专利名称：用于病毒抗原的直接荧光免疫测定的制作方法
用于病毒抗原的直接荧光免疫测定
技术领域：
本发明涉及处理用于直接病毒检测的液体形式的生物学样品。例如，样品可源于呼吸系统。检测方法可使用直接结合病毒抗原由此允许鉴定以及检测的抗体。在一些实例中，抗体是标记的单克隆抗体。方法可与包含能区分多个荧光信号的算法的装置集成。
背景技术：
病毒感染(即，例如，流感A和B病毒)负责儿童和成年中的每年疾病流行。由流感A和B病毒导致的病在临床上无法区别，和可同时循环，Van Voris et al.，〃 Influenza viruses “ p.267-297. In :R.B.Belshe (ed.), Textbook Of Human Virology.PSG Publishing Co. ,Littleton, Mass. (1984)。抗病毒剂化学预防及治疗目前非常有限(即， 例如，流感A病毒-特异性制剂金刚烷胺和金刚乙胺)。因此，流感病毒的快速检测必要于辅助患者管理和起始有效控制措施。目前知道的制备用于直接荧光抗体(DFA)染色的样本的方法昂贵，艰辛和耗时。 通常，使自样本的一滴细胞悬浮液在玻璃载玻片上干燥，及用沉淀或变性固定剂例如丙酮， 甲醇和乙醇固定。这些化合物通过作用减小蛋白分子的溶解度和通过三级疏水相互作用分裂蛋白。固定之后，将样品用荧光抗体染色，涉及几步骤(i)标记；(ii)洗涤；及(iii)粘附盖玻片。最终，在荧光显微镜下检查样品。显微镜检查过程中遇到DFA技术中的另一问题，因为抗体制备物通�：型ㄓ玫牡鞍赘慈荆缫廖乃估叮愿ㄖㄏ赴�。此复染也染色可使鉴定细胞变难的非-细胞物质。而且，如果细胞不是完全干，它们可在加工步骤期间损失，导致判断病毒存在不足数的细胞。当前DFA方法也需要高度熟练的技师来制备，读及解析结果，因为非特异性染色粘液或碎片可见于样本。当细胞干燥到玻璃上时，细胞形态及染色图案也妥协。本领域需要相比那些目前可得到的具有更佳精确度和更快的处理时间的改善的 DFA检定。发明概述本发明涉及处理用于直接病毒检测的液体形式的生物学样品。例如，样品可源于呼吸系统(例如，肺吸入或鼻咽拭子样品)。检测方法可使用直接结合细胞上或中的病毒抗原，由此允许鉴定以及检测的抗体。在一些实例中，抗体是标记的单克隆抗体。方法可与包含能区别多个荧光信号的算法的装置集成。在一实施方式中，本发明涵盖进行包含至少一种荧光标记物的液体直接荧光测定 (LDFA)的方法，在一实施方式中，荧光标记物包含R-藻红蛋白(PE)。在一实施方式中，荧光标记物包含异硫氰酸荧光素(FITC)。在一实施方式中，荧光标记物附接于抗体。在一实施方式中，本发明涵盖方法，其包括(a)提供(i)生物学样品，其包含至少一种病毒抗原；(ii)第1和第2抗体，其中所述第1抗体与第1病毒抗原反应，且不与第2病毒抗原反应，且用第1荧光标签标记；且其中所述第2抗体与所述第2病毒抗原反应，且不与所述第1病毒抗原反应，且用第2荧光标签标记；(b)使至少部分所述样品与所述第1和第2抗体在悬浮液中在仅所述第1和第2抗体之一结合所述抗原的条件下温育；(c)基于检测所述第1荧光标签来鉴定第1病毒。在一实施方式中，方法还包括，步骤(d)基于检测所述第2荧光标签来鉴定第2病毒。在一实施方式中，方法还包括基于检测所述第1荧光标签及所述第2荧光标签来鉴定所述第1病毒及所述第2病毒。在一实施方式中，第1标记物包含R-藻红蛋白。在一实施方式中，第2标记物包含异硫氰酸荧光素。在一实施方式中，抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，病毒可选自，包括但不限于，鼻病毒，人乳头瘤病毒，人免疫缺陷病毒，肝炎病毒，新城疫病毒，心病毒，被脂病毒科(corticoviridae)，囊病毒科(cystoviridae)，爱泼斯坦-巴尔病毒，纤丝病毒科(filoviridae)，嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，肝炎病毒，疱疹病毒，流感病毒，丝杆病毒科(inoviridae)，虹膜病毒科(iridoviridae)，变性肺病毒，正粘病毒科(orthomyxoviridae)，乳多空病毒，副粘病毒科(paramyxoviridae)，细小病毒禾斗(parvoviridae)，多 DNA 病毒禾斗(polydnaviridae)，痘病毒禾斗(Poxyviridae)， 呼肠孤病毒科(reoviridae)，弹状病毒科(rhabdoviridae)，塞姆利基森林病毒，四病毒科 (tetraviridae)，环曲病毒科(toroviridae)，水痘带状疱疹病毒，痘苗病毒和水疱性口炎病毒。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供(i)生物学样品，其包含经至少一种病毒抗原感染的细胞；( )第1和第2抗体，其中所述第1抗体与呼吸道合胞体病毒抗原反应，且不与变性肺病毒病毒抗原反应，且用第1荧光标签标记；且其中所述第2抗体与变性肺病毒病毒抗原反应，且不与呼吸道合胞体病毒抗原反应，且用第2荧光标签标记； (b)使至少部分所述样品与所述第1和第2抗体在悬浮液中在仅所述第1和第2抗体之一结合所述抗原的条件下温育；及(c)基于检测第1或第2荧光标签来鉴定病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第1荧光标签来鉴定呼吸道病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第2荧光标签来鉴定变性肺病毒病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第1和第2荧光标签来鉴定呼吸道合胞体病毒抗原和变性肺病毒病毒抗原。在一实施方式中，第1 标记物包含R-藻红蛋白。在一实施方式中，第2标记物包含异硫氰酸荧光素。在一实施方式中，抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是同时的。 在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供(i)生物学样品，其包含至少一种病毒抗原；(ii)第1和第2抗体，其中所述第1抗体与流感A病毒抗原反应，且不与流感B病毒抗原反应，且用第1荧光标签标记；且其中所述第2抗体与所述流感B病毒抗原反应，且不与所述流感A病毒抗原反应，且用第2荧光标签标记；(b)使至少部分所述样品与所述第1和第2抗体在悬浮液中在仅所述第1和第2抗体之一结合所述病毒的条件下温育；及(c)基于检测第1或第2荧光标签来鉴定至少一种病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第1荧光标签来鉴定流感A病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第2荧光标签来鉴定流感B病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第1和第2荧光标签来鉴定流感A病毒抗原和流感B病毒抗原。在一实施方式中，第1标记物包含R-藻红蛋白。在一实施方式中，第2标记物包含异硫氰酸荧光素。在一实施方式中，抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供(i)生物学样品，其包含至少一种病毒抗原；(ii)第1和第2抗体，其中所述第1抗体与副流感病毒抗原反应，且不与腺病毒病毒抗原反应，且用第1荧光标签标记；且其中所述第2抗体与所述腺病毒病毒抗原反应，且不与所述副流感病毒抗原反应，且用第2荧光标签标记；(b)使至少部分所述样品与所述第1和第2抗体在悬浮液中在仅所述第1和第2抗体之一结合所述病毒的条件下温育；及(c)基于检测第1或第2荧光标签来鉴定至少一种病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第1荧光标签来鉴定副流感病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第2荧光标签来鉴定腺病毒病毒抗原。在一实施方式中，方法基于检测第1和第2荧光标签来鉴定副流感病毒抗原和腺病毒病毒抗原。在一实施方式中，第1标记物包含R-藻红蛋白。在一实施方式中，第2标记物包含异硫氰酸荧光素。在一实施方式中，抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，第1和第2抗体与悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中样品疑似包含至少一种病毒抗原；(ii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述至少一种抗原能与所述荧光标记的抗体中的至少一种相互作用，其中所述抗体被区别标记；(b) 使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述荧光标记的抗体中的至少一种结合所述至少一种病毒抗原的条件下温育，由此形成经标记的抗原-抗体复合物；及(c)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述悬浮液中的所述经标记的抗原-抗体复合物，由此鉴定至少一种病毒抗原。在一实施方式中，生物学样品源于患者，由此诊断病毒感染。在一实施方式中， 荧光标记的抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，病毒抗原包含呼吸道合胞体病毒病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对呼吸道合胞体病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的单克隆呼吸道病毒抗体包含PE荧光标记物。在一实施方式中，病毒抗原包括流感病毒病毒抗原。在一实施方式中，流感病毒病毒抗原包括流感A病毒病毒抗原。在一实施方式中，流感病毒病毒抗原包括流感B病毒病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对流感A病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的流感A单克隆抗体包含PE荧光标记物。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对流感B病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的流感B单克隆抗体包含FTIC荧光标记物。 在一实施方式中，病毒抗原包含腺病毒病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对腺病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的腺病毒单克隆抗体包含FITC荧光标记物。在一实施方式中，病毒抗原包括副流感病毒病毒抗原。在一实施方式中，副流感病毒病毒抗原包括副流感1病毒病毒抗原。在一实施方式中，副流感病毒病毒抗原包括副流感2病毒病毒抗原。在一实施方式中，副流感病毒病毒抗原包括副流感3病毒病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对副流感病毒的特异性亲和性。 在一实施方式中，荧光标记的副流感单克隆抗体包含PE荧光标记物。在一实施方式中，荧光标记的副流感单克隆抗体包含对副流感1病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的副流感单克隆抗体包含对副流感2病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的副流感单克隆抗体包含对副流感3病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，病毒抗原包含变性肺病毒病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对变性肺病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的变性肺病毒单克隆抗体包含FITC荧光标记物。在一实施方式中，病毒抗原包含水痘带状疱疹病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对水痘带状疱疹病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的水痘带状疱疹单克隆抗体包含PE荧光标记物。在一实施方式中，病毒抗原包含单纯疱疹病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对单纯疱疹-1病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对单纯疱疹-2病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的单纯疱疹单克隆抗体包含FITC荧光标记物。在一实施方式中，悬浮液包含选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭，吖啶橙及其组合。在一实施方式中，悬浮液包含去污剂。在一实施方式中，去污剂是皂苷配基。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中所述样品疑似包含呼吸道合胞体病毒病毒抗原；(ii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述病毒抗原能与所述荧光标记的抗体中的至少一种相互作用，其中抗体被区别标记； (b)使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述呼吸道合胞体病毒病毒抗原结合所述荧光标记的抗体中的至少一种的条件下温育，由此形成经标记的抗原-抗体复合物；及(c)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述悬浮液中的所述经标记的抗原-抗体复合物，由此鉴定所述呼吸道合胞体病毒病毒抗原。在一实施方式中，生物学样品源于患者，由此诊断呼吸道合胞体病毒感染。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中， 荧光标记的单克隆抗体包含对呼吸道合胞体病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的单克隆呼吸道病毒抗体包含PE荧光标记物。在一实施方式中，悬浮液包含选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭，吖啶橙及其组合。在一实施方式中，悬浮液包含去污剂。在一实施方式中，去污剂是皂苷配基。在一实施方式中，呼吸道合胞体病毒单克隆抗体源于选自下列的克隆克隆3A4D9或克隆4F9G3。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中所述样品疑似包含流感病毒病毒抗原；(ii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述病毒抗原能与所述荧光标记的抗体中的至少一种相互作用，其中抗体被区别标记；(b)使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述荧光标记的抗体中的至少一种结合流感病毒病毒抗原条件下温育，由此形成经标记的抗原-抗体复合物；及(c)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述悬浮液中的所述经标记的抗原-抗体复合物，由此鉴定所述流感病毒病毒抗原。在一实施方式中，生物学样品源于患者，由此诊断流感病毒感染。在一实施方式中，流感病毒病毒抗原包括流感A病毒病毒抗原。在一实施方式中，流感病毒病毒抗原包括流感 B病毒病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对流感A病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的流感A单克隆抗体包含PE荧光标记物。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对流感B病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，流感B单克隆抗体源于选自下列的克隆克隆8C7E11或克隆9B4D9。在一实施方式中，荧光标记的流感B单克隆抗体包含FTIC荧光标记物。在一实施方式中，悬浮液包含选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭，吖啶橙及其组合。在一实施方式中，悬浮液包含去污剂。在一实施方式中，去污剂是皂苷配基。在一实施方式中，流感A单克隆抗体源于选自下列的克隆克隆2H3C5或克隆A (6) Bll0在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中所述样品疑似具有腺病毒病毒抗原；(ii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述病毒抗原能与所述荧光标记的抗体中的至少一种相互作用，其中抗体被区别标记；(b)使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述所述荧光标记的抗体中的至少一种结合所述腺病毒病毒抗原的条件下温育，由此形成经标记的抗原-抗体复合物；及(c)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述悬浮液中的所述经标记的抗原-抗体复合物，由此鉴定所述腺病毒病毒抗原。在一实施方式中，生物学样品源于患者，由此诊断腺病毒感染。在一实施方式中， 荧光标记的抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对腺病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的腺病毒单克隆抗体包含FITC荧光标记物。在一实施方式中，悬浮液包含选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭，吖啶橙及其组合。在一实施方式中，悬浮液包含去污剂。在一实施方式中，去污剂是皂苷配基。在一实施方式中，腺病毒单克隆抗体源于选自下列的克隆克隆8H2C9，克隆2H10E2或克隆4H6C9。 在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中样品疑似包含副流感病毒病毒抗原；(ii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述病毒抗原能与所述荧光标记的抗体中的至少一种相互作用，其中抗体被区别标记；(b)使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述所述荧光标记的抗体中的至少一种结合所述副流感病毒病毒抗原的条件下温育，由此形成经标记的抗原-抗体复合物；及(c)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述经标记的抗原-抗体复合物，由此鉴定副流感病毒病毒抗原。在一实施方式中，生物学样品源于患者，由此诊断副流感病毒感染。在一实施方式中，流感病毒病毒抗原包括副流感1病毒病毒抗原。在一实施方式中，流感病毒病毒抗原包括副流感2 病毒病毒抗原。在一实施方式中，流感病毒病毒抗原包括副流感3病毒病毒抗原。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含 PE荧光标记物。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对副流感1病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对副流感2病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对副流感3病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，悬浮液包含选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭，吖啶橙及其组合。在一实施方式中，悬浮液包含去污剂。在一实施方式中，去污剂是皂苷配基。 在一实施方式中，副流感1单克隆抗体源于选自下列的克隆1D8E10或9F61C9。在一实施方式中，副流感2单克隆抗体源于选自下列的克隆克隆2E4D7或克隆5E4E11。在一实施方式中，副流感3单克隆抗体源于选自下列的克隆克隆4G5(1)E2H9或克隆1F6C8。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是依次的。
在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中样品疑似包含变性肺病毒病毒抗原；(ii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述病毒抗原能与所述荧光标记的抗体相互作用，其中抗体被区别标记；(b)使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述荧光标记的抗体中的至少一种结合所述变性肺病毒病毒抗原的条件下温育，由此形成经标记的抗原-抗体复合物；及(c)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述经标记的抗原-抗体复合物，由此鉴定变性肺病毒病毒抗原。在一实施方式中，生物学样品源于患者，由此诊断变性肺病毒感染。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含单克隆抗体。在一实施方式中，荧光标记的单克隆抗体包含对变性肺病毒病毒抗原的特异性亲和性。在一实施方式中，荧光标记的变性肺病毒单克隆抗体包含FITC荧光标记物。在一实施方式中，悬浮液包含选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭，吖啶橙及其组合。在一实施方式中，悬浮液包含去污剂。在一实施方式中，去污剂是皂苷配基。在一实施方式中，变性肺病毒单克隆抗体源于选自下列的克隆克隆#4，克隆#23或克隆#28。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是依次的。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中样品包含源于所述患者的未固定的细胞，所述悬浮液还包含皂苷配基及缺少固定剂和非-水性溶剂；及(ii)与病毒抗原反应性的荧光标记的抗体；及(b)在至少部分所述抗体与所述病毒抗原反应的条件下将所述荧光标记的抗体导入所述细胞悬浮液，由此暴露病毒抗原与所述细胞。在一实施方式中，样品源于疑似具有病毒感染的患者，在一实施方式中，病毒抗原是细胞内的。在一实施方式中，病毒抗原是细胞外的。在一实施方式中，病毒抗原附接于病毒。在一实施方式中，病毒抗原展示在细胞表面。在一实施方式中，本发明涵盖细胞计数器，包括(a)样品容器，其配置为位于样品托架内，其中所述托架与所述细胞计数器可滑动地扣合；(b)定位于照明至少部分所述容器的激发照明源；及(c)检测器，其定位于收集来自所述至少部分所述容器的发射照明。 在一实施方式中，样品容器包含具有多个孔的显微镜载玻片。在一实施方式中，样品托架滑动，以将所述多个容器连续暴露于所述照明的部分。在一实施方式中，激发照明源包含发光二极管。在一实施方式中，发射照明源于荧光标记的单克隆抗体。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供(i)包含生物学样品的悬浮液，其中所述样品包含荧光标记的生物学细胞；(ii)细胞计数器，其包含样品托架，其中所述托架配置为平移所述装置之内的样品容器，其中所述容器包含多个样品；(iii)激发照明源，其靶向所述至少一种样品；及(b)在第1样品通过所述激发照明源照明的条件下将所述样品容器插入所述样品托架；及(c)平移所述样品容器使得第2样品通过所述照明源照明。在一实施方式中，荧光标记的细胞包含荧光染料。在一实施方式中，荧光染料选自 碘化丙锭，溴化乙锭和吖啶橙。在一实施方式中，荧光标记的细胞包含荧光标记的单克隆抗体，在一实施方式中，荧光标记的抗体包含R-藻红蛋白。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含异硫氰酸荧光素。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供(i)包含生物学样品的悬浮液，其中所述样品包含至少2种荧光标记的病毒抗原；及(ii)细胞计数器，其能区别检测荧光标记的病毒抗原；(b)将所述悬浮液放入所述细胞计数器；及(c)检测所述荧光标记的病毒抗原中的至少一种，在一实施方式中，第1病毒抗原的检测鉴定第1病毒。在一实施方式中，第2病毒抗原的检测鉴定第2病毒。在一实施方式中，本发明涵盖方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中样品疑似包含患病的细胞；(ii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述细胞能与所述荧光标记的抗体中的至少一种相互作用，其中所述抗体被区别标记；及(c)使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述荧光标记的抗体中的至少一种结合所述细胞的条件下温育， 由此形成经标记的细胞-抗体复合物；及(d)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述悬浮液中的所述经标记的细胞-抗体复合物，由此诊断所述患病的细胞。在一实施方式中，生物学样品源于患者。在一实施方式中，悬浮液包含选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭， 吖啶橙及其组合。在一实施方式中，悬浮液包含去污剂。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含R-藻红蛋白(PE)。在一实施方式中，荧光标记的抗体包含异硫氰酸荧光素(FITC)。在一实施方式中，去污剂是皂苷配基。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是同时的。在一实施方式中，荧光标记的抗体和悬浮液的温育是依次的。定义本文所用的术语“疑似”指患者呈现的医疗状况或医疗状况组，其提示，患者可患特定疾病或痛苦。例如，这些状况可包括，但不限于，罕见的物理症状，罕见的情绪症状，或罕见的生物化学测试结果。如本文使用的术语"液体细胞悬浮液"或"悬浮液"指包含生物学样品的任何流体组合物，其中样品的组分相对于任何天然的或人工表面和/或基材保持移动。流体可包含含水组分以及有机组分。例如，液体细胞悬浮液可包含磷酸盐缓冲液。如本文使用的术语"附接的"指介质(或载体)和药物之间的任何相互作用。附接可可反转或不可逆。该附接包括，但不限于，共价键合，离子键合，范德华力或摩擦，等。如果其浸渍，合并，包被于悬浮液，溶液，与之混合，等，则药物附接于介质(或载体)。如本文使用的术语"源于"指目标物品(即，例如，单克隆抗体或能量签名 (energy signature))的源。一方面，病毒感染的细胞可源于生物学生物(即，例如，人，动物，植物或患者)。一方面，单克隆抗体可源于杂交瘤克隆细胞系(即，例如，克隆)。一方面，发射照明可源于荧光化合物。一方面，激发照明可源于光源。如本文使用的术语“基于“指任何处理或方法，包括导致定量特定激发源的强度的能力的数学算法。而且，处理，方法或数学算法能区别多个激发源，使得它们可个别定量及比较。如本文使用的术语〃检测〃或〃检测〃或〃检测〃指能鉴定照明或激发源的任何方法和/或装置。如本文使用的术语"患者"是人或动物和不需要是住院的。例如，门诊患者，在养老院的人是"患者"。患者可包含任何龄的人或非-人动物，由此兼包括成年及青少年 (即，儿童)。术语"患者"不旨在意味着需求医疗治疗，因此，患者可自愿地或非自愿地是无论临床或支持基础科学研究的实验的一部分。如本文使用的术语“亲和性“指导致它们进入及保持在化学组合中的物质或粒子之间的任何引力。例如，相比具有低亲和性的抑制剂，对受体具有高亲和性的抑制剂化合物会在防止受体与其天然的配体相互作用中提供更大功效。
如本文使用的术语"蛋白"指由通过肽键连接的氨基酸残基组成的多种天然存在的极其复合物质(如酶或抗体)之任何，含有元素碳，氢，氮，氧，通常硫。一般而言，蛋白包含具有百内的数量级的氨基酸。如本文使用的术语"肽"指源于通过一个酸的氨基与另一酸的羧基的组合的2 个或更多氨基酸的各种酰胺之任何，且通常通过蛋白的部分水解获得。一般而言，肽包含具有几十的数量级的氨基酸。如本文使用的"核酸序列"和"核苷酸序列"指寡核苷酸或多核苷酸，及其片段或部分，且指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可为单链或双链，且代表正义或反义链。如本文使用的术语"分离的核酸"指从其天然的状态移出的任何核酸分子(例如，从细胞移出，且在优选的实施方式中，无其他基因组核酸)。如本文使用的术语"氨基酸序列"和"多肽序列"可互换，且指氨基酸序列。如本文参考蛋白使用的术语"部分"(如以"部分给定蛋白")指该蛋白的片段。片段尺寸可跨4个氨基酸残基 整个氨基酸序列减去一个氨基酸。参考核苷酸序列使用的术语"部分"指该核苷酸序列的片段。片段尺寸可跨5个核苷酸残基 整个核苷酸序列减去一个核酸残基。术语"抗体"指动物中通过免疫原(抗原)引发的免疫球蛋白。期望抗体展示对免疫原中含有的表位的特异性。术语"多克隆抗体"指由多于单克隆的浆细胞产生的免疫球蛋白；相反，"单克隆抗体"指由单克隆的浆细胞产生的免疫球蛋白。具有对病毒抗原的特异性亲和性的本文涵盖的全部单克隆抗体可商购(Diagnostics Hybrids, Inc.，Athens， OH)。参考抗体和蛋白或肽的相互作用使用的术语"特异性亲和性"，“特异性结合" 或"特异性结合"是指相互作用依赖于蛋白上的特定结构(即，例如，抗原决定簇或表位) 的存在；换言之，抗体识别及结合特异性蛋白结构而非普遍识别及结合蛋白。例如，如果抗体对于表位"A"是特异性的，在含有标记的"A"的反应中含有表位A(或游离的，未标记的A)的蛋白和抗体的存在会减少结合到抗体的标记的A的量。如本文使用的术语"采样"以其最广义使用且包括环境和生物学样品。环境样品包括自环境例如土壤和水的物质。生物学样品可为动物，包括，人，流体(例如，鼻咽排出物，血，血浆和血清)，固体(例如，粪便)，组织，液体食品(例如，乳)和固体食品(例如， 植物)。例如，肺部样品可通过包含源于肺组织的流体和细胞的支气管肺泡灌洗(BAL)收集。可收集疑似含有病毒-感染的细胞，组织提取物或体液的生物学样品。术语"免疫学活跃的"定义天然，重组或合成肽(即，例如，胶原-样家族蛋白)， 或其任何寡肽，在适当的动物或细胞中诱导特定免疫应答和/或与特异性抗体结合的能力。如本文使用的术语"抗原决定簇"指被特定抗体识别的分子的一部分(即，表位)。当蛋白或蛋白的片段用于免疫宿主动物时，蛋白的多个区可诱导特别结合蛋白上的给定区或3维结构的抗体的产生；这些区或结构指抗原决定簇。抗原决定簇可与完整抗原 (即，用来引发免疫应答的免疫原)就结合抗体而竞争。一种该抗原决定簇可为"病毒抗原“，其中抗原可展示在病毒-感染的宿主细胞表面或病毒包被表面上或内。术语〃免疫原，‘‘‘‘抗原，‘‘‘‘免疫原性〃和〃抗原性〃指当导入动物时能产生抗体的任何物质。通过定义，免疫原必需含有至少一种表位(能导致免疫应答的特定生物化学单元)，及通�：行矶喔嘀直砦�。蛋白最常用作免疫原，但与蛋白复合的脂质和核酸部分也可作为免疫原。后述复合物在具有少表位的更小分子本身不刺激满意的免疫应答时常常有用。术语"抗体"指动物中由免疫原(抗原)引发的免疫球蛋白。期望抗体展示对免疫原中含有的表位的特异性。术语"多克隆抗体"指由多于单克隆的浆细胞产生的免疫球蛋白；相反，“单克隆抗体"指由单克隆的浆细胞产生的免疫球蛋白。本文中使用的术语〃标记〃或〃可检测的标记〃指可通过荧光，光谱，光化学，生物化学，免疫化学，电，光学或化学手段检测的任何组合物。例如，该标记物可包括，但不限于，异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)，量子点，CT3和CY5。其他该标记物包括，但不限于，
用于用下列染色的生物素标记的链霉亲和素缀合物，磁珠(例如，Dynabeads )，荧光
染料(例如，荧光素，德克萨斯红，若丹明，绿色荧光蛋白，等)，放射性标记(例如，3h，125I， 35S, 14C或32P)，酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶和ELISA中通常使用的其他酶)，及测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳，等)珠。教导该标记物的使用的专利包括，但不限于，U. S.专利No. 3，817，837 ；3, 850，752 ；3, 939，350 ； 3，996，345 ；4, 277,437 ；4, 275, 149 ；及4，366，241 (全部通过引用并入本文)。本发明中涵盖的标记物可通过许多方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。如本文使用的术语"结合"指感染控制组合物和表面之间的任何相互作用。例如表面定义为"结合表面"。结合可反转或不可逆。该结合可为，但不限于，非-共价结合， 共价键合，离子键合，范德华力或摩擦，等。如果浸渍，合并，包被在悬浮液，溶液中，与之混合，等，则感染控制组合物结合到表面。术语"荧光焦点"指当荧光标记抗体时发荧光的一个细胞或一组紧密相邻细胞。 一些单病毒感染产生多-细胞噬斑和其他仅每有活力的病毒感染1个或2个细胞的结果。 由许多荧光染色细胞组成的病毒噬斑对于病毒例如HSV，VZV和RSV计为"1"。病毒例如流感A，B和腺病毒每有活力的感染性病毒产生仅1个或少数荧光染色细胞。术语"病毒"指不能自主复制(S卩，复制需要使用宿主细胞的机构)的专性，超显微，细胞内寄生物。病毒例如，但不限于，腺病毒，鼻病毒，人乳头瘤病毒，人免疫缺陷病毒，肝炎病毒，新城疫病毒，心病毒，被脂病毒科(corticoviridae)，囊病毒科(cystoviridae)，爱泼斯坦-巴尔病毒，纤丝病毒科(filoviridae)，嗜肝DNA病毒科(h印adnaviridae)，肝炎病毒，疱疹病毒，流感病毒，丝杆病毒科(inoviridae)，虹膜病毒科(iridoviridae)，变性肺病毒，正粘病毒科(orthomyxoviridae)，乳多空病毒，副流感病毒，副粘病毒科(paramyxoviridae),细小病毒科(parvoviridae)，多DNA病毒科 (polydnaviridae)，痘病毒科(Poxyviridae)，呼肠孤病毒科(reoviridae)，呼吸道合胞体病毒，弹状病毒科(rhabdoviridae)，塞姆利基森林病毒，四病毒科(tetraviridae), 环曲病毒科(toroviridae)，痘苗病毒，及水疱性口炎病毒。“病毒"也包括不是正链RNA病毒的动物病毒，例如，但不限于沙粒病毒科(Arenaviridae)，杆状病毒科(Baculoviridae),尺禾斗(Birnaviridae), ^ijBMi^^(Bunyaviridae), 属(Cardiovirus)，被脂病毒科(Corticoviridae)，囊病毒科(Cystoviridae)，爱泼斯坦-巴尔病毒，纤丝病毒科(Filoviridae)，嗜肝DNA病毒科Ofepadnaviridae)，肝炎病毒，疱疹病毒科(Herpesviridae)，流感病毒，丝杆病毒科(Inoviridae)，虹膜病毒科 (Iridoviridae)，变性肺病毒，正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，乳多空病毒，副粘病毒科 (Paramyxoviridae)，(Parvoviridae)，多 DNA(Polydnaviridae)，
毒科(Poxyviridae)，呼肠孤病毒科(Reoviridae)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)，塞姆利基森林病毒，四病毒科CTetraviridae)，环曲病毒科(Toroviridae)，痘苗病毒，水疱性口炎病毒。如本文使用的术语〃病原体〃指包含至少一种抗原的任何亚显微或显微生物。例如，包含抗原的病原体可通过具有对病原体抗原的特异性亲和性的荧光标记的单克隆抗体检测及鉴定。病原体的代表例包括，但不限于，细菌，真菌，酵母，病毒或任何微生物。如本文使用的术语"呼吸道病毒"指能感染肺部组织(即，例如，肺组织)的任何病毒。例如，呼吸道病毒包括，但不限于，流感，副流感，腺病毒，鼻病毒，单纯疱疹病毒，呼吸道合胞体病毒，汉坦病毒或巨细胞病毒。
此专利文件含有至少1个彩图。带有彩图的此专利的拷贝会在请求及支付必需费用后由专利和商标局提供。图1显示非-流感A病毒感染的细胞(S卩，阴性对照)中荧光标记的单克隆抗体 (MAb)温育的例示数据。黄染色背景信号。图2显示流感A病毒-感染的细胞的1+稀释等份(低滴度)中荧光标记的MAb 温育的例示数据。苹果绿染色:MAb-标记的细胞。黄染色背景信号。图3显示流感A病毒-感染的细胞的4+稀释等份(高滴度)中荧光标记的MAb 温育的例示数据。苹果绿染色FITC MAb-标记的病毒感染的细胞。黄染色背景信号。图4显示腺病毒-感染的细胞中荧光标记的FITC MAb温育的例示数据。上图用碘化丙锭和伊文思蓝染色的阴性对照样本。下图苹果绿染色FITC MAb-标记的腺病毒感染的细胞。图5显示呼吸道病毒-感染的细胞中荧光标记的PE MAb温育的例示数据。上图 用碘化丙锭和伊文思蓝染色的阴性对照样本。下图金染色PE MAb-标记的腺病毒感染的细胞。图6显示流感A病毒MAb的SDS-PAGE电泳图谱分离的例示数据。(i)MAb A (6) Bll 泳道 A2，C5 和 C6 ； (ii)MAb 10B12C11 泳道 Bl ；及(iii)MAb 2H3C5 泳道 C1，C2 和 C3。 分子量标记物在泳道A6，B4和C4 ;2更重标记物条带分别代表50和20kDa。其他泳道代表其他病毒MAb。约5-yg的蛋白装载到各孔。图7显示流感A病毒MAb的各种实施方式对流感A (德克萨斯)病毒的结合亲和力的例示数据。红矩形MAb 10B12C11。蓝圆形MAb 2H3C5。绿三角形MAb ZymeTx A(6) B11。图8显示示用金黄色荧光单克隆抗体(图8A)或苹果-绿色荧光单克隆抗体(图8B)检测流感A病毒感染的细胞的例示数据。图 9 显示示对于流感 A (图 9A)和流感 B (图 9B)的 LDFA(MAb :10B12C11+A(6)B11) 对比DFA病毒检测的比较的例示数据。图10提供显示对于呼吸道病毒(图10A)及变性肺病毒(图10B)的LDFA(MAb 10B12C11+A(6)B11)对比DFA病毒检测的比较的例示数据。图11提供显示对于腺病毒(图11A)和副流感病毒1(图11B)的LDFA(MAb 10B12C11+A(6)B11)对比DFA病毒检测的比较的例示数据。图12提供显示对于副流感病毒2 (图12A)和副流感病毒3 (图12B)的LDFA (MAb 10B12C11+A(6)B11)对比DFA病毒检测的比较的例示数据。图13提供显示对于副流感(1 3)(图13A)；及图9 13A中病毒的组合的混合物(图13B)的LDFA(MAb :10B12C11+A(6)B11)对比DFA病毒检测的比较的例示数据。图14显示能检测及测量自至少2种区别标记的MAb的发射照明的便携荧光读取器的一实施方式。也显示定位用于进入插入(作为单元)到样品抽屉中的载玻片托架上的装置的多-孔样品载玻片。图15显示随图14的装置显示的多-孔样品载玻片的一实施方式。移液管指示用于导入和/或撤回液体样品的进和出口的位置。发明详述本发明涉及处理用于直接病毒检测的液体形式的生物学样品。例如，样品可源于呼吸系统。检测方法可使用直接结合病毒抗原，由此允许鉴定以及检测的抗体。在一些实例中，抗体是标记的单克隆抗体。方法可与包含能区别多个荧光信号的算法的装置集成。在一实施方式中，本发明涵盖用于使用处理的生物学细胞样本的图像和测定细胞是否对于病毒感染阳性或阴性的算法来检测及鉴定病毒抗原的方法。在一实施方式中，方法在制备，处理及检查期间包括液体样品。I.病毒感染疾病流行期间，病毒可尤其在老人及患慢性肺部和/或心血管病症的患者中显著导致病态和死亡率(Swenson et al. , “ Rapid detection of influenza virus in cell culture by indirect immunoperoxidase staining with type-specific monoclonal antibodies" Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 7 :265-268 (1987))。适当的感染控制措施及适当的患者管理可通过快速检测和鉴定临床样本中的病毒来优化。病毒是小感染性生物-比真菌或细菌小得多-其必需侵入活细胞来繁殖(例如， 复制)。病毒附接到细胞(称之为宿主细胞)，进入其和在细胞内释放其DNA或RNA。病毒的DNA或RNA是含有复制病毒需要的信息的遗传物质。病毒的遗传物质控制细胞及使其复制病毒。感染的细胞通常死亡，因为病毒保持实施其正常功能。当其死亡时，细胞释放新病毒，其继续感染其他细胞。一些病毒不杀它们感染的细胞，但代之以改变细胞的功能。有时感染的细胞的正常细胞分裂失控及成为癌性。一些病毒将它们的遗传物质留在宿主细胞内，其中物质保持休眠延长的时间(例如，潜伏感染)。当扰乱细胞时，病毒可再次开始复制及导致疾病。病毒通常感染一种特定类型的细胞。例如，感冒病毒仅感染上呼吸道的细胞。此夕卜，多数病毒仅感染少数物种的植物或动物。一些仅感染人。许多病毒通常感染婴儿和儿里。病毒以各种方式扩展(例如，传播的)。一些吞咽，一些吸入，及一些通过昆虫和其他寄生虫(即，例如，蚊和蜱)叮咬扩展。一些通过性扩展。1.防御多数生物学生物具有许多针对病毒的防御。例如，物理屏障，例如皮肤，阻碍容易进入。感染的细胞也制造干扰素，可使未感染的细胞对被许多病毒感染更抗性的物质。当病毒进入身体时，病毒可引发身体的免疫防御。这些防御开始于白细胞，例如淋巴细胞和单核细胞，其产生攻击及毁坏病毒或感染的细胞的抗体。抗病毒抗体的产生导致免疫的随后状态，其中白细胞现在按程序立即响应再感染。免疫的这些状态可通过用非-感染性病毒粒子疫苗接种来人工诱导。疫苗接种起始由各种白细胞的抗体的产生，由此产生性质上是多克隆的抗体。2.病毒感染的类型可能最常见的病毒感染是上呼吸道气道(S卩，例如，鼻，喉，等)的感染。这些感染包括咽炎，鼻窦炎，及普通感冒。流感是病毒呼吸道感染，在小儿童中，病毒也通常导致气管 (即，例如，喉气管支气管炎)或肺内部更深处的其他气道的哮吼及发炎。呼吸道感染更可能在婴儿，老年人和患肺或心脏病症的人中导致严重的症状。一些病毒(S卩，例如，狂犬病病毒，西尼罗河病毒，及几种不同脑炎病毒)感染神经系统。病毒感染也在皮肤中发展，有时导致疣或其他污点。其他常见的病毒感染由疱疹病毒导致。8种不同疱疹病毒感染人，包括但不限于， 1型单纯疱疹病毒，2型单纯疱疹病毒，及水痘-带状疱疹病毒导致在皮肤或粘液膜产生水疱的感染。另一疱疹病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒，导致感染性单核细胞增多症。巨细胞病毒是新生儿和具有减弱的免疫系统的人中严重的感染的成因。巨细胞病毒也可产生类似于具有健康免疫系统的人中感染性单核细胞增多症的症状。人疱疹病毒6和7导致称之为婴儿玫瑰疹的儿童感染。人疱疹病毒8已联系到患AIDS的人中的癌(卡波西的肉瘤)的成因。全部疱疹病毒导致终生感染，因为病毒以休眠(潜伏)状态保留在其宿主细胞之内。有时病毒再活化及产生疾病的进一步发作。复活可快速或在初始感染后许多年后发生。3.诊断常见的病毒感染通常基于症状诊断。对于疾病流行(即，例如，流感)中发生的感染而言，其他类似情况的存在可辅助医生鉴定特定感染。对于其他感染而言，可进行血测试和培养(在实验室中从自感染的区获取的血，体液或其他物质的样品生长微生物)。可测试血中针对病毒或抗原(引发身体的防御的病毒上或中的蛋白)的抗体。聚合酶链反应(PCR) 技术可用于制造病毒遗传物质的许多拷贝，使医生快速和精确地鉴定病毒。测试有时做得快速-例如，当感染是对公共健康的严重威胁或当症状严重时。血或其他组织的样品有时用电子显微镜检查，其提供具有清楚的分辨率的高放大率。4.治疗对抗病毒感染的药物称为抗病毒药物。许多抗病毒药物通过干扰病毒复制而工作，例如用来治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的药物。因为病毒在细胞内使用细胞自身代谢功能复制，抗病毒药物可靶向仅有限数量的代谢功能。因此，抗病毒药物难以开发。而且， 有效抗病毒药物可对人细胞是有毒性的。病毒也可对抗病毒药物的发展抗性。
其他抗病毒药物加强对病毒感染的生物学免疫应答。这些药物包括几种类型的干扰素，免疫球蛋白和疫苗。干扰素药物是减慢或停止病毒复制的天然存在的物质的复制品。 免疫球蛋白是收集自一组人的抗体的灭菌的溶液(也称之为免疫球蛋白)。疫苗是通过刺激身体的天然的防御机理辅助阻止感染的物质。在暴露于病毒之前给予许多免疫球蛋白和疫苗来阻止感染。一些免疫球蛋白和一些疫苗，例如对于狂犬病和乙型肝炎的那些，也在暴露于病毒之后使用，以辅助阻止感染发展或减少感染的严重性。免疫球蛋白也可辅助治疗一些建立的感染和也在未来暴露于病毒之后阻止感染。多数抗病毒药物可经口给予。一些也可通过注射到静脉(静脉内)或肌肉(肌内)来给予。一些作为软膏，霜剂或滴眼剂应用或作为粉吸入。抗生素对于病毒感染不有效，但如果人除了病毒感染之外还有细菌感染，抗生素
常常必需。II.病毒检测测定感染性疾病率和免疫策略响应社会需求，国家防御及产生疾病的生物的进化变化在美国和世界持续发展。进行免疫来阻止许多感染，而针对缺少有效疫苗的感染及群体免疫不被认为是最有效的那些具有足够低的发病率的疾�。蚶迷し佬匀荷秆�。测定暴露于生物材料例如病原体，或监控免疫状态的诊断疾病的现有方法依赖于特定测定而变化。一些方法采用体内测定。其他需要生物学样品，例如待得到及测试的血或血清。通常进行的测试是非-同质类型诊断方法之一，例如酶联免疫吸附试验(下文"ELISA")，放射免疫测定(下文"RIA")，或凝集。全部是表面-结合，异源测定及需要目标抗原与表面相互作用来达到成功，常常以高非特异性结合及特异性损失为代价。本文所述的实施方式通过提供包括方法的全部步骤的完全液体环境来对之前报道的免疫测定进行改善。A.非-荧光抗体测定使用展示捕获荧光标记的感染的细胞的抗体的复合有机-无机纳米簇报道相信能检测溶液中的病毒的通用的方法(Sun et al.，“ Multiplexed Detection of Analytes in Fluid Solution"，美国专利公开No. 2007/0279626)。纳米簇-抗体-细胞复合物然后经历FACS结合拉曼分析，以测定捕获的感染的细胞数。液相免疫诊断测定已报道， 当抗原/抗体复合物通过第1和第2酶发挥作用时产生生物化学报告子(Clemmons et al.，“ Liquid-Phase Immunodiagnostic Assay"，美国专利 No. 5，637，473)。推荐的抗原/抗体复合物包括各种病毒-相关的表位。自疑似患有疾病的患者的临床样品的分析物检测通过样品与核酸-标记的结合构建体反应而报道。结合构建体可为与分析物具有亲和性的抗体。一旦结合，抗体/分析物复合物分离，及扩增核酸标记物及鉴定，以定量捕 ^.WM^ (Lawton, ‘‘ Soluble Analyte Detection and Amplification“ ，禾0 No. 7，341，837 ；及美国专利公开 No. 2005/0048500)。B.间接免疫荧光间接免疫荧光代表方法，其中然后利用相同的物种的标记的(即，例如，荧光标记的)抗-IgG检测针对特异性抗原的第1未标记的IgG抗体作为第1抗体。例如，可针对在兔中产生的特定第1抗体使用标记的山羊抗-兔IgG抗体。使用通过使用FACS方法的流式细胞术通过使用荧光标记的针对基质蛋白I和核蛋白的单克隆抗体来监控细胞内流感A复制。在此系统中，将附着的MDCK细胞首先用含有病毒的样品接种，然后用乙醇和仲甲醛/乙醇固定及脱水(Schulze-Horsel et al.，〃 Flow Cytometric Monitoring of Influenza A Virus Infection in MDCK Cells During Vaccine Production, “ BMC Biotechnol. 8 :45(2008)；禾口 Lonsdale et al. ， “ A Rapid Method for Immunotitration of Influenza Viruses Using Flow Cytometry, " J. Virol. Methods,110(1) :67-71, (2003)) 在用流感病毒感染的小鼠中使用FACS免疫荧光方法研究体内抗体产生。数据展示，从感染的脾脏细胞分离的B细胞在感染过程期间不经历从天然的IgM同种型到流感-特异性同种型的同种型转换(Baumgarth et al. , “ Innate and Acquired Humoral Immunities to Influenza Virus are Mediated by Distinct Arms of the Immune System, “ PNAS 96 :2250-2255(1999))。在各种处理方法之间使用基于细胞培养的间接免疫荧光染色比较流感病毒的检测。使用特异于流感A病毒(即，基质蛋白或核蛋白)或流感B病毒(S卩，核蛋白或血凝素)的抗原的单克隆抗体全部测试室玻片，壳瓶，标准病毒分离，及鼻洗涤样本 (Walls et al. ， “ Characterization and evaluation of monoclonal antibodies developed for typing influenza A and influenza B viruses" J. Clin. Microbiol. 23 240-245(1986))。这些比较表明，尽管剧烈洗涤及，偶尔，不足数的完整细胞，间接免疫荧光测试由于粘液碎片的丰度而难以解析(Stokes et al. , “ Rapid Diagnosis of Influenza A and B by 24-hFluorescent Focus Assays, " J. Clin. Microbiol. 26(7) 1263-1266(1988)).流感感染也可通过捕获用重组产生的流感A M2蛋白包被的表面上的临床样品中天然地产生的抗体来检测(Kendal et al.，“ Improved Expression of Influenza A M2 Protein in Baculovirus and Uses of M2 Protein" ，W0/1993/003173)。 流感病毒感染也可使用夹层免疫荧光检定检测，其中识别NP，Ml, HA和NA蛋白的抗-流感抗血清与固定的及渗透的HeLa细胞反应。将得到的蛋白-抗体复合物用FITC-标记的抗-兔 IgG 抗体可视化(Shiratsuchi et al. , ‘‘ Phosphatidylserine-Mediat ed Phagocytosis of Influenza A Virus-Infected Cells by Mouse Peritoneal Macrophages, “ J.Virol. 74(19) :9240-9244(2000))。使用通过抗-小鼠FITC第二抗体检测的未标记的流感A组-特异性单克隆抗体检测组织印象涂片上的流感病毒。方法不教导使用皂苷配基，或碘化丙锭(Selleck et al. , “ Rapid Diagnosis of Highly Pathogenic Avian Influenza Using Pancreatic Impression Smears, " Avian Diseases 47 (s3) :1190-1195 (2002))。C.直接荧光测定(DFA)直接免疫荧光包含使用标记的反应物(即，例如，抗体)，其兼检测及指示未标记的反应物(即，例如，抗原，病毒表位，或细胞表位)的存在。在一些情况中，标记物包含荧光分子。在一些情况中，使用用荧光分子直接标记的第一抗体是有利的。此直接标记降低染色过程中的步骤数，及更重要地，常常避免交叉-反应性和高背景问题。1.基于非-液体的DFA已通过使用免疫荧光或酶-连接的免疫吸附测定(ELISA)实现病毒的直接检测。由于低灵敏度和非特异性背景染色，通过免疫荧光的直接涂片检查成问题。或者，壳瓶离心测定已适应于检测流感病毒(Espy et al.，“ Rapid detection of influenza virus by shell vial assay with monoclonal antibodies " J. Clin. Microbiol. 24 677-679 (1986) ；and Stokes et al. , " Rapid diagnosis of influenza A and B by 24-hfluorescent focus assay" J Clin. Microbiol. 26 :1263-1266(1988))。在临床呼吸道样本中检测流感A和流感B病毒的一些基于细胞培养的技术使用Madin-Darby狗肾细胞，其非常敏感于用流感病毒感染。该方法进行至少一周温育来观察通过由样品的细胞培养的病毒感染所致的致细胞病变效应的发展(Frank et al. ， “ Comparison of different tissue cultures for isolation and quantitation of influenza and parainfluenza viruses " J. Clin. Microbiol. 10 :32-36 (1979)； and Meguro et al.，. " Canine kidney cell line for isolation of respiratory viruses" J. Clin. Microbiol. 9 :175-179 (1979))。也通过使用直接免疫荧光测定检查临床样本涂片。经历几个步骤制备这些涂片，及在用显微镜观察之前在显微镜载玻片上弄干样品。使用FTIC-标记的抗体随着用伊文斯蓝复染来检测流感。此方法未通过使用皂苷配基来改善可检测的信号或使用用碘化丙锭组合复染来增强(Mills et al.，“ Detection of Influenza Virus by Centrifugal Inoculation of MDCK Cells and Staining with Monoclonal Antibodies, “ J. Clin. Microbiol. 27(11) :2505-2508(1989))。目前，有2种用于使用荧光标记的抗体直接染色呼吸道样本的通用的方法(即，标准DFA和细胞离心涂片器DFA)来检测呼吸道病毒例如流感A和B，呼吸道合胞体病毒，等的存在。将这些检定流程与快得多的本文涵盖的一实施方式(即，例如，液体DFA ;LDFA)比较。见,表1。表1 至使用DFA的1个样本的结果的估计的时间
权利要求
1.方法，包括(a)提供(i)生物学样品，其包含至少一种病毒抗原；( )第1和第2抗体，其中所述第1抗体与第1病毒抗原反应，且不与第2病毒抗原反应，且用第1荧光标签标记；且其中所述第2抗体与所述第2病毒抗原反应，且不与所述第1病毒抗原反应，且用第2 荧光标签标记；(b)使至少部分所述样品与所述第1和第2抗体在悬浮液中在所述抗体结合所述抗原的条件下温育；(c)基于检测所述第1荧光标签来鉴定第1病毒；及(d)基于检测所述第2荧光标签来鉴定第2病毒。
2.权利要求1的方法，其中所述第1标记物包含R-藻红蛋白。
3.权利要求1的方法，其中所述第2标记物包含异硫氰酸荧光素。
4.权利要求1的方法，其中所述第1和第2抗体包含单克隆抗体。
5.权利要求1的方法，其中所述第1和第2抗体与所述悬浮液的温育是同时的。
6.权利要求1的方法，其中所述第1和第2抗体与所述悬浮液的温育是依次的。
7.方法，包括(a)提供；(i)包含生物学样品的悬浮液，其中所述样品疑似包含至少一种病毒抗原；(iii)至少2种荧光标记的抗体，其中所述至少一种病毒抗原能结合所述荧光标记的抗体中的至少一种，其中抗体被区别标记；(b)使所述悬浮液与所述荧光标记的抗体在所述荧光标记的抗体中的至少一种结合所述病毒抗原的条件下温育，由此形成经标记的抗原-抗体复合物；及(c)通过鉴定一种荧光标记的抗体来检测所述悬浮液中的所述经标记的抗原-抗体复合物，由此鉴定所述病毒抗原。
8.权利要求7的方法，其中所述荧光标记的抗体包含单克隆抗体。
9.权利要求7的方法，其中所述病毒抗原包含呼吸道合胞体病毒抗原。
10.权利要求8的方法，其中所述荧光标记的单克隆抗体中的至少一种包含对所述呼吸道合胞体病毒抗原的特异性亲和性。
11.权利要求10的方法，其中所述荧光标记的单克隆呼吸道合胞体病毒抗体包含R-藻红蛋白荧光标记物。
12.权利要求7的方法，其中所述病毒抗原包括流感病毒抗原。
13.权利要求12的方法，其中所述流感病毒抗原包括流感A病毒抗原。
14.权利要求12的方法，其中所述流感病毒抗原包括流感B病毒抗原。
15.权利要求8的方法，其中所述荧光标记的单克隆抗体中的至少一种包含对所述流感A病毒抗原的特异性亲和性。
16.权利要求13的方法，其中所述荧光标记的流感A单克隆抗体包含R-藻红蛋白荧光标记物。
17.权利要求8的方法，其中所述荧光标记的单克隆抗体中的至少一种包含对所述流感B病毒抗原的特异性亲和性。
18.权利要求17的方法，其中所述荧光标记的流感B单克隆抗体包含异硫氰酸荧光素荧光标记物。
19.权利要求7的方法，其中所述病毒抗原包含腺病毒病毒抗原。
20.权利要求8的方法，其中所述荧光标记的单克隆抗体中的至少一种包含对所述腺病毒病毒抗原的特异性亲和性。
21.权利要求20的方法，其中所述荧光标记的腺病毒单克隆抗体包含异硫氰酸荧光素荧光标记物。
22.权利要求7的方法，其中所述病毒抗原包括副流感病毒抗原。
23.权利要求22的方法，其中所述副流感病毒抗原包括副流感1病毒抗原。
24.权利要求22的方法，其中所述副流感病毒抗原包括副流感2病毒抗原。
25.权利要求23的方法，其中所述副流感病毒抗原包括副流感3病毒抗原。
26.权利要求8的方法，其中所述荧光标记的单克隆抗体中的至少一种包含对所述副流感病毒抗原的特异性亲和性。
27.权利要求沈的方法，其中所述荧光标记的副流感单克隆抗体包含R-藻红蛋白荧光标记物。
28.权利要求27的方法，其中所述荧光标记的副流感单克隆抗体包含对所述副流感1 病毒抗原的特异性亲和性。
29.权利要求27的方法，其中所述荧光标记的副流感单克隆抗体包含对所述副流感2 病毒抗原的特异性亲和性。
30.权利要求27的方法，其中所述荧光标记的副流感单克隆抗体包含对所述副流感3 病毒抗原的特异性亲和性。
31.权利要求7的方法，其中所述病毒抗原包含变性肺病毒病毒抗原。
32.权利要求8的方法，其中所述荧光标记的单克隆抗体包含对所述变性肺病毒病毒抗原的特异性亲和性。
33.权利要求32的方法，其中所述荧光标记的变性肺病毒单克隆抗体包含异硫氰酸荧光素荧光标记物。
34.权利要求7的方法，其中所述悬浮液还包括选自下列的染色剂伊文思蓝，碘化丙锭，吖啶橙及其组合。
35.权利要求7的方法，其中所述悬浮液还包括去污剂。
36.权利要求35的方法，其中所述去污剂是皂苷配基。
全文摘要
本发明描述用于检测感染的细胞中的呼吸道病毒的快速和敏感的液体直接荧光抗体测定。测定包括样本离心，溶液中样品和试剂的温育，及呼吸道病毒的缺失或存在的检测。皂苷配基用作去污剂以渗透化细胞而单克隆抗体进入与细胞内抗原反应。将细胞伴随背景染色及荧光核染色用荧光标记的针对病毒抗原的单克隆抗体染色。此复染降低背景及允许抗原和核结构的共-定位，用于增强的检测。
文档编号G01N33/569GK102483412SQ201080024539
公开日2012年5月30日 申请日期2010年4月16日 优先权日2009年4月16日
发明者D·R·肖勒, J·L·布朗, J·若里克, R·洛拉尔 申请人:诊断混合公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
