,优选4、mg/ml ；所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞和Proclin 300中的一种或多种，优选叠氮钠，所述防腐剂的质量体积比为0.03^0.2%，优选0.1% ；所述缓冲液选自硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种或多种，优选甘氨酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液的浓度为20 200禮，优选5(Tl00mM，pH为7 9，优选8 8.5。3、制备降钙素原校准品溶液选用商品化人降钙素原重组蛋白，用类似人血清基质的溶液进行系列稀释，制备不同浓度的校准品。以进口的罗氏公司降钙素原校准品为原始标准，采用其降钙素原试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次，求出均值，得到降钙素原校准品的浓度。所述类似人血清基质的溶液是用保护剂、防腐剂和缓冲液配制而成；所述保护剂为牛血清白蛋白(BSA),浓度为0.5 8mg/ml,优选l 5mg/ml ；所述降钙素原校准品溶液中的防腐剂可选自叠氮钠和Proclin 300中的一种或两种，所述防腐剂的质量体积比为0.03、.2%，优选0.1% ；所述降钙素原校准品溶液中的缓冲液可选自Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种，优选Tris-HCl或PBS缓冲液。以下给出采用所述检测降钙素原的免疫增强比浊试剂盒在生化分析仪上进行降钙素原检测的具体条件:测定波长:600nm；[0063]测定温度:37°C ;分析方法:2点终点法；样品量/Rl试剂/R2试剂(胶乳-链亲和素-生物素-抗人PCT抗体复合物悬液):20 μ 1/240 μ 1/80 μ I。本实用新型采用生物素化的降钙素原抗体致敏链亲和素包被的聚苯乙烯胶乳颗粒，通过生物素-链亲和素系统和胶乳增强方式，放大了抗原抗体反应，克服了普通免疫比浊法灵敏度不高的不足，实现了降钙素原在生化分析仪和散射比浊分析仪上自动化检测血液中降钙素原含量的目标。本实用新型实现了以下技术优势:I)在胶乳增强免疫比浊原理基础上进一步采用了链亲和素-生物素放大系统，大大提高了比浊试剂的检测灵敏度，最低检测限可达0.2ng/ml，满足了临床应用的需求。2)可在散射比浊分析仪上实现多样本类型灵活快速定量检测。市售降钙素原PCT检测多采用血清或血浆进行检测，不能满足临床快速检测需求，本实用新型试剂盒当在散射比浊分析仪上使用时可采用的样·本类型包括全血、血清或血浆，可在临床多科室应用。市售PCT检测约需半小时左右的时间，而本实用新型试剂盒从样本采集到出具检测结果最快只需2-3分钟，为患者争取了更多的宝贵时间，可对患者病情进行动态检测。3)本实用新型试剂盒与进口试剂盒对同一样本的PCT含量检测结果经统计分析，结果相关性好，无显著差异，检测结果准确可靠，在临床上可以替代进口产品使用，大幅降低检测成本。
图1为本实用新型实施例的结构组成主视图示意图(1:盒体；2:R1试剂瓶；3:R2试剂瓶；4:降钙素原校准品溶液瓶)；图2为本实用新型实施例的结构组成俯视图示意图(1:盒体；2:R1试剂瓶；3:R2试剂瓶；4:降钙素原校准品溶液瓶)；图3为本实用新型实施例的“浓度-吸光度差值”校准曲线；图4为本实用新型实施例的线性范围相关性；图5为本实用新型降钙素原试剂盒实施例与罗氏PCT试剂盒检测结果的相关性比较。
具体实施方式
参见图1，本实用新型所述检测降钙素原的免疫增强比浊试剂盒实施例包括盒体
1、R1试剂瓶2、R2试剂瓶3和降钙素原校准品溶液瓶4，所述Rl试剂瓶2和R2试剂瓶3及降钙素原校准品溶液瓶4位于盒体I内，所述Rl试剂瓶中装有Rl试剂，所述Rl试剂的组成为f 10mg/ml保护剂、质量体积比为f 5%的反应增强剂、质量体积比为0.03、.2%的防腐剂和2(T200mM缓冲液；所述R2试剂瓶中装有R2试剂(聚苯乙烯胶乳-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物悬液)，所述R2试剂的组成为f 10mg/ml保护剂、质量体积比为0.03、.2%的防腐剂、2(T200mM缓冲液和质量体积比为0.04、.16%的聚苯乙烯胶乳-链亲和素-生物素-抗人降钙素原抗体复合物；所述降钙素原校准品溶液瓶中装有降钙素原校准品，所述降钙素原校准品的组成为0.5^8mg/ml保护剂、质量体积比为0.03、.2%的防腐剂、2(T200mM缓冲液及0.2-100ng/ml降钙素原重组蛋白。一、降钙素原免疫增强比浊试剂盒的制备1、降钙素原Rl试剂配制三羟甲基氨基甲烷(Tris)浓度为0.2M，用盐酸调节pH为8.0。再加入BSA、PEG6000 及叠氮钠，使终浓度为:BSA 5mg/ml、PEG60005% (w/v)、叠氮钠(λ 1% (w/v)。2、降钙素原R2试剂配制I)胶乳粒子的活化、洗涤取10.1%羧基化聚苯乙烯胶乳颗粒溶液(Bangs Laboratories, Inc.,粒径为200nm) 100 μ 1，向胶乳溶液中加入6mg/ml EDAC溶液1.68ml，置于37°C往复式摇床中反应
0.5h。12000rpm离心30min，弃上清，加入50mM pH 6.5MES缓冲液洗涤三次，将沉淀分散于50mM pH 6.5MES缓冲液中，使胶乳颗粒浓度为1% (w/v)。2)链亲和素包被胶乳颗粒取Iml活化洗涤后的羧基化聚苯乙烯胶乳溶液，加入2mg/ml链亲和素溶液500μ 1，混匀，置37°C往复式摇床以220rpm转速包被16h，以12500rpm离心20min，弃上清；将沉淀物溶于0.1MpH 7.4PBS缓冲液，混匀，以12500rpm离心20min，弃上清，而后重复洗涤两次去除未与胶乳粒子结合的链亲和素；将链亲和素包被的胶乳颗粒沉淀物溶于含4mg/mlBSA的20mM pH 8.0甘氨酸缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为0.3% (w/v)。3)生物素化降钙素原抗体的制备用0.1M pH 9.5碳酸盐缓冲液将6mg/ml羊抗人PCT多克隆抗体(上海叶民生物技术有限公司)稀释成2mg/ml的抗体溶液，每毫升抗体溶液中加入二甲基甲酰胺溶解的BNHS(5mg/ml) 10 μ I，混匀，于室温(22°C )反应Ih，离心，除去其中少量的沉淀物，将上清装入透析袋中，在4°C环境中置于0.1M pH 7.4PBS缓冲液透析24h。4)生物素化降钙素原抗体与链亲和素包被胶乳颗粒的连接在Iml步骤2)制备的链亲和素包被胶乳颗粒溶液中加入400 μ I步骤3)制备的生物素化抗体溶液，混匀，置37°C摇床lh，形成胶乳颗粒-链亲和素-生物素-PCT多克隆抗体连接复合物。12500rpm速度离心20min，弃上清，将沉淀物溶于0.1M pH 7.4PBS缓冲液，混匀，12500rpm离心20min，弃上清，而后重复洗涤两次；将末次沉淀溶解于含4mg/ml BSA及0.1%叠氮钠的50mM pH 8.0甘氨酸缓冲液中。3、PCT校准品配制将市售人降钙素原重组蛋白溶于类似人血清基质的溶液(NaCl 0.8%, BSA0.2%,NaN30.4%,Tris-HCl pH 8.0)中，制成不同浓度的校准品。以进口的罗氏公司降钙素原校准品为原始标准，采用其降钙素原试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次，求出均值，得到降钙素原校准品的浓度:0.2，1,3,10，30，100ng/ml。二、降钙素原免疫增强比浊试剂盒的检测方法1、生化分析仪检测以日立7020操作为例:测定波长为600nm，分别取不同浓度的校准品溶液(20 μ I )，加入降钙素原Rl试剂(240 4 1)，混匀，371:孵育5分钟后，加入降钙素原R2试剂(80 μ 1)，混匀，37°C孵育I分钟后，读取各管吸光度值A1,反应4飞分钟后，读取各管吸光度值A2，计算吸光度差值AA=A2 — A1，每管重复测定3次，以各校准管3次测得的吸光度差值Λ A的平均值为纵坐标，对应的校准品浓度为横坐标，绘制“浓度-吸光度差值”校准曲线(见图3)。取待测血清或血浆样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可计算出待测样本中降钙素原PCT的含量。如果血清或血浆中降钙素原的浓度超出校准曲线范围，需对样本进行稀释后再检测以保证检测结果的准确性。本试剂盒不仅适用于日立7020，还适用于其它品牌和型号的半自动、全自动生化分析仪，具体参数可根据仪器进行调整。2、NORMAN系列散射比浊分析仪检测将全血35 μ I (血清或血浆20 μ I)加入样品反应杯中，然后加入试剂R1240 μ 1，混匀，等反应杯中的 散射光强度稳定后，加入试剂R280y 1，混匀，在1-2分钟之内，测定散射光强度的变化差值AAJf △ A代入校准曲线，即可计算出待测样本中降钙素原的含量。三、降钙素原免疫增强比浊试剂盒的分析性能评估1、线性范围用接近线性范围上限的降钙素原高浓度样本(100.20ng/ml)，用生理盐水将其按1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64稀释，共配制成6个稀释浓度(xi)的溶液，用所述生化分析仪检测方法测定各稀释样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果平均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(I)计算线性回归的相关系数r，结果显示回归方程为y=1.0086x-0.1464，相关系数r=0.9998,表
明本实用新型试剂盒在0.2 ng/ml - 100 WpI线性范」两内相关性较好(见图4)。
……⑴2、灵敏度(最低检测限)以5%牛血清白蛋白溶液为空白样本，按所述生化分析仪检测方法重复测定20次，以空白均值加两倍标准差报告最低检测限，结果显示本实用新型试剂盒的最低检测限为
0.2ng/ml。3、重复性和准确度用AUDIT公司标示值分别为0.67ng/ml和51.4ng/ml的降钙素原校准品作为样本，按所述生化分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值CF)和标准差(S)，以s/:px 100%if算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为
2.86%和1.38% ；以(1-1/标示值)X100%计算相对偏差进行准确度考察，其相对偏差分别为1.49% 和 0.79%ο表I降钙素原试剂盒的重复性和准确度考察
权利要求1.一种定量检测降钙素原PCT的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于包括盒体、Rl试剂瓶、R2试剂瓶和降钙素原校 准品溶液瓶，所述Rl试剂瓶、R2试剂瓶和降钙素原校准品溶液瓶置于所述盒体内。
专利摘要本实用新型涉及一种采用胶乳增强免疫比浊法定量检测人体血液中降钙素原PCT的试剂盒，该试剂盒包括盒体和位于盒体内的R1试剂瓶、R2试剂瓶及校准品溶液瓶。R1试剂瓶中装有R1试剂保护剂1~10mg/ml、反应增强剂1~5%、防腐剂0.03~0.2%和缓冲液20~200mM；R2试剂瓶装有R2试剂保护剂1~10mg/ml、防腐剂0.03~0.2%、缓冲液20~200mM和聚苯乙烯胶乳-链亲和素-生物素-抗人PCT抗体复合物0.04~0.16%；PCT校准品溶液瓶装有PCT校准品保护剂0.5~8mg/ml、防腐剂0.03~0.2%、缓冲液20~200mM及PCT重组蛋白0.2-100ng/ml。
文档编号G01N33/74GK202916286SQ20122038267
公开日2013年5月1日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者何仕钊 申请人:南京诺尔曼生物技术有限公司
专业数控铣床产品供应商
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