专利名称：一种细胞染色试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种细胞染色试剂盒，尤其是指一种用于宫颈癌早期诊断和鉴别的细胞染色试剂盒。
背景技术：
宫颈癌是影响妇女健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌而居女性肿瘤的第二位。全世界每年约有50万新发宫颈癌病例，亚洲约38万，中国约15万例，全世界每年约23万妇女死于宫颈癌，亚洲约19万，中国约8万。这个数据显示宫颈癌已成为中国妇女健康的巨大威胁(Ng E 等，CMAL，2004，170 (10): 1545-1549 ;乔友林，2006，26 (12):1293-1295)。宫颈癌中 95% 是鳞状细胞癌(Squmous Cells Carcinoma, SCC)，临床一期的治愈率可达到80 90%，二期时是60 70%，进入三期是40 50%，但发展到四期只有10%的治愈率。因此对宫颈癌前病变包括宫颈上皮内瘤变(Cervical IntraepitheliumNeoplasia, CIN)的防治和早期诊断宫颈癌是控制其发生、发展和预后的关键(Huth WK, JNatl ComprCanc Netw, 2010,8:1329-1330),进一步探索针对宫颈癌早期诊断的特异性检测方法就显得尤为重要。由于宫颈癌常继发感染伴有明显的炎症反应，在H&E染色中癌细胞常淹没在炎症细胞中难以辨认,或H&E染色中癌细胞质为红色,核为蓝色，而红细胞常为红色，炎症细胞为蓝色，使寻找癌细胞较为困难，容易漏诊。现有细胞染色试剂盒设计复杂，试剂瓶大小不一，取用不方便，操作复杂，染色效率低，有时试剂瓶为玻璃等易碎材质制成。
发明内容本实用新型的目的是提供一种设计合理、结构简单、取用方便、染色效率和细胞的辨别率高的细胞染色试剂盒。为了达到上述目的，本实用新型提供了一种细胞染色试剂盒，其特征在于，包括外包装纸盒，所述的外包装纸盒中设有无花果叶提取液包装试剂瓶、碱性染料包装试剂瓶、酸性染料包装试剂瓶和细胞核染色试剂包装试剂瓶。所述的外包装纸盒为方体结构，包括盒体以及盒盖，盒盖与盒体活动连接。盒盖可掀开。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶、碱性染料包装试剂瓶、酸性染料包装试剂瓶和细胞核染色试剂包装试剂瓶皆包括瓶体及瓶盖，瓶体和瓶盖紧密结合。四种试剂瓶均为塑料材质。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶、碱性染料包装试剂瓶、酸性染料包装试剂瓶和细胞核染色试剂包装试剂瓶的试剂体积规格皆为10(T500mL。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶、碱性染料包装试剂瓶、酸性染料包装试剂瓶和细胞核染色试剂包装试剂瓶的试剂体积规格相同。[0011]本实用新型的细胞样本可以是细胞涂片或组织切片。其中细胞涂片可以是细胞手工涂片或液基膜式薄层细胞学涂片，组织切片可以是冰冻切片或石蜡切片本实用新型设计合理，结构简单，取用方便，可以对细胞在保持形态的基础上增加了不同颜色鉴别，该项技术具有颜色区别和细胞形态分析的双重功能，本实用新型染色的反应速度快，操作步骤简单，耗时短，同时能满足筛选非典型细胞所需的技术要求，为宫颈癌早期诊断和鉴别诊断提供了有效的工具。本实用新型首次采用四种试剂体积规格一致的细胞染色试剂包装试剂瓶，包装简洁，克服了传统细胞染色试剂盒试剂瓶试剂体积规格不一，取用容易出错的缺点。同时，本实用新型采用塑料材质的试剂瓶，不易破碎，克服了传统试剂盒有时采用玻璃等易碎材质试剂瓶的缺点，大大提高了安全性和可靠性。
图1是本实用新型的结构示意图。图中:1、无花果叶提取液包装试剂瓶；2、碱性染料包装试剂瓶；3、酸性染料包装试剂瓶；4、细胞核染色试剂包装试剂瓶；5、外包装纸盒。
具体实施方式
为使本实用新型更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。实施例1如图1所示，本实用新型的细胞染色试剂盒，包括外包装纸盒5，所述的外包装纸盒5中设有无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4。所述的外包装纸盒5为方体结构，包括盒体以及盒盖，盒盖与盒体活动连接。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4皆包括瓶体及瓶盖，瓶体和瓶盖紧密结合。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4的试剂体积规格皆为100mL。碱性染料为新品红，酸性染料为亮绿，细胞核染色试剂为Harris苏木素。使用方法如下:(I)将细胞涂片于质量浓度为10%的三氯乙酸溶液中固定60min，用去离子水洗涤IOsec0(2)用Harris苏木素对细胞核进行染色6min，用自来水冲洗Imin后，用去离子水洗30sec,再浸入去离子水lOsec。(3)用无花果叶提取液孵育3min，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(4)用新品红染色液孵育lmin，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(5)用亮绿染色液孵育3min，用去离子水洗30sec，再浸入去离子水lOsec。(6 )晾干，用中性树胶封片。实施例2如图1所示，本实用新型的细胞染色试剂盒，包括外包装纸盒5，所述的外包装纸盒5中设有无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4。所述的外包装纸盒5为方体结构，包括盒体以及盒盖，盒盖与盒体活动连接。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4皆包括瓶体及瓶盖，瓶体和瓶盖紧密结合。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4的试剂体积规格皆为500mL。碱性染料为新品红，酸性染料为亮绿，细胞核染色试剂为Harris苏木素。使用方法如下:(I)将细胞涂片于质量浓度为10%的三氯乙酸溶液中固定60min，用去离子水洗涤IOsec0(2)用Harris苏木素对细胞核进行染色6min，用自来水冲洗Imin后，用去离子水洗30sec,再浸入去离子水lOsec。(3)用无花果叶提取液孵育3min，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(4)用新品红染色液孵育lmin，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(5)用亮绿染色液孵育3min，用去离子水洗30sec，再浸入去离子水lOsec。(6 )晾干，用中性树胶封片。实施例3一、试剂盒及试剂的制备方法:如图1所示，本实用新型的细胞染色试剂盒，包括外包装纸盒5，所述的外包装纸盒5中设有无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4。所述的外包装纸盒5为方体结构，包括盒体以及盒盖，盒盖与盒体活动连接。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4皆包括瓶体及瓶盖，瓶体和瓶盖紧密结合。所述的无花果叶提取液包装试剂瓶1、碱性染料包装试剂瓶2、酸性染料包装试剂瓶3和细胞核染色试剂包装试剂瓶4的试剂体积规格皆为300mL。所述的无花果叶提取液通过将无花果叶提取物(10:1)(购自西安斯诺特生物
技术有限公司)溶解在体积浓度为70%的乙醇溶液中配制得到，其中无花果叶提取物的终浓度为 30% (w/v)0所述的碱性染料为新品红染色液(New Fuchsin solution),通过将新品红粉末(购自美国Sigma公司)溶解在体积浓度为20%的酒精溶液中配制得到，其中新品红的终浓度为0.5% (w/v)，使用前静置避光24 h。所述的酸性染料为亮绿染色液(Light Green solution),通过将亮绿粉末(购自美国Merck公司)溶解在体积浓度为20%的酒精溶液中配制得到，亮绿的终浓度为0.4%(w/V),使用前静置避光24 ho所述的细胞核染色试剂为Harris苏木素染色剂，采用常规方法配制。其它试剂包含10%三氯乙酸溶液(Trichloroacetic acid, TCA)和乙醇溶液，皆采用常规方法配制。[0046]二、病例来源:病例600例阴道细胞涂片分别来自南通大学附属肿瘤医院、昆山市第一人民医院、如东县人民医院、南通市八仙花苑社区杏林妇科病诊所，其中手工涂片440例，TCT涂片160例。分别对手工涂片和TCT涂片用本实用新型试剂盒染色和H&E染色，对涂片诊断的宫颈SCC和高级别上皮内瘤变CIN3病例进一步手术活检确诊。三、染色:步骤1、涂片准备:(I)手工涂片440例，每例涂4片，其中2片采用喷雾细胞固定(Spray CYT0FIX )，分别用步骤2中本实用新型试剂盒染色和步骤3中H&E染色，另外2片采用体积浓度为95%的乙醇溶液固定，分别用步骤2中本实用新型试剂盒染色和步骤3中H&E染色。喷雾细胞固定(Surgipath Medical Industries,INC.P.0.BOX 528/5205 Rte.12 Richmond,IL60071)在手工涂片完成2-5seC内，距离涂片30cm从左至右均匀喷至整个细胞区，重复3次，喷雾固定IOmin自然晾干。乙醇固定:手工涂片完成后将玻片浸入体积浓度为95%的乙醇溶液IOmin以上，自然晾干。(2) TCT涂片160例，宫颈刷刷到细胞后浸入体积浓度为95%的乙醇溶液10 min以上，待细胞离心后经TCT仪(ZP-b膜式，湖北孝感宏翔生物医械技术有限公司)每例制备2张TCT涂片，分别用步骤2中本实用新型试剂盒染色和步骤3中H&E染色。步骤2、使用本实用新型试剂盒染色如下(手工涂片和TCT涂片步骤相同):(I)将细胞涂片于质量浓度为10%的三氯乙酸溶液中固定60min，用去离子水洗涤IOsec0(2)用Harris苏木素对细胞核进行染色9min，用自来水冲洗Imin后，用去离子水洗30sec,再浸入去离子水lOsec。(3)用无花果叶提取液孵育3min，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(4)用新品红染色液孵育lmin，用去离子水洗lmin，再浸入去离子水lOsec。(5)用亮绿染色液孵育lmin，用去离子水洗30sec，再浸入去离子水lOsec。(6)晾干，用中性树胶封片，染色完成后4°C存放、尔后观察。步骤3、H&E染色:手工涂片按常规操作方法分别用Harris苏木素染色剂染色细胞核，用伊红染色剂染色细胞质。TCT涂片按液基仪器预先设计的程序自动化控制染色。步骤4、组织切片染色:对涂片诊断的宫颈SCC和高级别上皮内瘤变CIN3病例进一步手术活检，标本经质量浓度为4%的甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片4 y m厚，采用与步骤2和步骤3相同的方法分别进行本实用新型试剂盒染色和H&E染色，进行病理诊断。四、观察:在10倍镜下仔细观察本实用新型试剂盒染色涂片，平均每个视野至少有8个细胞。20倍和40倍镜下观察任何可疑或成簇细胞，特别关注红染或紫染细胞。对于几项检查进行95%可信区间(Confidence Intervals, Cl)估价,采用公式:敏感性=真阳性病例/ (真阳性病例+假阴性病例)X100% ;特异性=真阴性病例/ (真阴性病例+假阳性病例)X100%。五、结果:1、本实用新型试剂盒染色阴道细胞的形态和颜色表现:[0066]在手工涂片和TCT涂片中本实用新型试剂盒染色阴道细胞较好的显示了细胞的形态学特征，细胞轮廓清晰，细胞膜完整(有时可出现〈20%的细胞丧失了膜的完整性，但未见胞质溢出)。同时各类细胞显示的颜色和形态密切相关。在手工涂片440例中诊断为宫颈SCC 14例、CIN58例(CIN3:21例，CIN1-2:37例)、炎症改变(包括霉菌、滴虫感染等)328例和相对正常细胞40例。TCT涂片160例中宫颈SCC 18例、CIN 58例(CIN3:23例，CIN1-2:35例)、炎症改变(包括霉菌、滴虫感染)75例和相对正常细胞9例。(I)正常上皮细胞浅表鳞状上皮细胞包括基底细胞、中间细胞和成熟细胞。从基底细胞到成熟细胞的细胞形状是从椭圆形到多边形，细胞单核从大到�。赴蚀由俚蕉唷１臼涤眯滦褪约梁腥旧笳５ジ隽圩聪赴�(非成团细胞)胞质为蓝色或绿色。萎缩鳞状细胞通常是中间细胞的5倍。自溶可能导致裸核。本实用新型试剂盒染色后细胞核呈红粉色，细胞质绝大多数是蓝色或者绿色。化生的鳞状细胞椭圆形，本实用新型试剂盒染色后细胞核大多数呈红粉色，细胞质呈蓝色/绿色或者红粉色。在成团宫颈鳞状细胞(多于5个细胞)中，多数外周细胞胞质和胞核为绿色或蓝色，细胞团中心细胞为粉红色或红色。子宫颈管上皮细胞立方形，核圆较�。噬伲赴赏排帕小１臼涤眯滦褪约梁腥旧蟀屎秃顺氏屎焐�(2)不典型细胞与癌细胞不典型细胞往往出现在重度炎症或CIN的病灶中，后者进一步分为低级别CIN1-2和高级别CIN3。炎症中不典型细胞的主要特点为核增大，约为中间细胞核的2.5 3倍，但核染色质或核形态规则。CIN1-2细胞核增大至中间细胞核的3倍以上，核染色质分布均匀呈粗颗粒状，或密集深染，常无核仁或不显著。CIN3细胞大小不一、核异形，常见显著的核裂或凹槽，核染色质可细腻或粗糙(颗粒状)，核仁缺如或偶见。SCC细胞与CIN3特征相似，但核异型更明显，常出现大核仁或裸核，细胞核染色质分布不均、粗糙块状。癌细胞的背景中常伴有较多的红细胞，提示由癌细胞侵袭所致的出血。经本实用新型试剂盒染色后不典型细胞与癌细胞胞质和胞核均呈红色。(3)炎症细胞和红细胞炎症细胞核较小分叶状，细胞质少或缺失，胞核呈红色(有时可呈蓝色或绿色〈20%),炎症细胞胞质为蓝色或绿色。红细胞胞质均呈绿色。2本实用新型试剂盒染色与H&E染色的比较:(I)在手工涂片和TCT涂片中分别比较本实用新型试剂盒染色和H&E染色的诊断结果(表I)表I本实用新型试剂盒染色和H&E染色比较
权利要求1.一种细胞染色试剂盒，其特征在于，包括外包装纸盒(5)，所述的外包装纸盒(5)中设有无花果叶提取液包装试剂瓶(I)、碱性染料包装试剂瓶(2)、酸性染料包装试剂瓶(3)和细胞核染色试剂包装试剂瓶(4)。
2.如权利要求1所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，所述的外包装纸盒(5)为方体结构，包括盒体以及盒盖，盒盖与盒体活动连接。
3.如权利要求1所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，所述的无花果叶提取液包装试剂瓶(I)、碱性染料包装试剂瓶(2)、酸性染料包装试剂瓶(3)和细胞核染色试剂包装试剂瓶(4)皆包括瓶体及瓶盖，瓶体和瓶盖紧密结合。
4.如权利要求1所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，所述的无花果叶提取液包装试剂瓶(I)、碱性染料包装试剂瓶(2)、酸性染料包装试剂瓶(3)和细胞核染色试剂包装试剂瓶⑷的试剂体积规格皆为100 500mL。
5.如权利要求1所述的细胞染色试剂盒，其特征在于，所述的无花果叶提取液包装试剂瓶(I)、碱性染料包装试剂瓶(2)、酸性染料包装试剂瓶(3)和细胞核染色试剂包装试剂瓶(4)的试剂体积规格相同。
专利摘要本实用新型提供了一种细胞染色试剂盒，其特征在于，包括外包装纸盒，所述的外包装纸盒中设有无花果叶提取液包装试剂瓶、碱性染料包装试剂瓶、酸性染料包装试剂瓶和细胞核染色试剂包装试剂瓶。本实用新型设计合理、结构简单、取用方便、染色效率和细胞的辨别率高的细胞染色试剂盒。
文档编号G01N1/30GK203011760SQ201220530919
公开日2013年6月19日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者朱远源, 陈莉, 李铁军, 吴美华 申请人:百奥迈科生物技术有限公司
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