专利名称：多残留金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学领域，涉及快速检测食品中氨基糖苷类抗生素庆大霉素残留的试剂盒和方法。
背景技术：
自2008年以来，乳制品的安全问题在全国乃至全世界造成了巨大的影响，不仅广大消费者的权益受到了损害，整个乳制品行业包括众多的奶农的利益也受到了巨大损害。 乳制品行业的食品安全问题已经严重关系到了我国的国计民生，急需解决。乳制品的安全， 既需要从源头开始，通过各项规章制度对质量进行层层控制，也需要各种检测技术进行层层把关。由于乳制品生产涉及的原料数量巨大、来源众多，因此如何实现对大量原料奶样品准确快速的筛�。悄壳凹觳饧际跫毙柰黄频哪训阒�。
另一方面，因抗生素种类的增多以及细菌耐药性的增强，目前用于奶牛疾病预防和治疗中的药物种类也大大增多，使得原料奶中的药物残留除了常见的β_内酰胺类抗生素外，氟喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素的残留比例也大大增加。这些药物残留对人体同样存在着安全隐患，如氟喹诺酮类药物在人体内的残留易引起人体神经系统不良反应， 严重时还会诱发癫痫�。橛星痹诘拇呋饔茫被擒绽嘁┪镌蚓哂卸拘院蜕鲈喽拘裕芩鸷δ陨窬⒍仙窬嵴咛ο陆担卣哂谰眯远岫越松銮苡兴鸷Γ� 造成血尿、肾功能衰退等，此外，这些药物的长期服用还易引起细菌耐药性。因此，在原奶收购环节，急需一种可以快速检测多种抗生素残留的方法以帮助检验机构和企业节约时间、 降低成本、提高效率。
目前，针对氟喹诺酮和氨基糖苷类抗生素的检测方法多是酶联免疫吸附反应 (ELISA)、高效液相色谱(HPLC)或液质联用(LC-MS/MS)等方法。这些方法作为一种实验室常规方法具有准确、灵敏度高、重复性好等特点，然而，由于存在对设备、环境、操作技能等要求，检测周期较长、价格昂贵，因而其检测主要集中在大型科研检测机构或大型企业实验室里，不适合中小企业和众多奶站的大规模样本筛选使用。在快速检测方面，现有的快速检测方法主要集中β -内酰胺类抗生素检测上，比如UNISENS0R、β -STAR、ROSA、SNAP等，而针对氟喹诺酮和氨基糖苷类抗生素的快速检测产品则几乎没有，并且这些方法均是仅针对一种抗生素进行检测，由于牛奶抗生素检测指标较多，单个检测指标的方法则意味着一个原奶样本就需要使用多个检测产品进行多次检测，既耗费了时间，也浪费了人力、财力。因此急需开发多指标快速检测方法以满足日益增加的检测需求。发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种能够同时检测食品中多种抗生素残留检测试剂盒及其检测方法和应用；发明主要目的在于克服传统的检测方法繁琐，检测耗时长，在实际工作中应用局限性大等缺陷，同时改变了单一项目检测和多种检测项目简单的合并检测的局面，从而提供一种更加快速、简捷、性价比高、安全的检测试剂盒及其检测方法。
食品中多残留金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括检测条和塑料卡壳，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。所述金标抗体结合垫是由胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体、胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体和胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体组成；所述硝酸纤维素膜中部包被有检测线和控制线，检测线设置有能与金标抗体结合垫上三种单克隆抗体进行特异性结合的蛋白偶联物，蛋白偶联物分别为环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物，控制线设置有羊抗鼠 IgG单克隆抗体。
所述金标抗体结合垫上的胶体金标记庆大霉素单克隆抗体由庆大霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合在一起；
胶体金标记卡那霉素单克隆抗体由卡那霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合在一起；
胶体金标记氟喹诺酮类单克隆抗体由氟喹诺酮类单克隆抗体与60nm的胶体金颗粒结合在一起。
所述硝酸纤维素膜上检测线的环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物的包被浓度分别为O. 08,0. 13和O. 15mg/mL，包被量均为I μ L/cm ；
控制线上包被羊抗鼠IgG单克隆抗体，浓度为lmg/mL，包被量为I μ L/cm。
一种多残留金标快速检测试剂盒的制备方法阐述如下
I)金标抗体结合垫的制备
a.空白胶体金的制备
采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，通过调节氯金酸和柠檬酸三钠加入量制备胶体金颗粒大小为25nm和60nm的胶体金溶液。炼制过程中溶液的颜色会发生变化，当溶液的颜色不再发生变化时保持沸腾状态IOmin后将烧瓶置于室温，充分冷却后，取出反应用的转子，胶体金溶液4°C冷藏保存，保质期为I个月；
b.金标抗体重悬液的配制
第一步用分析天平称取Tris O. 605g,加入IL烧杯中。
第二步用分析天平称取蔗糖25. OOOg,加入以上烧杯中。
第三步500mL量筒量取纯水500mL，加入上述烧杯中，使其充分溶解。
第四步于磁力搅拌器上温和搅拌，使各组份充分溶解、混匀。
第五步将上述液体用4mol HCl调节pH值至8. 2±0.1。
第六步用分析天平称取牛血清白蛋白(BSA) 5. 000g，加入以上烧杯中
第七步再次于磁力搅拌器上温和搅拌，使BSA充分溶解、混匀。
第八步将上述液体用O. 22 μ m微孔滤膜无菌过滤，过滤后的液体装入500mL试剂瓶中，贴签，4 °C备用，保存有效期2个月。
c.胶体金标记抗体的制备
分别取金颗粒大小为25nm或60nm的胶体金溶液IOOmL,在搅拌状态下加入0.1M 碳酸钾150 200 μ L,保持7 10分钟后,缓慢加入相应单克隆抗体进行抗体的金标记， 继续搅拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之终浓度达到0. 4%，持续搅拌30min，最后离心，吸除上清，用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充分重悬；整个反应温度控制室温。
庆大霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒溶液进行标记，标记量为3 μ g/mL ；卡那霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒溶液进行，标记量为3 μ g/mL ;氟喹诺酮类单克隆抗体使用60nm的胶体金颗粒溶液进行标记,标记量为5 μ g/mL。
d.金标抗体结合垫的制备
将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为lcm*30cm的玻璃纤维素膜上， 包被量为2mL/30cm，37°C干燥过夜，密封避光干燥处保存；
2)硝酸纤维素膜上T、C线的包被
a.庆大霉素-蛋白偶联物的制备
称取40mg庆大霉素硫酸盐和IOmgBSA,分别溶解于ImL的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到庆大霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2h以上。取120mgEDC -HCl溶于 ImL蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌Ih以上，然后于4°C放置过夜。 用PBS透析3天后，分装，-20°C贮存。
b.卡那霉素-蛋白偶联物制备
称取卡那霉素硫酸盐28mg和BSA14mg分别溶于500 μ L蒸懼水中，混合后于磁力搅拌器上搅拌。取76mgEDC. HCl溶于ImL蒸馏水中，再逐滴加入到上述混合溶液中，在室温下搅拌过夜。用O. OlMPBS透析3次以上，离心分装，-20°C贮存。
c.环丙沙星-蛋白偶联物的制备称取20mg环丙沙星盐酸盐、IOmgNHS和12. 5mg EDC · HCl充分溶解于ImL 二甲基甲酰胺(DMF)中，于室温下搅拌24h，得到环丙沙星(CPLX)反应液。再称取BSA 50mg，使之充分溶解在3mL PBS (pH值7. 4)中，将CPLX反应液逐滴缓慢滴加到该BSA溶液中，并于室温下搅拌3h，然后用PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以 3000r / min离心20min，收集上清，并分装-20°C贮存。
d. T、C线的包被
调试好二维喷点平台，将配制好的三种蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为控制线，37° C干燥 2h，密封避光干燥处保存；
硝酸纤维素膜上包被有三条检测线和一条控制线，三条检测线中Tl线为环丙沙星-BSA偶联物、T2线为庆大霉素-BSA偶联物、T3线为卡那霉素-BSA偶联物，其包被浓度分别为O. 08,0. 13和O. 15mg/mL，包被量均为I μ L/cm ;控制线上包被羊抗鼠单克隆抗体，浓度为lmg/mL,包被量为I μ L/cm。
3)试纸条的组装
将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条，试纸条固定在塑料卡壳内。
应用本发明试剂盒检测食品中庆大霉素残留，包括以下步骤
一、牛奶样本操作
在进行检测前先完整阅读使用说明书；
脱脂取l-2mL奶样于离心管中，2000 X g (相当于5000rpm),离心IOmin,去除上层脂肪部分；
吸取脱脂奶样100 μ L于试管中，再加入100 μ L样品稀释液，混匀。
用塑料滴管吸取待测溶液，垂直滴加4滴于检测卡的加样孔中，加样同时开始计时；
10-15分钟即可进行结果判读，30分钟后结果无效。
二、结果判断
读取结果时，检测卡应如图所示摆放方式置于观察者的正面。请勿从检测卡侧面或倒置检测卡进行结果观察。(Tl线检测氟喹诺酮类、T2线检测庆大霉素、T3线检测卡那霉素)
阴性T线(检测线，靠近加样孔一端)和C线(对照线，最上端)均显色，判断为阴性，表示牛奶样品中氨基糖苷类药物和氟喹诺酮类药物浓度低于说明书中规定的最低残留检测限。
阳性C线显色，只要出现T线不显色的结果，判断相对应检测药物的残留量超过说明书规定的检测限，判定为阳性；
无效C线未显色，表明不正确的操作过程或检测条已失效。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的检测条重新测试。如问题仍然存在，应停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。
三、特异性
本产品与链霉素、新霉素、大环内酯类、内酰胺类、四环素类、氯霉素和磺胺类等其他药物的交叉反应率〈O. 1%。
四、储存及有效期
本产品应在室温下、阴凉避光干燥处保存，切勿冷冻，有效期12个月。批号及生产日期见包装盒。
本发明试剂盒的技术原理如下
根据抗原抗体反应原理，进行抗体胶体金的有效标记，同时在硝酸纤维素膜上依次划制环丙沙星、庆大霉素和卡那霉素-蛋白偶联物，偶联物与样本中的氟喹诺酮类、卡那霉素以及庆大霉素残留物共同竞争胶体金标记氟喹诺酮类、庆大霉素和卡那霉素单克隆抗体形成有效的竞争抵制反应作为检测线，羊抗鼠抗体作为控制线。在层析过程中阳性样本中的目标物与金标结合垫上金标复合物进行结合，当层析到检测线时，游离的金标抗体与与检测线上蛋白偶联物相结合，同时由于抗原抗体的反应为可逆反应，蛋白偶联物还竞争已与目标物结合的金标抗体从而被检测线捕获显色，样本中目标物越多检测线显色就越浅，当样本中的目标物达到一定浓度时，检测线由于捕获不到金标抗体不再显色；多余的金标复合物继续层析，达到控制线时与包被有羊抗鼠抗体的控制线捕获显色。
有益效果
该试剂盒是将小分子兽药氨基糖苷类药物中最常见的庆大霉素、卡那霉素和氟喹诺酮类通过胶体金免疫层析技术实现对乳制品中多种残留物质的快速检测，主要通过对样本进行简单的前处理，在IOmin内即可实现多种残留物质的残留检测。该试剂盒具有以下特点
I.前处理简单只需二步就可实现对乳制品的检测，一离心、二倍比稀释；
2.检测时间短在10_20min内即可实现对氟喹诺酮类、庆大霉素和卡那霉素的残留检测；
3.检测成本低相对于仪器、ELISA以及各个检测项目的单独操作检测，多残留检测的所需检测费用更低；
4.适用范围广由于试剂盒对操作环境要求不高同时无昂贵仪器要求，可用于实验室和野外以及现场的检测；
5.人员要求低由于在整个检测过程中需用的仪器及试剂较少，对实验人员的专业要求不高，整个操作过程简单，检测结果肉眼就能进行判读；
6.安全性较高试剂盒内无任何有毒有害物质。
本发明所研究的多残留金标快速检测试剂盒，实现了对乳制品中多种抗生素的残留检测，其检测时间短，检测成本低，检测范围广；检测灵敏度符合国家和欧盟标准。因此， 它符合国家对食品安全与出入境检验检疫中检测技术的发展要求，有利于提高食品安全与出入境检验检疫工作的效率与准确率，有利于保证食品安全与进出口贸易，从而在公共安全领域发挥重要作用。
图1 :试剂盒检测过程示意图
图2:检测结果判定方法；
图3:实际结果的判定；
图4:实际结果的判定
图5:试剂盒结构示意图·具体实施方式
以下对本发明做进一步的的具体实施说明
实施例I试剂盒的灵敏度实验
一、检测样本
随机抽取20份经《农业部1163号公告_7_2009动物性食品中庆大霉素残留检测高效液相色谱法》方法、《GB/T 22969-2008奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法》方法和《GB/T 21312-2007动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》方法检测过不含有这类物质的阴样进行灵敏度检测实验。
二、污染样本的制备
1.标准品溶液的配制
分别配制庆大霉素和卡那霉素混合标准溶液，终浓度为庆大霉素10 μ g/mL、卡那霉素10 μ g/mL ;分别配制8种氟喹诺酮类药物的标准溶液，如恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星等，溶液的浓度均为5 μ g/mL。
2.样品添加
取20份阴性奶样，每份奶样分为4组一组作为空白对照；一组按照ImL奶样 +5 μ L准溶液进行添加；一组按照ImL奶样+10 μ L标准溶液进行添加；一组按照ImL奶样 +15 μ L标准溶液进行添加。每组每份奶样制备体积为7mL。按此方法配制成的奶样，其中所含氨基糖苷类各药物依次为庆大霉素和卡那霉素0、0. 050,0. 100和O. 150 μ g/mL, 8种氟喹诺酮类药物的含量分别为0,0. 025,0. 050和O. 075 μ g/mL。
三、灵敏度实验
取上述制备好的80份污染奶样，分别使用三个不同批号的多残留金标快速检测试剂盒进行检测，每份奶样重复检测3次，检测方法依据试剂盒说明书。以95%出现阳性结果的最低浓度作为试剂盒的检测灵敏度。
20份奶样不同浓度添加样本的检测结果见表I、表2和表3。结果表明，庆大霉素和卡那霉素的检测灵敏度为O. 100 μ g/mL，8种氟喹诺酮类药物的检测灵敏度为O. 050 μ g/mLo
表I多残留金标快速检测试剂盒检测庆大霉素残留的检测结果
权利要求
1.一种多残留金标快速检测试剂盒，所述试剂盒包括检测条和塑料卡壳，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成；其特征在于所述金标抗体结合垫是由胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体、胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体和胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体组成；所述硝酸纤维素膜中部包被有检测线和控制线，检测线设置有能与金标抗体结合垫上三种单克隆抗体进行特异性结合的蛋白偶联物，蛋白偶联物分别为环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物，控制线设置有羊抗鼠IgG单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述金标抗体结合垫上的胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体由庆大霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合组成。
3.根据权利要求I所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体由卡那霉素单克隆抗体与25nm的胶体金颗粒结合组成。
4.根据权利要求I所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体由氟喹诺酮类单克隆抗体与60nm的胶体金颗粒结合组成。
5.根据权利要求I所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述硝酸纤维素膜上检测线 环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物的包被浓度分别为0.08,0. 13 和 0. 15mg/mL，包被量均为 I u L/cm。
6. 根据权利要求I所述的一种多残留金标快速检测试剂盒，所述控制线上包被羊抗鼠IgG单克隆抗体,浓度为lmg/mL,包被量为Iy L/cm。
7.根据权利要求I所述的一种多残留金标快速检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤 1)金标抗体结合垫的制备 a.空白股体金的制备 采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，通过调节氯金酸和柠檬酸三钠加入量制备颗粒大小为25nm和60nm的胶体金溶液； b.金标抗体重悬液的配制； c.胶体金标记抗体的制备 分别取金颗粒大小为25nm或60nm的胶体金溶液IOOmL,在搅拌状态下加入0. IM碳酸钾150 200 u L,保持7 10分钟后,缓慢加入相应单克隆抗体进行抗体的金标记,继续搅拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之终浓度达到0. 4%，持续搅拌30min，最后离心，吸除上清，用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充分重悬；整个反应温度控制室温； 庆大霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒进行标记，标记量为3 y g/mL ;卡那霉素单克隆抗体使用25nm的胶体金颗粒进行，标记量为3 y g/mL ;氟喹诺酮类单克隆抗体使用60nm的胶体金颗粒进行标记,标记量为5 u g/mL ； d.金标抗体结合垫的制备 将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为lcm*30cm的玻璃纤维素膜上，包被量为2mL/30cm，37°C干燥过夜，密封避光干燥处保存； 2)硝酸纤维素膜上T、C线的包被 a.庆大霉素-蛋白偶联物的制备称取40mg庆大霉素硫酸盐和IOmgBSA,分别溶解于ImL的蒸馏水中，将BSA溶液逐滴加入到庆大霉素溶液中，室温下于磁力搅拌器上搅拌2h以上；取120mg EDC HCl溶于ImL蒸馏水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室温下继续搅拌Ih以上，然后于4°C放置过夜；用PBS透析3天后，分装，-20°C贮存； b.卡那霉素-蛋白偶联物制备 称取卡那霉素硫酸盐28mg和BSA14mg分别溶于500ul蒸懼水中，混合后于磁力搅拌器上搅拌。取76mgEDC HCl溶于ImL蒸馏水中，再逐滴加入到上述混合溶液中，在室温下搅拌过夜。用0. OlMPBS透析3次以上，离心分装，-20°C贮存； c.环丙沙星-蛋白偶联物的制备 称取20mg环丙沙星盐酸盐、IOmgNHS和12. 5mgEDC HCl充分溶解于ImLDMF中，于室温下搅拌24h，得到CPLX反应液。再称取BSA 50mg，使之充分溶解在3mL PBS，pH值7. 4，将CPLX反应液逐滴缓慢滴加到该BSA溶液中，并于室温下搅拌3h，然后用PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以3000r / min离心20min,收集上清,并分装-20°C贮存； d.T、C线的包被 调试好二维喷点平台，将配制好的三种蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为控制线，37°C干燥2h，密封避光干燥处保存； 硝酸纤维素膜上包被有三条检测线和一条控制线，三条检测线为环丙沙星-BSA偶联物、庆大霉素-BSA偶联物、卡那霉素-BSA偶联物，其包被浓度分别为0. 08,0. 13和0. 15mg/mL,包被量均为I ii L/cm ;控制线上包被羊抗鼠单克隆抗体,浓度为lmg/mL,包被量为I y L/cm ； 3)试纸条的组装 将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，将贴好的底板在切条机上切割成宽为4_的试纸条,试纸条固定在塑料卡壳内。
8.如权利要求1-6任一所述的多残留金标快速检测试剂盒在食品检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了多残留金标快速检测试剂盒及其检测方法和应用，属于免疫学领域。本发明试剂盒主要包括多残留金标快速检测卡，所述检测卡包括检测条和塑料卡壳，所述检测条是由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成；所述金标结合垫是由胶体金标记的庆大霉素单克隆抗体、胶体金标记的卡那霉素单克隆抗体和胶体金标记的氟喹诺酮类单克隆抗体组成；所述硝酸纤维素膜中部包被有检测线和控制线，检测线设置蛋白偶联物，控制线是羊抗鼠IgG单克隆抗体。本发明为快速检测试剂盒，仅需通过简单的前处理就能实现多种残留物质的同时检测，整个操作过程简单、携带方便、结果判定快速、准确，适用于现场监控和大量样本的定性筛查。
文档编号G01N33/577GK102980980SQ20121042774
公开日2013年3月20日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者唐慧林, 何艳玲, 于重楠, 刘敏, 王丽丽, 王丽哲, 赵瑜 申请人:北京陆桥技术有限责任公司
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