专利名称：一种检测牛白血病病毒前dna的试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒及其应用。
背景技术：
流行性牛白血病是由牛白血病病毒(Bovine leukemiavirus, BLV)引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征为淋巴样细胞恶性增生,进行性恶病质和发病后的高死亡率。目前此病几乎遍及全世界各养牛国家，在我国于1976年首次发现于安徽合肥，继而在各省市相继发生。近年来，我国牛群该病血清阳性率逐年攀升，已从4%左右升高至30% 50%。无公害食品奶牛饲养兽医防疫准则(NY 5047 - 2001)和无公害食品肉牛饲养防疫准则(NY5126-2002)均明确规定，一旦牛场发生牛白血�。欢ㄒ笆笔┬刑蕴换胧�。另据文献报道，虽然该病的公共卫生学意义还未有定论，但从统计学意义上讲，感染BLV病毒能增加人罹患乳腺癌的可能性，亟需开展对该病的深入研究和调查。虽然该病已在世界范围内传播,但目前还没有能有效控制或治疗该病的疫苗或方法，因而尽早诊断、及时淘汰病牛便显得尤为重要。现有的诊断方法对于群内BLV感染的普查通常是基于血清学试验如琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验等，血清学试验虽然可以估计BLV在牛群内的流行情况，但是由于BLV病毒的被动抗体和主动感染产生的抗体无法区另O，犊牛的母源抗体和母牛临产和产后的抗体检测会出现假阴性等因素都是血清学检测中的难题，而且血清学方法需要在感染3 16周后才能检测到抗体且抗体检出率很低，所以仅仅依靠抗体检测不能排除BLV感染的可能，也不利于疫病的早发现、早诊断、尽快采取相应措施。因此对于大量样品BLV的筛选、检测、确诊，非常有必要研发出特异性强，灵敏度高，操作相对简便的PCR检测试剂，来确定动物的感染状况。各国为控制该 病的感染采取了种种综合防治措施，包括淘汰、隔离和正确的管理，但这些措施都离不开有效的检测手段。目前，我国现行标准仅有2002年制订的该病琼脂扩散试验的检测方法，尚未制订该病荧光PCR方法的标准，也无针对该病病毒的Taqman荧光PCR试剂盒面世。传统BLV检测一般采用套式PCR扩增、目的片段测序和序列比对的方法，这种方法在PCR技术领域一直被普遍采用，但是其自身的缺点也比较明显费时费力，程序繁琐，步骤复杂，周期长，人工成本高，不利于大量样本的检测；应用于临床基因诊断还存在许多局限性，主要表现在不能准确定量和因交叉污染而易产生假阳性等；且人员要求高，测序的结果需要具有一定专业知识人员进行序列比对才能最终判定结果，而荧光PCR结果判定简单、直观。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测全血中牛白血病病毒前DNA的试剂盒，所述的这种检测牛白血病病毒的试剂盒特异性强、敏感性高、成本低。本发明提供了一种检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒，所述试剂盒含有a)荧光PCR反应液，b)荧光探针，c)热启动Taq酶，d)标准阳性模板，e)阴性对照，所述荧光PCR反应液中含有上、下游引物，其中，上游引物序列如SEQ ID NO :2所示，为Cl:5’ -AACCCCACCTTCCCATGAC-3’ ；下游引物序列如 SEQ ID NO 3 所示，为 C2 :5’ -TGGTAGGAGGTTAATCTGATTGTGAGT-3’ ；其作用是能够特异性扩增BLV前DNA的pol基因片段，所述荧光探针的5’端设计有荧光物质，3’端设计有淬灭物质，序列如SEQ ID NO :4所示，为荧光物质-CAGGCCCTTTCTCGAGCCCTCTG-淬灭物质，所述标准阳性模板的核苷酸插入序列如SEQ IDNO 5所示。检测时所述上、下游引物单条的终浓度为O. 05-1 μ Μ，优选为O. 24 μ M0所述荧光PCR反应液中还含有Mg2+，检测时所述Mg2+的终浓度为1. 5-5. OmM,优选为 2mM。所述荧光PCR反应液中还含有四种dNTPs，包括dATP，dCTP，dGTP，dTTP，检测时所述各种dNTPs的终·浓度分别为O. 1-lmM，优选为O. 25mM。检测时所述荧光探针的终浓度为O. 05-1 μ Μ，优选为O. 2 μ Μ。检测时所述热启动Taq酶的终浓度为O. 01_5U/uL，优选为O. 5U/y L。所述荧光探针的序列5’端的荧光物质为FAM、HEX或VIC中的一种，3’端的淬灭物质为TAMRA。优选地，所述荧光探针的序列为FAM-CAGGCCCTTTCTCGAGCCCTCTG-TAMRA。本发明还提供了一种优选的试剂盒组成，该试剂盒含有由各为O. 3mM的dNTPs，
2.4mM Mg2+，各为O. 288 μ M的上、下游引物组成的所述荧光PCR反应液，2. 5mL/管X2 ;6μΜ荧光探针，200 μ L/管；7. 5U/ μ L热启动Taq酶，200 μ L/管;标准阳性模板，250 μ L/管；阴性对照，250 μ L/管。所述标准阳性模板是由所述上、下游引物对牛白血病病毒前DNA进行PCR扩增获得的的核苷酸片段插入PBS-T载体构建而成的重组质粒。本发明还涉及一种检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒在检测全血中牛白血病病毒前DNA中的应用。其中，上、下游引物与BLV pol基因特异性结合，探针在PCR扩增中释放FAM荧光信号；当荧光PCR仪通过相应的通道采集荧光时，就可以特异性观察到扩增曲线，从而达到检测BLV病毒的目的。该试剂盒使用的具体方法包括以下步骤(I)待检样本的前DNA提�。�(2)荧光PCR检测按照扩增对象数量，取荧光PCR反应液、探针、热启动Taq酶混于一离心管中，震荡，分装，盖上管盖备用；将阴性对照、阳性对照、各样本的DNA加入对应分装管中，各管标记后离心，取出置荧光PCR仪中；(3)结果判定反应液测定Ct值大于40的标本为阴性；Ct值彡35的标本为阳性标本；测定35 < Ct值< 40的标本建议复测，复测结果Ct值< 35为阳性，复测结果Ct值> 35的为阴性。其中，Ct值(Threshould cycle)是指产生可被检测到突光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。该Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
该试剂盒利用牛白血病病毒具有可以整合到宿主细胞中形成前DNA的特性，省去了病毒RNA反转录的步骤，具有便捷、快速、可靠的优点，有利于针对该病流行病学感染情况本底进行调查。本发明和已有技术相比，试剂制备简单、方法简便快捷、特异性强、敏感性高、结果判断容易。可以用于牛白血病病毒的诊断、流行病学和分子生物学研究等多个领域，采用一步法即可以达到牛白血病病毒的快速检测目的，对于该病的鉴别诊断、流行病学调查及其风险评估具有重要的应用价值。
图1是牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛布鲁氏菌、羊胎肾细胞(FLK)等对照样本与BLV阳性病料进行实时荧光PCR检测结果图，可以证实试剂盒的特异性。图2是荧光PCR标准曲线图，将阳性质粒按照10倍梯度稀释，从10-广10-6倍作相同的稀释组共3组进行荧光PCR，可以证实试剂盒的敏感性。图3是荧光PCR图，其中，在37°C储存时间分别为I(T6d的试剂盒对BLV阳性样本进行检测，可以证实试剂盒的稳定性。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述发明，而不是以任何方式限制发明，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利范围之内。实施例1引物及探针的设计与合成BLV的基因组全长在GenBank上登录号为FJ914764. 1，本发明针对的是BLV的pol基因，该基因全长2559bp，编码序列位于BLV全基因的2320 4878bp，序列如SEQ ID NO 1所示。根据BLV pol基因序列设计一对特异性引物如下上游引物Cl :5’ -AACCCCACCTTCCCATGAC-3，；下游引物C2 :5，-TGGTAGGAGGTTAATCTGATTGTGAGT-3，；其作用是能够特异性扩增BLV前DNA的pol基因片段。根据BLV pol基因序列设计荧光探针，其序列如下FAM-CAGGCCCTTTCTCGAGCCCTCTG-TAMRA其中，探针序列5’端的荧光物质除了可选用FAM (羟基荧光素)，还可选自HEX(六氯-6甲基荧光素)或VIC (ABI公司专利)中的一种，同样能够实现本发明的技术效果。其中，荧光探针的一端连接荧光物质，一端连接淬灭物质，并且其DNA链能够与特异性DNA目的片段结合；该对特异性引物在TaqDNA聚合酶作用下一方面进行DNA片段的合成，当到达探针结合位置时，它同时又发挥限制性酶切作用，将探针中连接荧光物质和淬灭物质的DNA链切断，释放荧光物质；当荧光物质游离在反应体系中时，受到激发就可以发出荧光，并被仪器收集到，形成扩增 曲线，从而达到检测BLV病毒的目的。实施例2标准阳性模板的制备
1、取感染牛白血病病毒的血液样本，对其进行DNA提取。该具体步骤可参见AXYGEN公司AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书。详细步骤如下a)取样本200 μ L，加入DNA裂解液Buffer V-L,涡旋震荡混合均匀，静置5min。b)加 75 μ L Buffer V-N,润旋振荡混合均勻，12000 Xg 离心 5min。c)将上清转移到新的2ml离心管中，加300 μ L异丙醇(1%冰乙酸)，上下倒置6 8次，混合均匀。d)将制备管置于2ml离心管中，取步骤3中混合液移入制备管中，6000 Xg离心Imin0e)弃滤液，将制备管置回到于2ml离心管中，加500 μ L Buffer W1A，室温静置Irnin0 12000 X g 离心 lmin。f)弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800μ L Buffer W2，12000Xg离心lmin。g)将制备管置回到2ml离心管中，12000 Xg离心lmin。
h)将制备管置于洁净的1. 5ml离心管中，在制备管膜中央加40 60 μ LBuffer TE,室温静置lmin，室温静置lmin。12000 Xg离心Imin洗脱核酸，-20°C保存备用。2、普通PCR扩增PCR 反应体系如下上、下游引物 Cl、C2(10ymol .171)各 lyL，10XBuffer 2 μ L，
2.5mmol · PdNTP 2 μ L，rTaq DNA聚合酶5U，2 μ L提取的核酸模板，灭菌双蒸水补足体系至 25yL，PCR 循环条件为94°C 5min ；94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，40 循环，72°C IOmin0当PCR结束后在1%的琼脂糖胶上进行电泳，EB染色后在紫外灯下成像。3、阳性质粒的构建在紫外灯下将上述PCR的目的条带取出，按照TAKARA公司DNA胶回收试剂盒的步骤进行回收，取回收产物与PBS-T载体连接，连接反应体系为回收的PCR产物7 μ L，IOX连接Buffer I μ L，pBS-T载体I μ L，T4DNA连接酶I μ L，4°C连接过夜，然后转化DH5 α感受态菌，在IPTG、X-gal诱导下37°C培养12_14h，挑取白斑菌落接种LB液体培养基培养过夜后提取质粒。取重组质粒送Invitrogen公司进行序列测定,并连同已发表的BLV pol基因的核苷酸序列进行比对，确定为该基因阳性质�：螅柿Ｓ米贤夥止夤舛燃平蠥260/A280吸光值测定浓度，_20°C保存备用，即为标准阳性模板。实施例3本试剂盒荧光PCR反应条件的优化1、引物浓度的优化设置单条引物终浓度范围为50-1000nM，用不同浓度梯度的引物进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当每条引物终浓度为O. 24μΜ时
效果最佳。2、Mg2+浓度的优化设置Mg2+终浓度范围为1. 5-5. OmM，结果表明此浓度范围内的Mg2+均能扩增出S型曲线，并且当Mg2+终浓度为2mM时，扩增效果最好。3、dNTPs浓度的优化四种dNTPs等当量混合，设置每种dNTPs终浓度范围为O.1-1mM,结果表明此浓度范围内的dNTPs均能扩增出曲线，并且每种dNTPs终浓度以O. 258mM,即总dNTPs终浓度为1.032mM时为最佳。4、探针浓度的优化设置探针终浓度范围为O. 05-1 μ Μ，用不同浓度梯度的探针进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的引物都可以扩增S型曲线，并且当探针终浓度以O. 2μ M时效果最佳。5、热启动Taq酶浓度的优化设置热启动Taq酶终浓度范围为O. 01-5U/ μ L，用不同浓度梯度的热启动Taq酶进行荧光PCR试验，结果表明此浓度范围的热启动Taq酶都可以扩增S型曲线，并且当热启动Taq酶浓度为O. 5U/ μ L时效果最佳。实施例4根据本发明的一个优选实施例的检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒组成经过上述条件优化之后，根据本发明的一个优选实施例的检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒组成如下a)荧光PCR反应液2管(2. 5mL)包括dNTPs，Mg2+以及引物，反应液中的dATP、dGTP、dCTP和dTTP终浓度分别为O. 3mM、Mg2+终浓度为2. 4mM，引物Cl、C2终浓度分另Ij为O. 288 μ M ;b)探针I管(200 μ L)，浓度为6 μ M ;热启动Taq酶I管(200 μ L)，浓度为7. 5U/y L ;标准阳性模板I管(250μ L/管)，阴性对照I管(250μ L/管)。其中，dNTPs、Mg2+、热启动Taq酶购自TAKARA公司，引物和探针由invitrogen公司合成。本试剂盒采用30 μ L反应体系，反应液组成为突光PCR反应液为25 μ L、酶2 μ L、探针I μ L及模板2 μ L。实施例5根据本发明的一个优选实施例的检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒的使用方法
1、样本处理自行提取DNA，具体步骤可参见AXYGEN公司AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒说明书，阳性对照无需提�。苯蛹友�。2、荧光PCR的检测a)按照检测样品数η (η=待检样品数+2)取PCR反应液、热启动Taq酶和探针混于一离心管中，于涡旋振荡器上振荡，按每管分装，盖上管盖备用。b)现将阴性对照液加入一个分装管中，取各样本的DNA加入对应反应管中；最后取出阳性对照加入另一反应管中，各反应管标记后离心，取出置ABI7500荧光PCR仪中。c)荧光PCR反应条件95°C预变性30sec ;按以下参数循环40次95°C变性5sec、60°C采集荧光34sec。3、质控标准a)阴性对照的Ct值应等于none。b)阳性对照的Ct值应彡25，否则，此实验视为无效。(Ct值应以S型曲线拐点的循环数为准)c)应该同时满足上述2项条件，否则试验无效。4、结果判定反应液测定Ct值均大于40的标本为阴性；Ct值< 35的标本为阳性标本；测定35< Ct ^ 40的标本建议复测，复测结果Ct < 35为阳性，复测结果Ct ^ 35的为阴性。实施例6本发明的检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒的特异性试验取牛病毒性腹泻病毒(种毒AV69)、牛传染性鼻气管炎病毒(种毒AV20)、牛布鲁氏菌、FLK细胞作为4个对照样本(该四种对照样本均购自中国兽医药品监察所)，分别提取DNA,各取2 μ L作为模板进行试剂盒的特异PCR扩增，同时设阴性对照组。PCR扩增条件95°C预变性30Sec，按以下参数循环40次95°C变性5sec、60°C采集突光34sec。荧光PCR结果表明仅BLV前DNA扩增出曲线，而作为对照样本的牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛布鲁氏菌、FLK细胞的DNA均无此扩增曲线出现，如图1所示。实施例7本发明的检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒的敏感性试验将计数后的BLV前DNA阳性质粒大肠杆菌进行10倍梯度稀释，阳性质粒大肠杆菌(3. 2X106 个/mL)按1:10^1 :102，1 103,1 104, 1 :105，1 :106 进行相同的 3 组稀释，抽提DNA。从每个梯度DNA中各取2 μ L模板用荧光PCR试剂盒进行检测。扩增条件同实施例5，同时设阴性对照。通过6个浓度梯度的质粒DNA的荧光PCR反应，作出标准曲线，曲线R值达到了 O. 99以上， 如图2所示。
实施例8本发明的检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒的重复性试验以相同稀释度的标准质粒作为模板，并以10倍梯度稀释成三个不同梯度的模板(I =IO1jI 102, 1 :103)，重复10次反应，结果见下表。表I
权利要求
1.一种检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒，所述试剂盒含有a)荧光PCR反应液，b) 荧光探针，c)热启动Taq酶，d)标准阳性模板，e)阴性对照，其特征在于，所述荧光PCR反应液中含有上、下游引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO :2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 3所示,所述突光探针的序列如SEQ ID NO 4所示,所述突光探针的序列5’端设计有荧光物质，3’端设计有淬灭物质，所述标准阳性模板的核苷酸插入序列如SEQID NO 5所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测时所述上、下游引物单条的终浓度为 O. 05-1 μ Mo
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液中还含有Mg2+，检测时所述Mg2+的终浓度为1. 5-5. OmM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液中还含有四种 dNTPs，检测时所述各种dNTPs的终浓度为O. 1-lmM。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测时所述荧光探针的终浓度为 O. 05_1 u Mo
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测时所述热启动Taq酶的终浓度为 O.01-5U/uL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的序列5’端的荧光物质为FAM、HEX或VIC中的一种，3’端的淬灭物质为TAMRA。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性模板是由所述上、下游引物对牛白血病病毒前DNA进行PCR扩增获得的核苷酸片段插入pBS-T载体构建而成的重组质粒。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有由各为O.3mM的 dNTPs，2. 4mM Mg2+，各为O. 288 μ M的上、下游引物组成的所述荧光PCR反应液，2. 5mL/ 管X 2 ;6 μ M荧光探针，200 μ L/管；7. 5U/μ L热启动Taq酶，200 μ L/管；标准阳性模板， 250 μ L/管;阴性对照，250 μ L/管。
10.根据权利要求1所述的检测牛白血病病毒前DNA的试剂盒在检测全血中牛白血病病毒前DNA中的应用。
全文摘要
本发明提供一种检测牛白血病病毒(BLV)前DNA的试剂盒，所述试剂盒含有a)荧光PCR反应液，b)荧光探针，c)热启动Taq酶，d)标准阳性模板，e)阴性对照，所述荧光PCR反应液中含有上、下游引物，其中上游引物的序列如SEQ ID NO2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO3所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO4所示，所述探针的序列5’端设计有荧光物质，3’端设计有淬灭物质，所述标准阳性模板的核苷酸插入序列如SEQ IDNO5所示。本发明还提供一种该试剂盒在检测全血中牛白血病病毒前DNA中的应用。本发明的PCR检测试剂盒可以快速准确地检测牛白血病病毒，适用于BLV快速诊断、流行病学调查和风险评估。
文档编号G01N21/64GK103045762SQ201210594300
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者李凯航, 鞠厚斌, 刘佩红, 周锦萍, 王建, 陈冈 申请人:上海市动物疫病预防控制中心
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