专利名称：通过离心力和/或毛细力精确输送和操作流体的方法和装置的制作方法
背景技术：
本发明通常涉及微观流体领域，应用于各种生物和化学组合物的分析。更具体地，本发明提供了利用自装置中通道的表面性能产生的离心力和毛细力进行分析的方法和装置。
为了确定身体流体或其他流体中诸如葡萄糖、清蛋白或细菌的分析物的存在(或不存在)或其含量，通常用试剂装置帮助技术人员完成分析。这种试剂装置含有一个或多个试剂区，技术人员能施加试样流体于这些区上，然后将结果与标准比较。例如，将试剂条浸在试样流体中，试剂条变色，将颜色的强度或类型与标准参照比色图表比较。
当试样含有复杂的组成时，如许多身体流体那样，这种装置就很难制备。不得不将需确认或测量的成分在能通过试剂检测之前转化成合适形态，以提供特征颜色。试样流体中的其他成分会妨碍预期反应，必须将它们从试样中分离，或将它们的作用中和。有时试剂成分相互间不相容。在其他情况下，必须将试样进行预处理，以浓缩感兴趣的成分。这些问题以及其他问题使得很难在单个装置中提供具体化验需要的试剂成分。包含许多装置实例的现有技术意图是克服这些问题，并提供分析流体试样中一种或多种特定成分的能力。
一种不同方法是进行制备和分析试样的一系列步骤，但不要求技术人员这样做。实现这一点的一个途径是通过制备自动完成期望工序的装置，但保持试剂隔离，能避免所讨论的问题。对于小试样，这种分析可采用微观流体技术。
微观流体装置很�。悄芙邮帐匝�、选择需要量的试样、稀释或洗涤试样、将试样分离成各成分，并与试样或其成分进行反应。如果技术人员需要在实验室中以大量试样进行这些步骤，一般必须手动完成必要的步骤，或者，如果是自动完成，就需要迁移试样及其成分并引入试剂、清洗液、稀释剂等的设备。然而，生物化验的试样一般很�。虼瞬僮鞑街璞匦朐诤苄〉纳璞干辖�。将实验室设备缩小到约0.02-10.0μL的试样所需尺寸是不可行的，并采用了不同方法。通过在塑料或其他合适基材中产生这种特征，并用另一层覆盖所得基材，制成以微米尺寸的通道连接的小容器。该容器可包含在施加覆盖层前加入容器中的试剂。也可根据需要对通道进行处理，使其可被待测试样润湿或不润湿。当通道内壁湿润时，试样、试样成分或其他流体可通过毛细作用在这种通道内移动，或当流体不打湿通道内壁时避免它们移动。这样，毛细管尺寸的通道既能使流体移动，也能防止流体移动，就像存在阀门一样。通过这种微米尺寸的通道移动流体的另一个方法是通过离心力，离心力克服了不能润湿内壁的阻力。这一简单描述提供了微观流体装置的概貌。许多专利中提供了具体应用，以下将提到部分专利。
美国专利6,143,248中提供了装配用于各种类型分析的容器和通道的某些原理的展开讨论，这些原理的其他应用实例可在美国专利6,063,589中找到。这两个专利中描述的微观流体装置往往布置成盘式，并在能提供所需要的不同程度离心力的设备上旋转，使流体从某一容器移动到另一个容器。一般而言，将试样置于紧靠旋转中心的位置，并逐渐提高旋转速度，使试样或试样的一部分移动到离旋转中心较远的容器中。该专利描述了如何隔离规定量的试样进行分析，如何使试样与其他流体混和用于清洗或其他用途，以及如何将试样分离成各种成分。
其他专利描述了用电极通过电渗透移动流体，例如美国专利4,908,112。Caliper Technology Corporation拥有关于微观流体装置方面的代表性专利，其中流体通过电动推进移动。代表性的实例是美国专利5,942,443、5,965,001和5,976,336。
在美国专利5,141,868中，用毛细力将试样送入腔中，试样的测量可通过位于该试样腔中的电极进行。
本发明人也涉及到需要提供用于免疫测定法和核酸化验，例如细菌病原体、蛋白质、药物、代谢物和细胞的检测的试剂装置。它们的目的是，当对于给定的分析过程而言需要不相容成分，并需要在能进行分析前对试样进行预处理时，克服所涉及的问题。这种问题的解决方法与前述情况不同，下文将详细描述。
发明概述本发明的一般特征在于采用微观流体技术的分析装置，从而提供以改进方式进行的小生物试样分析方法。本发明的装置还使迄今采用传统分析条不可能进行的分析成为可能。
本发明的分析装置可在这里称为“芯片”，它通常是一小片薄塑料，其中挖出了接收试样液体的微升尺寸的井，这些井通过宽度约10-500μm、深度至少5μm的毛细管通道相互连接。通道可用公知的方法，优选通过在内壁的等离子聚合反应，变成疏水或亲水。疏水性或亲水性程度根据待测试试样流体的性能按需要进行调节。在某些实施方案中，调节疏水表面避免沉积物附着在内壁上。在其他实施方案中，调节亲水表面使液体基本上完全除去。
公开了两种类型的毛细管栓，一种具有疏水内壁的窄栓和一种具有亲水内壁的宽栓。在芯片基础部分中形成期望的特征，将试剂置于合适的井中，然后施加顶部部分，从而制成芯片。
在某些实施方案中，本发明的分析芯片包括与放置试样流体的井连接的限定段的亲水毛细管。试样流体通过毛细作用填充该段，从而提供固定体积的试样，以随后输送到其他井进行期望的分析。在某些实施方案中，限定的毛细管段呈现各端开口通到大气的U形环状。在其他实施方案中，限定的毛细管段是线性的。
通过采用由毛细管通道连接的多个井，可提供能以预定顺序进行多次分开处理的试样流体，从而避免传统测试条很难克服的许多问题。例如，试样流体可在其与合适试剂接触前进行清洗或预处理。可对单一试样在顺次反应中采用一种以上试剂。另外，可在发生反应后从试样中除去液体，以提高在已反应试样上进行的测量精度。以下将参照附图和所作描述说明本发明典型装置的这些结构和其他可能结构。
附图简述
图1是本发明的一种分析装置。
图2是本发明的第二种分析装置。
图3a和3b表示疏水和亲水毛细管栓。
图4a表示本发明的多用途分析装置。
图4b到4j表示采用图4a的多用途装置能够提供的代表性结构。
图5表示最多可分析十个试样的分析装置。
优选实施方案描述微通道中的流动采用本发明的装置一般使用比本领域先前的研究者提出的更小的通道。特别是，本发明中采用的通道具有约10-500μm，优选的约20-100μm的宽度，而其他人一般采用大一个数量级的通道。这种通道的最小尺寸相信是约5μm，因为较小的通道会有效地过滤出试样中待分析的成分。通道深度一般将小于宽度。申请人发现，除初始流动外，在本发明优选范围内的通道能通过毛细力，而不用离心力移动液体试样。例如，可通过经处理变成疏试样流体的毛细管壁来阻止移动。毛细管的阻力可通过施加离心力克服，然后在液体开始流动后取消离心力。作为选择，如果毛细管壁经处理变得亲试样流体，流体将通过毛细力而不用离心力或其他力流动。如果这种通道中包括亲水栓，就通过施加克服亲水栓的影响的力建立流动。结果能根据所进行的分析的需要，使液体能计量并从装置的一个区移动到另一个区。
已经推导出一个数学模型，它涉及离心力、流体的物性、流体的表面张力、毛细管壁的表面能、毛细管尺寸和待分析流体中所含颗粒的表面能。其能预测流体通过毛细管的流量，以及期望的疏水性或亲水性程度。可从这些因素的关系得出以下一般原理。
对于任何给定的通道，液体与通道表面的相互作用可以对液体的移动产生或不产生显著影响。当通道的表面积与容积之比大时，即横截面积小时，液体与通道壁间的相互作用变得很明显。这种情况，在涉及标称直径小于约200μm的通道时，且与液体试样和内壁的表面能有关的毛细管力起主导作用时，尤其如此。当内壁被液体湿润时，液体就在通道中移动无需施加外力。相反，当内壁未被液体湿润时，液体就试图从通道排出。这些一般趋势可用于导致液体沿通道移动，或使其在与具有不同截面积的另一个通道的连接处停止移动。如果液体停止流动，就通过施加诸如离心力的力移动液体。作为选择，可采用包括空气压、真空、电渗等的其他手段，这些手段能在具有不同横截面积或表面能的通道之间的连接处诱导产生所需要的压力变化。本发明的一个特征是液体移动的通道比迄今已采用的通道小。这样导致能获得较大的毛细力，并能仅通过毛细管力移动液体，而不需要外力，除非必须克服短期的毛细管堵塞。然而，较小的通道或许固有地对生物试样或试剂中颗粒的阻碍敏感。因此，通道壁的表面能根据为了用在例如血液、尿等待测试样流体上而有的要求来调节。该特点使分析装置的设计更灵活。该装置可比现有技术中使用的盘更�。⒛苡酶〉氖匝僮�。其他优点将从该装置和实施例的描述中变得更明显。
本发明的分析装置本发明的分析装置可称为“芯片”。它们一般是小而扁平的，通常约1-2平方英寸(25-50mm2)。试样体积将很小。例如，它们可以仅容纳约0.3-1.5μL，从而使试样流体的井较宽和浅，使试样很容易看见并通过合适设备进行测量。相互连接的毛细管通道将具有10-500μm，优选20-100μm的宽度范围，其形状将由通道的形成方法确定。通道深度将至少为5μm。当用毛细管段限定预定量的试样时，该毛细管可比试剂井间的通道大。
虽然有诸如注射成型、激光烧蚀、金刚石研磨或浮雕等几种方法可形成毛细管和试样井，但是优选采用注射成型，以降低芯片造价。一般在芯片的基础部分上切割产生期望的试样井和毛细管网络，然后在基础上覆盖顶部部分从而制成芯片。
芯片往往使用一次就丢弃。因此芯片应尽可能由廉价材料制成，并与分析试剂和试样相容。在大部分例子中，芯片将由诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚氨酯等塑料制成，作为选择，它们可由硅酸盐、玻璃、石蜡或金属制成。
毛细管通道将调节为具有疏水或亲水性能，该性能由液体试样或试剂在固体表面形成的接触角确定。一般来说，如果接触角小于90度，就认为该表面亲水，如果接触角较大就是疏水的。可将表面处理成疏水或亲水的。优选的是在通道表面进行等离子体诱导聚合反应。本发明的分析装置还可用诸如涂覆亲水或疏水材料、接枝或电晕处理等用于控制毛细管壁表面能的其他方法制成。在本发明中，优选的是根据所用试样流体调节毛细管壁的表面能，即亲水性或疏水性程度。例如，为了防止在疏水通道的内壁上沉积，或为了保证通道中不残留液体。
液体通过毛细管的运动由毛细管栓阻止，正如其名称所暗示的，毛细管栓防止液体沿毛细管流动。如果毛细管通道是亲水的并促进液体流动，就可采用疏水毛细管栓，即具有疏水内壁的较小的通道。液体不能通过疏水栓，因为小尺寸和不能润湿的内壁之组合导致阻止液体进入的表面张力。作为选择，如果毛细管是疏水的，在试样井和毛细管之间就不需要栓。试样井中的液体被阻止进入毛细管，直至施加例如离心力的足够的力，使液体克服对立的表面张力，并通过疏水通道。本发明的特点是仅在液体开始流动时需要离心力。一旦疏水通道内壁与液体完全接触，对立的力就减小，因为液体的存在降低了与疏水表面相关的能障。因此，液体不再需要离心力来流动。尽管不需要，在某些情况下，当液体沿毛细管通道流动时，或许方便的是，继续施加离心力，以有助于快速分析。
当毛细管通道亲水时，试样液体(假定是水性的)将在毛细管中自然流动，而不需要额外的力。如果需要毛细管栓，一种选择是使用较窄的疏水片段，它能起到如上所述的栓作用。也可以用亲水栓，即使是通过亲水的毛细管也可以。这种栓比毛细管宽，因此液体的表面张力就产生了促进液体流动的较小的力。如果毛细管与较宽的栓之间的宽度变化足够，液体就会在毛细管栓的入口处停止流动。现已发现，液体最后将沿栓的亲水内壁蠕动，但通过适当设计形状，这种运动将被充分延缓，使栓有效，即使内壁是素水的也如此。一种优选的亲水栓示于图3b，以及前文描述的疏水栓(3a)。
图1表示体现本发明各方面的测试装置。将例如尿的试样置于试剂井R1中。在该装置中，所有通道都经等离子体聚合处理而呈疏水性，使液体试样在不施加外力的情况下不会经通道移动到R2。当该装置置于平台上，并以适当速度旋转，以克服疏水力时，试样液体就能移动到R2中，试样可在R2中反应或另外制备，用于后来的分析。在填充R2期间，R3也接收液体，使加入R1的试样可多于R2能接收的量。R3可提供部分试样的第二次反应，或仅提供多余试样的溢流。作为选择，R3能根据需要传递预处理的部分试样到R2。由于R2与R4之间的通道也是疏水的，必须施加额外的离心力移动液体试样。通过施加离心力，R5可用自R4的已反应试样充满，或能用于接收分析物已在R4中反应并留在R4中后剩余的液体。如果R4中反应产物的测量会另外受到液体中材料的影响，这一步骤能提供改进的测量能力。在图1的设计中，未提供毛细管栓，因为毛细管通道是疏水的。然而，如果通道是亲水的，在R1、R2和R4的出口处就要提供毛细管栓，从而防止液体沿毛细管通道移动，直到施加足够的离心力来克服栓为止，足够离心力克服栓之后毛细力将驱使试样液体流动，而不需要另外的离心力。就是说，毛细力本身就足以移动试样液体。应该注意，每个井R1、R3、R4和R5都有一个朝大气压的通道开口(V1、V2、V3和V4)，使得试样液体充满这些井时，井中的气体能排出。
图2表示结合了计量毛细管段和亲水栓的第二种测试装置。计量段保证分配精确量的液体试样，以提高分析精确度。将液体试样加入试样井R1，该试样通过毛细力(通道是亲水的)从R1流出，并充满一般为U形的计量环L。毛细管的计量环或段的形状不必具有所示的形状。也可采用直线或线性的毛细管段代替。环的端部通过V1和V2与环境相通。试样液体移动到远至亲水栓S1(如果需要，也可以是疏水栓)。当该装置置于平台上，并以足以克服亲水栓阻力的速度旋转时，试样环L中所含液体就通过栓S1，并借助毛细力移动到试剂井R2中。液体流出试样环时空气就进入，从而隔断空气入口点V1和V2处的液体，V1和V2限定了液体柱的长度，从而限定了输送到试剂井R2中的试样的量。试样环下面是另一个试剂井R3，它可用于与试样液体反应，或制备用于后续分析的试样，下文将进一步描述。因为内壁是亲水的，液体将借助毛细力从R2移动到R3。如果毛细管壁是疏水的，液体将不会流入R3中，直到施加离心力来克服相反的力为止。
图3a和3b表示可用于本发明的分析装置中的疏水栓(a)和亲水栓(b)。在图3a中，井R1充满液体，该液体沿连接的亲水毛细管扩充，直到液体遇到窄的疏水毛细管通道而不再移动，该毛细管提供的表面张力防止了液体进入栓。如果沿毛细管栓方向从井R1施加作用力，就能克服相反的力，使R1中的液体能转移到井R2中。同样，在图3b中，所示的毛细管栓是亲水栓，该栓防止R1中的液体流入井R2中。此时的毛细管栓不窄，并具有亲水内壁。通道宽度的增加和栓的形状避免表面张力引起液体流出连接的毛细管。然而，如上所述，现已发现液体将沿内壁逐步蠕动，并以一段足够时间克服阻止作用。对于大多数分析用途而言，栓按其目的起作用，因为试样分析所需时间比液体克服由液体的自然移动引起的阻止所需时间短。
图4a表示本发明的多用途分析芯片的平面图。芯片中形成排气通道V1-V7、井1-4和6-9、毛细管栓5，以及U型试样环L，虚线表示安装顶盖前在芯片基材中能形成的可能的毛细管通道。显而易见，有许多可能的构造。一般而言，可将试样液体加入井R2中，使试样环能通过毛细力充满，并通过毛细管栓5分配到井6-8中，在其中试样可与试剂接触，并测量试剂的反应。井1和3可用于保存额外的试样液体，或作为选择，保存用于预处理试样的另一种液体。井4和9通常起到保存废液体的腔的作用，或就井4来说，作为试样流体从井2的溢流井或作为装清洗液的容器。每个井可根据所进行分析的要求具有合适的排气通道。某些可能的结构示于图4b到4i。
在图4b到4j的每个图中，仅完成了某些潜在的毛细管通道，其他毛细管和井未使用。图4a中所示的排气连线未示出，以使图更清晰，但应该明白，如果所进行的分析需要，就可提供这些通道。
在图4b中，将试样液体加入井2中，当施加足够的离心力(作为选择，可采用克服流动阻力的其他手段)克服流动阻力时，试样就通过疏水毛细管流入井4中。同样，通过增加离心力克服连接的疏水毛细管产生的初始阻力，试样可依次流过井6、8和9。井4、6、8和9可根据期望的分析方法的要求含有试样。
图4c提供了通过亲水栓5从环L分配计量数量的试样液体的能力，亲水栓的阻力通过施加合适量的离心力克服。作为选择，额外的试样可导入井4中，其中试样在导入井6前用试剂处理。通过增加离心力克服疏水毛细管的阻力，试样可从井6依次输送到井8和9。根据具体的分析，井6、8和9可用于使试样中的分子与试剂井中的结合伙伴之间发生结合反应，例如抗体与抗原、核苷酸与核苷酸，或主体与客体的反应。此外，结合对可偶合成检测标记或标志。
这些井还可用于用固定到颗�：捅砻嫔系慕岷匣锇椴痘�(捕集)试剂井中的抗体、核苷酸或抗原；用于清洗或反应去掉杂质、游离物料或干扰；或用于加入试剂，以校正或控制检测方法。
其中一个井一般通过该井中包括的检测方法产生和/或检测信号。检测方法的实例包括电化学检测、光谱检测、磁检测，以及借助酶、指示剂或染料的反应的检测。
图4d提供了将计量数量的试样流体从井2通过计量环L和亲水栓5依次输送到井6和8中的方法。在将试样输送到井8中进一步反应前，可将试样在井6中浓缩，或根据免疫测定和核酸测定的需要进行分离。在上述程序变型中，能将液体从井8输送到其中一个排气通道中。
图4e与图4d类似，只是用井6和7代替井6和8。该程序变型也说明，为了从井6输送液体，线性排列并不是必须的。
图4f与图4d和4e类似，其中试样依次通过井6、7和8进行输送。
图4g是一种变型，其中计量的试样输送到井7，而不是图4c到4e中所示的井6。
图4h说明了一种芯片，其中将试样流体加入井6，并通过施加足够的力克服疏水通道的阻力而输送到井8。根据所进行分析的需要，将试剂或缓冲剂从井3和4加入到井8中。废液被输送到井9，这样可有利于提高井8中结果的读取精度。
图4i说明了一种芯片，其中将流体试样引入井1，并输送到井2，在那里，如上所述，试样在进入计量环之前先进行预处理。其次，通过施加离心力克服亲水栓5，将计量数量的预处理试样分配到井6中。正如前面的实施例，通过克服连接疏水毛细管的阻力，试样能输送到其他井中，在这种情况下是井9中，进行进一步处理。
图4j说明了一种装置，其中试样加入井3而不是井2。井2接收清洗液，并通过克服连接通道中的疏水力输送到井4。通过克服亲水栓5的阻力，井6接收来自U形段的计量数量的试样。在井6中可进行反应，反应后的试样输送到井8进一步反应，然后用清洗液清洗，所述清洗液是从井4输送到井8的，再到井9。然后读取井8中显现的颜色。
图5表示本发明芯片的一种变型，其中将单一液体试样引入试样井S中，试样在毛细管力驱动下通过亲水毛细管从试样井S流入十个上述类型的试样环L1-L10中。应该明白的是，根据芯片尺寸，可提供任何数量来代替十个试样环。图5中未示出排气通道，但应该明白它们是存在的。液体在每个环中被亲水栓阻挡。然后，当施加力以克服毛细管栓时，液体能流入井中进行分析。如图4所示，可产生许多可能的毛细管通道排布。
在许多应用中，正如以下实施例中描述的那样，测量试剂与试样反应显现出的颜色。同样可行的是用位于芯片中的小井中的电极，对试样进行电测量。这种分析的实例包括基于安培、阻抗、电势检测方法的电化学信号变换器。实例包括氧化和还原化学的检测和结合作用的检测。
实施例1用于检测血红蛋白的试剂的制备方法包括首先制备以下组合物的涂料水溶液和涂料乙醇溶液成分浓度(mM)涂料水溶液甘油-2-磷酸酯 200氯化铁 5.1N(2-羟乙基)亚乙基二胺三乙酸 5.1三异丙醇胺 250十二烷基硫酸钠[SDS] 28用1N HCl调节pH值到6.4涂料乙醇溶液四甲基联苯胺[TMB] 34.7二异丙基苯二过氧化氢[DBDH] 65.04-甲基喹啉 61.34-(4-二乙基氨基苯基偶氮)苯磺酸 0.694-(2-羟基-(7，9-二磺酸钠)-1-萘基偶氮)苯 0.55然后将涂料水溶液施加到滤纸(来自Whatman Ltd的3MM级)上，并在90℃干燥湿滤纸15分钟。然后用乙醇涂料溶液浸透干燥的试剂，并在90℃下再干燥15分钟。
用于检测清蛋白的试剂的制备方法包括首先制备以下组合物的涂料水溶液和涂料甲苯溶液成分浓度(mM)允许范围涂料水溶液水溶剂 1000mL -酒石酸阳离子敏感缓冲剂 93.8g(625mM)50-750mM喹哪啶红 背景染料 8.6mg(20mM) 10-30mM涂料甲苯溶液甲苯 溶剂 1000mL -DIDNTB 缓冲剂0.61g(0.6mM)0.2-0.8mMLutonal M40聚合物增强剂 1.0g0.5-4g/L
DIDNTB＝5’，5”-二硝基-3’，3”-二碘代-3，4，5，6-四溴苯酚磺酞用涂料溶液浸透滤纸，这里用204和237 Ahlstrom滤纸，用水溶液第一次浸透后，在95℃下干燥滤纸5分钟，用甲苯溶液第二次浸透后，在85℃下干燥5分钟。
用以下配方制备测试溶液。称取蛋白质并加入MAS溶液源中。MAS溶液是设计成模仿尿的平均性能和极端性能的磷酸盐缓冲剂。天然尿的物理性能示于下表中表A
向10mL量瓶中的5mL MAS 1溶液中加入20.0mg Bovine清蛋白(Sigma Chemical Co.，A7906)，制备200mg/dL的清蛋白溶液(2g/L＝2mg/mL)，然后回荡并静止放置，直到清蛋白完全水解，然后用MAS 1将容积调节到10.0mL。
向1L量瓶中的1L MAS 1溶液中加入10mg冻干的Bovine血红蛋白(Sigma Chemical Co.，H2500)，制备1.0mg/dL的血红蛋白溶液(100mg/mL)。
切下面积1mm2的清蛋白和血红蛋白检测试剂，并置于图1所示的以分离的试剂井形式的微观流体设计中，在用2mg/L清蛋白或0.1mg/dL Hb测试后观察反应。用数字处理设备(松下5100系列数码相机)测量660nm处的反射率。读出向装置中加入含有尿且不含清蛋白或血红蛋白的流体后一分钟时获得的反射率，它表示条的反应性。
在井R1(图1的芯片设计)中存储20μl试样，并转移到井R2，然后，通过使用Applied Motion Pruducts，Watsonville，CA.提供的513540可编程步进马达驱动器以500rpm离心，以克服连接R1到R2和R2到R4的毛细管中的疏水力，而转移到R4。在与5μl试样接触前或接触后1分钟，测量井R4中涂有试剂的滤纸的颜色。分析后通过1000rpm的离心力将试样液体转移到井R5中。
对每个平行试验取2张图像一张图像取自注入前的滤纸，一张图像取自注入后培育1分钟的滤纸。进行四个平行试验。还以与传统测试条类似的方式将试剂纸接在条上进行比较。
表BR4中血红蛋白试剂上的结果
井R4中的血红蛋白试剂对血红蛋白从空白到1mg血红蛋白/dL表现出清晰的响应，与条的情况相同。试剂滤纸显现均匀的颜色。R4中的血红蛋白试剂是可溶的，并发现能将它们清洗出腔R5。重复试验，不同的是将血红蛋白试剂置于井R2而不是R4中。
对每个平行试验取2张图像一张图像取自注入前的滤纸，一张图像取自注入后培育1分钟的滤纸。进行四个平行试验。
表CR2中血红蛋白试剂上的结果
注入试样液体前的芯片在井R2中具有橙色未反应垫料，在R3或R4中无色。注入血红蛋白试样后，R2中表现出血红蛋白指示剂染料的蓝色。试验最后通过提高旋转速度到1200rpm将液体试样输送到井R4中。
在又一个试验中，将清蛋白试剂滤纸置于图1设计的井R4中并重复测试。
对每个平行测定试验取2张图像一张图像取自注入前的滤纸，一张图像取自注入后培育1分钟的滤纸。进行四个平行试验。
表DR4中血红蛋白试剂上的结果
注入试样液体前的芯片在井R4中具有未反应垫料，在R3或R2或R5中无色。注入清蛋白试样后，R4中表现出清蛋白指示剂染料的蓝色。试验最后通过提高旋转速度到1200rpm将液体试样输送到井R5中。
有能取代以上实施例中的方法的各种试剂方法，并用于本发明的芯片。试剂的变化使所产生信号的强度与临床试样中测量的分析物的浓度成正比。这些试剂包含指示剂染料、金属、酶、聚合物、抗体和各种其他化学品，其干燥在载体上。常用的载体是具有不同试样摄取和输送性能的纸、膜或聚合物。可将它们引入本发明芯片中的试剂井中，以克服用试剂条分析带来的问题。
可仅用试剂条的一个试剂区包含产生分析物的颜色响应需要的所有化学品。干试剂条中发生的典型化学反应可归纳为染料结合的、酶催的、免疫的、核苷酸、氧化或还原化学反应。在某些情况下，在一个试剂层最多发生5种竞争性的和定时的化学反应，检测尿血的方法是单一试剂中发生的多重化学反应的一个实例。分析物检测反应基于血红蛋白的类似过氧化物酶的活性，其通过二异丙基苯二过氧化氢催化指示剂3，3’、5，5’-四甲基联苯胺的氧化。在同一垫料中，基于铁-HETDA配合物的催化活性，该配合物通过二异丙基苯二过氧化氢催化抗坏血酸的氧化，发生第二反应除去抗坏血酸干扰。
常用多重试剂层测量一种分析物。将化学试剂体系置于不同试剂层中，并为诸如色谱法和过滤等反应分离步骤作准备。全血葡萄糖条常用多重试剂区捕获干扰生色层的完整的红血球。免疫-色谱法条用不同试剂区中发生的化学反应构成。检测人体绒膜促进腺激素(hCG)或清蛋白是具有四个试剂区的条的一个实例应用。条顶部的第一试剂用于取样并与下一个试剂区重叠，为将母体试样(尿)输送到第一试剂区创造条件。然后将已处理的试样跨过第三试剂迁移，其中将反应物固定以发展颜色。这种迁移通过攫取过量试样的第四试剂区驱动。在第三试剂区中发生色谱法反应，第三试剂区称为测试或捕获区，一般是硝基纤维素膜。在第一和第二层中，分析物特有的抗体与试样中的分析物反应，并按色谱方式输送到硝基纤维素膜。抗体被束缚在着色胶乳颗粒上作为标记。如果试样含有分析物，它就会与被标记的抗体反应。在捕集区中，当存在分析物时，第二抗体就固定在捕获颗粒的带中。形成着色的测试线。第二试剂带也固定在捕获区中，使控制线与颗粒反应，形成颜色。当测试体系适当工作时，即使患者试样中不存在hCG，也往往会在控制线上形成颜色。能把这种多步骤分析变成具有试剂井的本发明的芯片，试剂井备有合适的试剂以进行期望的分析。
上述清蛋白分析也能通过其他方法进行。诸如人血清清蛋白(HSA)、γ-球蛋白(IgG)和本琼氏蛋白(BJP)等蛋白质可用各种方法测定。最简单的方法是依赖于染料束缚蛋白质时的颜色变化的染料束缚方法。已采用了许多染料，实例是2-(4-羟苯基偶氮)苯甲酸[HAPA]、溴甲酚绿、溴甲酚蓝、溴苯酚蓝、四溴苯酚蓝、邻苯三酚红和双(3’，3”-二碘代-4’，4”-二羟基-5’，5”-二硝基苯基)-3，4，5，6-四溴苯酚磺酞染料(DIDNTB)。在各种基材上的电泳已用于从其他蛋白质分离清蛋白，然后将清蛋白部分染色，随后清洗和进行光密度分析。此处所用染料的实例是丽春红、结晶紫、酰胺黑。对于低浓度蛋白质，即在＜10mg/L清蛋白范围内的蛋白质，常用诸如免疫浊度测定法的免疫测定法。
能采用分离的步骤，其中分析物在第一井中与试剂反应，然后使已反应试剂流到第二井中进一步反应。此外试剂能再悬浮在第一井中，并移动到第二井进行反应。分析物或试剂可捕集在第一或第二井中，并测定游离试剂与束缚试剂之比。
游离与束缚试剂的测定对于多区域免疫测定法和核酸测定法特别有用。有各种类型的多区域免疫测定法适合本装置并作为允许的实例。在适应免疫色谱测定法的情况下，将试剂滤纸置于分开的井中，而且不必物理接触，因为色谱力不工作。免疫测定法或DNA测定法可发展成测定诸如格兰氏阴性类(例如E.Coli，Entereobacter，Pseudomonas，Klebsiella)和格兰氏阳性类(例如StaphylococcusAureus，Entereococc)等细菌。可发展免疫测定法用于诸如清蛋白、血红蛋白、肌肉球蛋白、α-1-微球蛋白、免疫球蛋白、酶、glyoproteins、蛋白酶抑制剂和cytokines等蛋白质和肽的完全板条。参见例如Greenquist在US 4806311中的具有标记试剂浓度区的多区分析元件(Multizone Analytical Element Having Labeled ReagentConcentration Zone)，1989年2月21日；Liotta在US 4446232中的采用含有束缚抗原的两区设备的酶免疫测定法(Enzyme Immunoassaywith Two-Zoned Device Having Bound Antigens)，1984年5月1日。
实施例2干燥试剂的再悬浮实验制备将5μl苯酚红溶液(0.1M PBS盐水中的0.1％w/w，pH7.0)分配在图1的芯片设计的井R3中，并在40℃的真空炉中干燥1小时。然后在试验前用粘合剂盖覆盖芯片。将MAS-1缓冲溶液试样置于井R1中，并如上所述通过在500rpm下的离心力输送到井R3中。
在干燥后苯酚红分散并覆盖在整个井R3上。在用MAS-1缓冲剂填充R3后，苯酚红几乎立即被再悬浮并能从R3除去。
将10μl苯酚红储备溶液分配在3mm滤片(OB滤器)上，并如上所述在烘箱中干燥。干燥后将滤片置于R2中，然后用MAS-1缓冲剂充注R1，并将液体输送到井R2。
芯片在用液体试样充注前不着色。将苯酚红分散并覆盖整个井。用MAS-1缓冲剂充注R3后，苯酚红几乎立即被再悬�。⒛芡耆渌偷骄甊5。
干燥的试剂如以上实施例那样被再溶解的潜在应用包括●过滤●沉降分析●细胞溶解●细胞分级(质量差异)离心分离●固相试样分析物(例如微珠)的富集(浓缩)能用于提高灵敏度。富集的微珠能通过连续离心作用分离。
●可用多路输送(例如平行和/或顺序排列的各种试剂腔的计量)得到多通道，每个通道产生一个确定的离散结果。多路输送可通过在入口处以流体连通的、兼顾大量计量毛细管环的毛细管系统，或计量通道和/或连接到每个计量毛细管环的毛细管栓的系统来实现。
●在芯片设计中可采用与诸如磁力等的辅助力的结合。用作试剂或试样捕集的载体的诸如磁性珠等颗粒构成例如分析物或干扰物质。通过诸如密度(类似裂解分馏)等物理性能分离颗粒。
实施例3图4j说明了能用于分析尿的芯片。井6和8容纳分析中所用的试剂，而井3用于接收试样流体，井2用于接收清洗液。井3与亲水试样环L连接，井4通过疏水毛细管通道与井2连接。
井6容纳含有保护和缓冲成分的纤维垫料，特别是与着蓝色的胶乳颗粒结合的对于分析物(待检测试样中的成分)的抗体，以及对于已用荧光黄标记的分析物的不同抗体。在该实施例中，分析物是人体绒膜促进腺激素(hCG)。它与井6中的两种抗体都反应。
井8容纳已不可逆地结合了对于荧光黄的抗体的硝基纤维素垫料。该抗体将与从井6输送到井8中的荧光黄反应。
将尿试样加入井3，并充满排气口V3与V4之间的亲水毛细管通道段，并停留在亲水栓5处，从而确定了预定量的待分析试样。井2充满诸如缓冲的0.6％食盐水的清洗液，以去除未与来自井8的hCG分析物结合的着蓝色的胶乳颗粒。芯片以适当速度，一般是约500rpm，旋转，使规定量的试样通过栓5流入井6中。同时清洗液从井2流入井4中。
经过足够的培育时间后，井6中的垫料中的成分再悬�。街挚固宥加胧匝械姆治鑫锝岷�。然后使芯片以更高的rpm(约1000rpm)旋转，将液体通过连接井6和井8的疏水通道从井6输送到井8。
再经过一定的培育时间，使荧光黄标记的分析物抗体能与针对井8中所含荧光素的抗体结合。由于分析物(hCG)与两种抗体都结合，从而使着蓝色的胶乳也与井8中的纤维垫料结合。此时井8中存在指示分析物数量的蓝色，但为了提高精度，要清洗该井。
以更高rpm(约2000rpm)第三次旋转芯片，将清洗液从井4输送到井8，然后到井9。同时将所有未结合的液体从井8输送到井9。该步骤后，井8中的颜色能更容易通过实施例1中所用照相机装置测量。颜色与试样中分析物的浓度成正比，即，与结合到井6中分析物上着蓝色的胶乳颗粒的数量成正比。
权利要求
1.一种分配和分析均匀液体试样的装置，包括(a)接收部分所述液体的试样井；(b)与(a)中所述的试样井连通、通过毛细作用接收来自所述试样井的所述液体的毛细管通道，所述通道包括限定所述均匀液体试样的体积的段，所述段布置在与大气连通的两个交叉通道之间，所述段与输送毛细管通道连接，用于将所述均匀试样从所述段输送到第一试剂井中；和(c)布置在所述输送通道中的毛细管栓，用于防止所述均匀试样向所述第一试剂井输送。
2.权利要求1的装置，其中(b)中的毛细管通道具有接触所述试样液体的内壁，其对所述试样液体为亲水性的。
3.权利要求1的装置，其中所述毛细管栓是亲水栓。
4.权利要求1的装置，其中所述毛细管栓是疏水栓。
5.权利要求1的装置，还包含通过毛细管通道与所述第一试剂井以液体连通的至少一个第二试剂井。
6.权利要求5的装置，还包含通过毛细管通道与至少一个权利要求5的所述第二试剂井以液体连通的至少一个第三试剂井。
7.权利要求1的装置，其中所述第一试剂井含有适合与所述均匀液体试样中所含成分反应的试剂。
8.权利要求7的装置，其中所述第一试剂井含有适合与所述均匀液体试样中所含成分反应、从而产生指示所述液体试样中的所述成分含量的响应的试剂。
9.权利要求7的装置，其中所述第一试剂井含有适合与所述均匀液体试样中所含成分反应，从而减小所述成分对需检测的第二种成分的干扰的试剂。
10.权利要求7的装置，其中所述第一试剂井含有适合预处理所述液体试样的试剂。
11.权利要求8的装置，其中所述第一试剂井含有适合与所述液体试样中的成分反应，从而制备反应了的成分的试剂。
12.权利要求11的装置，其中所述反应了的成分在第二试剂井中进一步反应，以产生指示所述液体试样中的所述成分的含量的响应。
13.权利要求2的装置，其中(b)中所述的毛细管通道的内壁具有调节到能基本上完全除去所述液体试样的亲水表面。
14.权利要求5的装置，其中在所述第一和第二试剂井之间连通的毛细管通道具有对所述试样流体疏水的内壁。
15.权利要求14的装置，其中所述毛细管通道内壁具有调节到防止沉积物附着在所述内壁上的疏水表面。
16.权利要求1的装置，还包括布置在所述第一试剂井中的电极，用于测量所述试样流体性能。
17.权利要求5的装置，还包括布置在至少一个所述第二试剂井中的电极，用于测量所述试样流体性能。
18.权利要求6的装置，还包括布置在至少一个所述第三试剂井中的电极，用于测量所述试样流体性能。
19.一种分析生物流体试样的装置，包括(a)接收部分所述试样流体的试样井，和与所述试样井以流体连通的至少一个第二井；(b)连接所述试样井和所述至少第二井的毛细管通道，所述毛细管适合于防止所述试样流体从所述试样井流入所述至少第二井中。
20.权利要求19的装置，其中所述毛细管通道具有对所述流体试样足够疏水的内壁，使所述试样不能进入所述通道中，直到施加能克服由所述试样流体的表面张力产生的反向力的力为止。
21.权利要求19的装置，其中所述毛细管通道具有对所述流体试样足够亲水的内壁，使所述流体试样能通过毛细力流入所述至少第二井中，并通过亲水毛细管栓防止所述试样液体流动，直到施加能克服由所述亲水栓提供的反向力的力为止。
22.权利要求20的装置，其中所述毛细管通道的内壁具有调节到避免沉积物附着在所述内壁上的疏水表面。
23.权利要求21的装置，其中所述毛细管通道的内壁具有调节到使所述试样流体基本上完全通过的亲水表面。
24.权利要求19的装置，其中所述毛细管通道具有约10-500μm的宽度。
25.权利要求24的装置，其中所述毛细管通道具有至少5μm的深度。
26.一种分析生物流体试样的多用途装置，包括(a)接收所述试样的至少一个试样井；(b)与至少一个(a)中所述的试样井连通的、用于通过毛细作用接收来自所述试样井的所述试样的毛细管通道，所述通道包括限定所述流体试样的均匀体积的段，所述段布置在与大气连通的两个交叉通道之间，所述段通过输送毛细管通道连接到所述第一试剂井，用于将所述均匀试样从所述段输送到第一试剂井中；和(c)布置在所述输送通道中的毛细管栓，用于防止所述均匀试样向所述第一试剂井输送；(d)非必需的至少一个通过毛细管通道与所述第一试剂井以流体连通的第二试剂井；(e)非必需的至少一个通过毛细管通道与至少一个所述第二试剂井以流体连通的第三试剂井；(f)非必需的至少一个接收部分(a)中所述试样的额外的井；(g)使试剂井(b)、(d)、(e)和(f)向大气排气的充足的排气通道，其中(b)、(d)和(e)中所述试剂井、所述排气通道和(c)中的所述毛细管栓布置在扁平盘上，使得根据分析所述生物流体试样的需要，在所述盘中可形成毛细管通道，使所述井相互连接，并连接到所述排气通道。
27.权利要求26的多用途装置，其中(a)中所述试样井与(f)中所述额外的井之一流体连通，且(f)中所述额外的井与(g)中所述排气通道之一排气连通，并与至少一个(b)、(d)和(e)中所述试剂井流体连通，所述至少一个(b)、(d)和(e)中的试剂井与(g)中所述排气通道之一排气连通。
28.权利要求26的多用途装置，其中至少一个(d)中所述第二试剂井与(b)中所述第一试剂井流体连通，而所述至少一个(d)中所述试剂井与第二个(g)中所述排气通道排气连通。
29.权利要求28的多用途装置，其中所述至少一个(d)中所述第二试剂井与至少一个(e)中所述试剂井流体连通，而(e)中所述第三额外井与(g)中排气通道排气连通。
30.权利要求26的多用途装置，其中一个或多个(b)、(e)和(f)中的所述试剂井含有处理所述试样的试剂。
31.权利要求26的多用途装置，其中所述毛细管栓是亲水栓。
32.权利要求26的多用途装置，其中所述毛细管栓是疏水栓。
33.权利要求26的多用途装置，其中(b)中所述毛细管段的内壁具有对所述试样亲水的表面。
34.权利要求26的多用途装置，其中(b)中所述输送通道和(d)和(e)中所述通道的内壁具有对所述试样疏水的表面。
35.权利要求33的多用途装置，其中(b)中所述毛细管段具有调节到使所述试样基本上完全通过的亲水内壁。
36.权利要求34的多用途装置，其中(b)、(d)和(e)中所述通道具有调节到避免沉积物附着在所述内壁上的疏水内壁。
37.权利要求26的多用途装置，其中所述毛细管通道具有约10-500μm的宽度和至少5μm的深度。
全文摘要
在采用离心力和毛细力的装置中分析微升级液体试样，特别是生物试样。该试样通过在小而扁平的芯片中排列的一个或多个试样井，借助相互连接的毛细管通道移动。该通道可以是疏水或亲水的，可包括疏水或亲水毛细管栓。
文档编号G01N37/00GK1638871SQ03804643
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月17日 优先权日2002年2月26日
发明者M·J·普吉亚, G·布兰肯斯泰因, R·-P·彼得斯, H·巴托斯 申请人:拜尔健康护理有限责任公司
专业数控铣床产品供应商
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