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专利名称：检测慢性乙肝肝纤维化血清n-糖组峰标记的方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物医药领域，涉及肝纤维化血清N-糖组峰标记，具体涉及检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法及其用途。
背景技术：
长期以来，肝穿刺活检一直是明确肝病病因、评价肝脏炎症坏死及纤维化程度的金标准，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有重要临床意义，但创伤性、取样误差、观察者自身及观察者间偏倚等不足给临床应用造成许多不便。目前临床诊疗中迫切需要寻找便捷的非创伤性替代指标。近年来，以血清指标组合建立肝纤维化诊断模型成为世界性的研 究热点。在一系列肝纤维化非创伤性诊断模型中，较具代表性的包括采用慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者建模的Fibrotest、Forns指数、APRI指数和IfepascoreL等。目前针对慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝纤维化诊断模型仍研究较少，主要有上海市肝纤维化课题协作组(SLFG)所提出的Zeng模型M和我国香港的Hui模型。然而上述研究结果在我国慢性HBV感染患者中尚未得到有效验证和临床应用。目前国内外采用肝活组织检查+病理学诊断结果作为肝纤维化分期诊断的金标准，属于有创伤性的诊断方法，因此其临床应用受局限。研究报道，血清学检测方法渐成为临床非创伤性肝纤维化诊断的有效方法之一，具有较好的应用前景。目前血清肝纤维化诊断峰标记研究方法主要包括蛋白和多肽组学、糖组学、miCToRNA芯片等技术。类似蛋白组学，“糖组学”指对糖组的全面分析研究，其对象主要针对糖蛋白。糖蛋白由多肽和糖通过糖肽键连接而成，根据连接方式的不同，可分为N-糖苷键和0-糖苷键等。已知肝细胞是除浆细胞外血清中糖蛋白的主要来源，肝脏还具有清除体内异常糖基化蛋白的功能，因此，肝脏病变可以引起血清糖蛋白谱的变化，但聚糖结构上高度的复杂性等因素给研究带来很多困难。2001年Callewaert等提出了基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DSA-FACE)技术，使对样本的N-糖链进行系统而快速的分析成为可能。该技术已被证实可用于肝硬化和肝细胞癌的诊断。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种检测慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法，尤其涉及一种非创伤性检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法及其用途。本发明采用基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DSA-FACE)技术检测慢性HBV感染患者的N-糖组图谱，分析其与肝纤维化的相关性并评价其诊断价值；所述的血清N-糖组峰标记，作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义。具体而言，本发明的检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法，其特征在于，采用DSA-FACE技术检测慢性HBV感染患者血清样本测得具有峰值的糖组图谱，将峰值量化后，采用内参校正后的数据，获得非创伤性慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记。本发明方法包括下述步骤
1)采集检测血清样本
入选条件有乙型肝炎或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和(或)HBVDNA仍为阳性
者；
以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，其中，so、SI期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组；
2)寡糖的释放
2u I血清加入含有2iil缓冲液(10mmol/L NH4HC03)和3yl水的PCR反应管中，95°C 加热 5min 后 4°C放置 15min，加入 I PNGase F (2. 2U/U 1，pH8. 3,3. 33% NP40) 37°C孵育3h，4°C冷浴后加入100 ill水，标记为D管；
3)寡糖的标记
从D管吸取6 ii I溶液加入一新的PCR管中，开盖60°C烘干60min,加入2 y I标记溶液(20mmol/L 的 APTS 与 lmol/L 的 NaBH3CN 之比为 1:1)，37。。孵育 16h，加 200 水终止反应，标记为L管；
4)去唾液酸
从L管取2 ill溶液加入一新的P C R管中，加入3iU 0. 25mU去唾液酸酶在37°C孵育过夜，加160 u I水振荡混匀，标记为DE管；
5)片段分析
取DE管10 Ul溶液用ABI3130测序仪进行片段分析，数据经GeneScan软件分析。6)将测得的具有峰值的糖组图谱峰值量化，采用内参校正后的数据，获得慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记。本发明中，检测的血清样本选自2002年至2007年筛选行肝活检的慢性HBV感染患者，入选条件按中华医学会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》所规定的慢性HBV感染诊断标准，有乙型肝炎或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和(或)HBVDNA仍为阳性者；排除条件艾滋病毒或慢性丙肝病毒感染，饮酒量大于30g每日，代谢性或其它类型的肝损，患者已接受肝病治疗，肝活检组织不符合标准。本发明中，符合标准的血清样本病例为不同肝纤维化分期(Scheuer分期S0-S4期，每组平均10例病例)的慢性乙型肝炎肝纤维化病例，以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0、SI期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组；
本发明中，所有检测的血清样本遵循Callewaert等制定的DSA-FACE技术规范，数据经GeneScan软件分析。本发明中，所述的N-糖组峰标记血清标本可采用动静脉、外周采血，或体液采集，漏出液或渗出液采集方式使用。本发明中，每份血清标本均可测得具有10个峰左右的糖组图谱，将峰值量化，最终采用内参校正后的数据。本发明中，按患者为轻度纤维化组(S0-1)和明显纤维化组(S2-4)，两组血清N-糖组峰标记图谱峰各峰的均值比较，结果显示，纤维化组第1、2、3、4、10峰的峰值升高，第5、8、11峰的峰值降低，差异具统计学意义(如表I所示)。本发明中检测个体的慢性乙型肝炎肝纤维化病例血清样本的测得具有峰值的糖组图谱，以此预测该个体的慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，进一步对预后判断、治疗选择及疗效评估提供参考依据。在一个优选例中，利用N-糖组检测结果预测肝纤维化程度，参与本实验受试者工作曲线(ROC)可以比较各峰在不同分组情况下的诊断价值
当用于预测是否有明显肝纤维化(S2-4)时，ROC曲线下面积(AUROC)较高的峰依次为第8峰0. 648，第10峰0. 640，第I峰0. 624，第2峰0. 609 (如图I所示)。用于预测是否有重度肝纤维化(S3-4)时，AUROC较高的峰依次为第2峰0.702，第10峰0. 687，第I峰0. 682，第8峰0. 672 (如图2所示)。用于预测是否有早期肝硬化(S4)时，AUROC较高的峰依次为第2峰0. 740，第8 峰0. 705，第I峰0. 689，第10峰0. 653 (如图3所示)。本发明所述的血清N-糖组峰标记可显著提高慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断的特异性及敏感性，作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义；
本发明提供了血清N-糖组峰标记相关修饰指标mRNA、MircoRNA ;所述的血清N-糖组峰标记相关修饰指标，可用于制备成不同的检验检测用品，如制成诊断试剂盒、诊断试纸、诊断试剂，和治疗及预后评估相关试剂盒、试纸、试剂等，并可预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，可用于预后判断、治疗选择及疗效评估。


图I是本发明中糖组图谱各峰预测是否有明显肝纤维化(S2-4)时的ROC曲线，其中，AUROC等于I. 0为理想的诊断试验，AUROC等于或小于0. 5为无效的诊断试验；Log(peak2/peak8)为 0. 675,第 8 峰为 0. 648,第 10 峰为 0. 640,第 I 峰为 0. 624,第 2 峰为0. 609 o图2是本发明中糖组图谱各峰预测是否有重度肝纤维化(S3-4)时的ROC曲线，其中，Log(peak2/peak8)为 0. 736，第 2 峰为 0. 702，第 10 峰为 0. 687，第 I 峰为 0. 682，第 8 峰为 0. 672。图3是本发明中糖组图谱各峰预测是否有早期肝硬化(S4)时的ROC曲线，其中，Log(peak2/peak8)为 0. 754，第 2 峰为 0. 740，第 8 峰为 0. 705，第 I 峰为 0. 689，第 10 峰为0. 653 ;在第1、2、8、10各峰的两两组合中，以第2和第8峰组合的指标Log(peak2/peak8)具有最优的曲线下面积(AUR0C)，分别为0. 675,0. 736,0. 754 ;表明Log (peak2/peak8)可有效的预测有无重度纤维化或肝硬化，但其对轻度纤维化的区分能力较弱。图4是本发明中纤维化各分期下Log(peak2/peak8)值分布箱图。
具体实施例方式实施例I采用DSA-FACE技术检测慢性HBV感染患者血清标本，制得具有峰值的N-糖组图谱
采集2002年至2007年筛选行肝活检的符合标准的慢性HBV感染患者血清标本146例，入选条件按中华医学会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》所规定的慢性HBV感染诊断标准，有乙型肝炎或HBsAg阳性史超过6个月，现HBsAg和(或)HBVDNA仍为阳性者；
排除条件艾滋病毒或慢性丙肝病毒感染，饮酒量大于30g每日，代谢性或其它类型的肝损，患者已接受肝病治疗，肝活检组织不符合标准；
以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，将S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组，留取血清样本，按下述步骤检测，获得慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记图谱
1)寡糖的释放
2u I血清加入含有2iil缓冲液(10mmol/L NH4HC03)和3yl水的PCR反应管中，95°C加热 5min 后 4°C放置 15min，加入 I PNGase F (2. 2U/U 1，pH8. 3,3. 33% NP40) 37°C孵 育3h，4°C冷浴后加入100 ill水，标记为D管；
2)寡糖的标记
从D管吸取6 ii I溶液加入一新的PCR管中，开盖60°C烘干60min,加入2 y I标记溶液(20mmol/L 的 APTS 与 lmol/L 的 NaBH3CN 之比为 1:1)，37。。孵育 16h，加 200 U I 水终止反应，标记为L管；
3)去唾液酸
从L管取2 ill溶液加入一新的P C R管中，加入3iU 0. 25mU去唾液酸酶在37°C孵育过夜，加160 u I水振荡混匀，标记为DE管；
4)片段分析
取DE管10 Ul溶液用ABI3130测序仪进行片段分析，数据经GeneScan软件分析。5)将测得的具有峰值的糖组图谱峰值量化，采用内参校正后的数据。上述的血清样本采用患者血清中的N-糖组图谱检测遵循Callewaert等制定的DSA-FACE技术规范，数据经GeneScan软件分析；每份血清标本均可测得具有10个峰左右的糖组图谱，将峰值量化，最终采用内参校正后的数据，得到非创伤性慢性乙型肝炎肝纤维化诊断血清N-糖组峰标记。
实施例2利用N-糖组检测结果预测肝纤维化程度
按实施例I的血清样本检测方法，获得受试者血清的具有峰值的糖组图谱，参与本实验受试者工作曲线(ROC)可比较各峰在不同分组情况下的诊断价值，预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度或预测是否有早期肝硬化；
当用于预测是否有明显肝纤维化(S2-4)时，ROC曲线下面积(AUROC)较高的峰依次为第8峰为0. 648，第10峰为0. 640，第I峰为0. 624，第2峰为0. 609 (如图I所示)；
用于预测是否有重度肝纤维化(S3-4)时，AUROC较高的峰依次为第2峰为0. 702，第10峰为0. 687，第I峰为0. 682，第8峰为0. 672 (如图2所示)；
用于预测是否有早期肝硬化(S4)时，AUROC较高的峰依次为第2峰为0. 740，第8峰为0. 705，第I峰为0. 689，第10峰为0. 653 (如图3所示)。实验结果表明，本发明所述的血清N-糖组峰标记可显著提高慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断的特异性及敏感性，作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义；所述的血清N-糖组峰标记可米用动静脉、夕卜周米血、体液米集，漏出液或渗出液米集
方式使用。本发明进一步比较了各N-糖组峰与纤维化各个分期间的关系。结果显示，第1、2、
8、10峰均能较好的区分不同程度的肝纤维化，在有无明显纤维化(S2-4)、有无重度纤维化
(S3-4)、有无早期肝硬化(S4)这三种分组下的组间差异均具有统计学意义。
表I是N-糖组图谱各峰在轻度纤维化和明显纤维化组间的差异。表2是N-糖组图谱各峰与纤维化各个分期间的关系。表I
权利要求
1.检测慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法，其特征在于，采用DSA-FACE技术检测慢性HBV感染患者血清样本测得具有峰值的糖组图谱，将峰值量化后，采用内参校正后的数据，获得非创伤性慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记。
2.按权利要求I的方法，其特征在于，其包括下述步骤 1)采集检测血清样本， 2)寡糖的释放， 血清加入含有NH4HC03缓冲液和水的PCR反应管中，95°C加热后4°C放置，加入PNGaseF37°C孵育，4°C冷浴后加水，标记为D管； 3)寡糖的标记， 从D管吸取溶液加入新的PCR管中，开盖60°C烘干，加入标记溶液，37°C孵育，加水终止反应，标记为L管； 4)去唾液酸， 从L管取溶液加入新的P C R管中，加入去唾液酸酶在37°C孵育过夜，加水振荡混匀，标记为DE管； 5)片段分析 取DE管溶液用ABI3130测序仪进行片段分析，数据经GeneScan软件分析； 6)将测得的具有峰值的糖组图谱峰值量化，采用内参校正后的数据，获得慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记及其相关修饰指标mRNA、MircoRNA。
3.按权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤2)的PNGaseF中2. 2U/y I, pH8. 3，3.33% NP40。
4.按权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤3)的标记溶液中，20mmol/L的APTS与lmol/L 的 NaBH3CN 比为 1:1。
5.按权利要求2的方法，其特征在于，所述步骤6)的糖组图谱峰值包括早期纤维化组与晚期纤维化组的4种血清N-糖组峰值。
6.按权利要求5的方法，其特征在于，所述慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记，以肝活检病理学诊断明确纤维化程度，其中S0、S1期列为早期纤维化组，S3、S4期列为晚期纤维化组。
7.权利要求I的检测慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法在制备预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度制剂中的用途。
8.权利要求I的检测慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法在制备慢性乙型肝炎肝纤维化诊断试剂盒或诊断试剂中的用途。
9.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的N-糖组峰标记相关指标mRNA、MircoRNA在制备慢性乙型肝炎肝纤维化诊断试剂盒或试纸或试剂中的用途。
全文摘要
本发明属生物医药领域，涉及肝纤维化血清N-糖组峰标记，具体涉及检测慢性乙肝肝纤维化血清N-糖组峰标记的方法及其用途。本发明采用DSA-FACE技术检测慢性HBV感染患者血清样本测得具有峰值的糖组图谱，将峰值量化后，采用内参校正后的数据，获得非创伤性慢性乙型肝炎肝纤维化血清N-糖组峰标记。本发明的方法可显著提高慢性乙型肝炎肝纤维化非创伤性诊断的特异性及敏感性，作为一种非创伤性替代指标，能高效预测慢性乙型肝炎肝纤维化的程度，对预后判断、治疗选择及疗效评估等具有现实的临床意义。
文档编号G01N33/66GK102707062SQ201110074008
公开日2012年10月3日 申请日期2011年3月27日 优先权日2011年3月27日
发明者周锟, 徐铭益, 曲颖, 陆伦根, 高春芳 申请人:上海交通大学附属第一人民医院