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专利名称：对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米结构的荧光化学传感器领域，特别涉及对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器及其制备方法，以及该化学传感器的应用。
背景技术：
1987年发现一氧化氮在体内由内皮释放产生，在人体的免疫反应中，它是心血管系统和神经系统中重要的信息传输者。自此，一氧化氮的生理作用引起了许多生物学家以及化学家的关注。目前，应用于一氧化氮的检测手段很多，主要有电化学法以及电子顺磁共振波谱法等。但是以上方法由于低的空间分辨率，甚至需要较为复杂的仪器，这使得其在细胞成像中的应用得到了限制。然而荧光技术因为自身的高的灵敏度和高的空间 分辨率，使得它在细胞内以及细胞外一氧化氮成像中显示出了极大的优势。文献中已经报道了多种可用于一氧化氮荧光成像的试剂，如Yang Y J, J. Am. Chem. Soc. 2010,132,13114 ；Lippard S J, Acc. Chem. Res. 2007,40,41 ；Lim M H, Nature Chem. Biol. 2006，2，375 ；Duarte AJ, Sensors, 2010,10，1661。然而这些方法在使用中都有一些局限性，最为广泛使用的试剂就是二氨基荧光素衍生物，它不仅与一氧化氮反应，细胞内释放的其它分子也会参加反应。并且大部分报道的成像试剂都需要在有机溶剂中使用， 这有可能会引起细胞发生病变。这些成像试剂存在的其它局限性还包括易于光漂白、难于合成以及在使用中需要水解等。因此合成可以应用于生物体系中一氧化氮检测的合适的荧光试剂具有非常重要的意义。

发明内容
本发明的目的之一是提供对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器。本发明的目的之二是提供对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器的制备方法。本发明的目的之三是提供对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器在生物检测方面的应用。本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器是由 3_氨基丙基三乙氧基硅烷和进行了表面清洗的硅纳米线或硅纳米线阵列反应得到的表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列，与戊二醛反应得到表面修饰有醛基的硅纳米线或硅纳米线阵列(硅纳米线或硅纳米线阵列上的氨基与戊二醛反应)，经还原(以硼氢化钠作为还原剂)修饰在硅纳米线或硅纳米线阵列上由硅纳米线或硅纳米线阵列上的醛基与氨基荧光素反应得到的氨基荧光素，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线的化学传感器。
所述的硅纳米线是由化学气相沉积法或化学刻蚀法所得到的不同尺寸的硅纳米
线本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器的制备方法包括以下步骤1)将用化学气相沉积法制备得到的硅纳米线于温度为70 95°C的体积比为 1 1 8 1的浓硫酸(质量浓度为50% 98%)与H2O2(质量浓度为5% 30%) 的混合液中加热30 90分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，于室温下浸泡在 H2O H2O2 (质量浓度为5% 30% ) NH4OH的体积比为3 1 1 9 1 1的混合液中并放置(一般放置时间为1 2. 5小时)，取出并反复水洗至中性，真空干燥；或将用化学刻蚀法制备得到的硅纳米线阵列于温度为70 95 °C的体积比为 1 1 8 1的浓硫酸(质量浓度为50% 98%)与H2O2 (质量浓度为5% 30%)的混合液中加热30 90分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，然后置于氧等离子体系统中进行硅纳米线阵列的表面处理(处理条件氧气的质量含量为10 100%，电压为100 500伏，时间为10秒 5分钟，温度为10 35°C )；2)在反应器中加入10 60mg步骤1)得到的干燥的硅纳米线或硅纳米线阵列、 5 30mL无水甲苯和0. 05 0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 21 1. 26mmol)，在惰性气体(如氮气)保护下加热至80 120°C后，恒温反应12 36小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线或硅纳米线阵列，用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列；3)将步骤2)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中， 加入质量浓度为10% 50%的戊二醛水溶液(可为1. 5 IOmL)，室温搅拌反应(一般反应时间为30 120分钟)，然后用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线或硅纳米线阵列；4)将步骤3)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中， 加入浓度为1 6mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液或丙酮溶液(一般全部步骤3)得到的经过戊二醛修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列用0. 5 3mL浓度为1 6mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液或丙酮溶液)，室温下搅拌反应(一般反应时间为0. 5 3小时)，然后用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列；5)将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线，或从步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列上刮取的单根硅纳米线置于乙醇或丙酮中，超声使其分散， 取分散液置于0. 1 5M的NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应(一般反应时间为2 24小时)，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线；即得到对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器(如将1 15mg步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线，或经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列上刮取的单根硅纳米线置于0. 2 3mL乙醇或丙酮中，超声使其分散，取0. 05 0. 5mL分散液置于0. 1 5M的NaBH4水溶液中进行还原)。本发明中所述的化学气相沉积法制备硅纳米线的方法可是室温下，将一氧化硅经研钵研磨后放入瓷舟中，并将瓷舟放在石英管的中部，加热前，系统先用机械泵和分子泵对石英管抽真空至10_3Pa，随后以15 30SCCm(mL/min)的流速通入氩气(占混合气体的体积95% )与氢气(占混合气体的体积5% )的混合气体，当压力稳定在700 IOOOOPa时， 系统开始升温；系统以10 20°C /min升至300°C，再以10 20°C /min升温至800°C，此时关闭气阀和泵闸，保温10 30分钟后继续升温至1350°C，在1350°C下反应(一般反应时间为3 7小时)，反应结束后，自然冷却至室温，在瓷舟的两侧收集产物硅纳米线。 本发明中所述的化学刻蚀法制备硅纳米线阵列的方法可是取不同尺寸的(100) 硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸馏水进行超声清洗(一般超声清洗的时间为5 30分钟)；之后将该硅片浸泡在质量浓度为2 5%的HF水溶液中，浸泡时间为30秒 15分钟；将硅片取出后置于含有浓度为3 SmmoVLAgNO3和2 7mol/L HF的混合水溶液中(一般浸泡时间为1 5分钟)；将硅片取出后浸入含有浓度为2 7mol/L HF和0. 05 0. 4mol/ L H2O2的混合水溶液中，体系由温度为30 60°C的水浴保温；5 45分钟后取出硅片，放入浓盐酸(质量浓度为36% )浓硝酸(质量浓度为36% )的体积比为3 1的混合液中，浸泡0.5 2. 5小时后取出硅片，用蒸馏水冲洗后(可置于表面皿中待其自然晾干)自然晾干，得到由硅纳米线构成的硅纳米线阵列。本发明可将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列经进一步处理后再进行步骤5)，所述的处理是将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入浓度为0. 01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液或丙酮溶液(一般全部步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列用2 12mL浓度为0. 01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液或丙酮溶液)，在温度为30 70°C下加热反应(一般反应时间为1 8小时)，然后用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列，室温干燥。将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列用浓度为0. 01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液或丙酮溶液处理，可以使得氨基荧光素分子更加牢固的修饰在硅纳米线或硅纳米线阵列的表面，在后续的反应过程中保证其不易从硅纳米线或硅纳米线阵列的表面脱落下来。所述的化学气相沉积法制备得到的硅纳米线的直径为5 20nm。所述的化学刻蚀法制备得到的硅纳米线阵列中的硅纳米线的直径为100 300nm，长度为5 40 μ m。所述的无水甲苯优选是新蒸的无水甲苯。所述的清洗用的有机溶剂可以是常用的有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮。本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器可用于对一氧化氮分子的检测，其在用荧光光谱仪或荧光显微镜对一氧化氮分子作检测时，以经过特殊的有机分子修饰的上述的基于硅纳米线的化学传感器作为荧光检测的活性基底，联用荧光光谱仪或荧光显微镜，在有一氧化氮存在的体系中，上述的基于硅纳米线的化学传感器会产生荧光，通过绘制一氧化氮的浓度和特征荧光特征峰强度的定标曲线，由上述的基于硅纳米线的化学传感器检测到的特征荧光特征峰的强度确定体系中一氧化氮的浓度， 从而实现对一氧化氮分子的检测。即，凭借该活性基底的高选择性和灵敏度，可以定量检测出一氧化氮分子的浓度，从而实现了传感器的构筑。本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器在对一氧化氮分子进行检测时，所述的有一氧化氮存在的体系，可以是将含有一氧化氮的溶液直接加入到含有本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器的溶液中，也可以是将能够产生一氧化氮的物质与含有本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器的溶液进行混合，在37°C下进行孵育；也可以是将能够产生一氧化氮的生物样品(组织提取液或是细胞)与本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器进行适当孵育(适当即是以保证生物样品活性为前提)，之后再进行荧光强度的测试。用荧光光谱仪或者荧光显微镜进行检测。所用的激发光源为汞灯(激发波长为470 495nm)、氙灯(激发波长为470 495nm)或激发波长为 488nm的激光器 ，该传感器的发射光为绿光。所述的有一氧化氮存在的体系是动物肝脏提取液(可对动物肝脏提取液中的一氧化氮进行检测)。本发明是将基于化学气相沉积法和化学刻蚀方法制备得到的硅纳米线和硅纳米线阵列进行表面处理，然后再用有机小分子物质氨基荧光素对其进行化学共价修饰，得到对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器。本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器可用于溶液及生物体系中一氧化氮的检测。


图1.本发明实施例1的经过化学气相沉积法制备得到的硅纳米线的HRTEM照片。图2.本发明实施例2的经过化学刻蚀法制备得到的硅纳米线阵列的SEM照片。图3.本发明实施例1 8中的活性基底1和活性基底2对NO的响应机理；其中 图3a为活性基底1和活性基底2的化学合成过程示意图；图3b为活性基底1和活性基底 2对NO的响应示意图。图4.本发明实施例1的活性基底1作为检测基底，体系荧光与NO的浓度的线性曲线。图5.本发明实施例1的活性基底1作为检测基底，对肝脏提取液中NO的浓度变化进行检测时，体系荧光强度和所加肝脏提取液的体积绘制的线性曲线。图6.本发明实施例2的活性基底2作为检测基底，对溶液中NO进行检测的荧光图像。a为从活性基底2上刮下的单根纳米线的明场照片；b为从活性基底2上刮下的单根纳米线的荧光照片；c为从活性基底2上刮下的单根纳米线置于ImL浓度为0. 5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(除氧)中，且加入45 μ L含有浓度为0. IM HCl和0. IMNaNO2的混合溶液，并于水浴(37°C )中保温1小时之后于荧光显微镜下进行观察得到的荧光照片。
具体实施例方式实施例11)室温下，将一氧化硅经研钵研磨后放入瓷舟中，并将瓷舟放在石英管的中部，力口热前，系统先用机械泵和分子泵抽真空至10_3Pa，随后以25SCCm(mL/min)的流速通入氩气 (占混合气体的体积95% )与氢气(占混合气体的体积5% )的混合气体，当压力稳定在 IO3Pa时，系统开始升温。系统以10°C/min升至300°C，再以20°C/min升温至800°C，此时关闭气阀和泵闸，保持10分钟后继续升温至1350°C，1350°C下反应5小时，反应结束后，自然冷却至室温，在瓷舟的两侧收集产物，所得到的硅纳米线是中心为直径为15 20nm的单晶硅线，外边有一层1 3nm的非晶氧化硅层(见图1)。2)将步骤1)得到的硅纳米线于温度为70°C的体积比为5 1的浓硫酸(质量浓度为98% )与H2O2(质量浓度为30% )的混合液中加热30分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，于室温下浸泡在H2O H2O2(质量浓度为30%) NH4OH的体积比为 7:1: 1的混合液中并放置2. 5小时，取出并反复水洗至中性，真空干燥。
3)在圆底烧瓶中加入45. 5mg步骤2)得到的干燥的硅纳米线、IOmL新蒸的无水甲苯和0. 2mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 84mmol)，在氮气保护下加热至90°C后，恒温反应 24小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线，用乙醇反复超声清洗除去未反应的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线。4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入5mL质量浓度为50%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应1小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线。5)将步骤4)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入2mL浓度为5mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应2小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线。6)将步骤5)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入6mL浓度为0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为50°C下加热反应4小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线，室温干燥。7)将步骤6)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线6mg置于ImL乙醇中，超声使其分散，取0. 2mL的分散液置于3mL 0. IM的NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应3小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线；即活性基底1 (见图3)。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底1作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光光谱仪，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测，激发光源为氙灯。在含有活性基底1的ImL 0. 5M的羟乙基哌嗪乙硫磺酸水溶液(除氧)中，加入 45 μ L0. IM HCl和100 μ L0. IM NaNO2溶液，并于水浴(37°C )中保温，用450nm的光激发， 每隔5分钟进行一次荧光检测，发现随着体系中一氧化氮浓度的增加，上述活性基底1的荧光特征峰的强度逐渐增强。荧光特征峰的强度和一氧化氮浓度呈线性关系，从而绘制了荧光特征峰强度和一氧化氮浓度的线性定标曲线(见图4)。取新鲜的小鼠肝脏，称重12克，于2mL除菌的PBS缓冲液中搅勻，于4000rpm离心 15分钟，取上层清液，于4000rpm离心15分钟，收集清液，得到肝脏提取液，冷冻保存。将上述得到的活性基底1作为荧光检测基底，联用荧光光谱仪，对上述制备得到的肝脏提取液进行荧光检测。在含有活性基底1的ImL PBS (除菌)中，逐渐加入10μ L肝脏提取液，用450nm的光激发，之后立即进行荧光检测，结果表明随着体系中肝脏提取液的增加，荧光特征峰强度明显的增加(见图5)。实施例21)取2cmX0. 5cm的(100)硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸馏水各超声清洗10分钟；之后将该硅片浸泡在质量浓度为5%的HF水溶液中15分钟；将该硅片取出后置于含有浓度为5mmol/L AgNO3和4. 8mol/L HF的混合水溶液中；浸泡2. 5分钟后取出放入IOmL含有浓度为4. 8mol/L HF和0. 2mol/LH202混合水溶液中，体系于50°C水浴保温；35分钟后取出硅片，放入盛有4. 5mL浓盐酸(质量浓度为36% )和1. 5mL浓硝酸(质量浓度为36% )的混合液中；浸泡1小时后取出硅片，用蒸馏水冲洗，洗干净后置于表面皿中自然晾干，得到由硅纳米线构成的硅纳米线阵列，其中硅纳米线的直径为100 200nm，长度为25 40 μ m(见图2)。2)将步骤1)得到的硅纳米线阵列于温度为90°C的体积比为5 1的浓硫酸(质量浓度为98%)与H2O2(质量浓度为30%)的混合液中加热50分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，然后置于氧等离子体系统中进行硅纳米线阵列的表面处理(处理条件氧气的质量含量为100%，电压为500伏，时间为5分钟，温度为35°C )。3)在圆底烧瓶中加入45. 5mg步骤2)得到的干燥的硅纳米线阵列、IOmL新蒸的无水甲苯和0. 2mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0.84mmol)，在氮气保护下加热至90°C后，恒温反应24小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线阵列，用乙醇反复超声清洗除去未反应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线阵列。4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入5mL质量浓度为30%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应1小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线阵列。5)将步骤4)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入2mL浓度为5mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应2小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列。

6)将步骤5)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入 6mL浓度为0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为50°C下加热反应4小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列，室温干燥。7)将从步骤6)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列根部下刮取的2mg单根硅纳米线置于ImL乙醇中，超声使其分散，取0. 2mL的分散液置于3mL 3M的NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应5小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线，即活性基底2。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底2作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光显微镜，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测，激发光源为氙灯。在含有活性基底2的ImL 0. 5M的羟乙基哌嗪乙硫磺酸水溶液(除氧)中，加入 45 μ L 0. IM HCl和0. ImL 2. 6Μ NaNO2溶液，并于水浴(37°C )中保温，1小时之后在荧光显微镜下进行观察，在与NO溶液反应之后，活性基底2的荧光强度明显增强(见图6)。实施例31)室温下，将一氧化硅经研钵研磨后放入瓷舟中，并将瓷舟放在石英管的中部，力口热前，系统先用机械泵和分子泵抽真空至10_3Pa，随后以25SCCm(mL/min)的流速通入氩气 (占混合气体的体积95% )与氢气(占混合气体的体积5% )的混合气体，当压力稳定在IO3Pa时，系统开始升温。系统以20°C /min升至300°C，再以10°C /min升温至800°C，此时关闭气阀和泵闸，保持10分钟后继续升温至1350°C，1350°C下反应5小时，反应结束后，自然冷却至室温，在瓷舟的两侧收集产物，所得到的硅纳米线是中心直径为5 15nm的单晶硅线，外边有一层1 3nm的非晶氧化硅层。2)将步骤1)得到的硅纳米线于温度为70°C的体积比为5 1的浓硫酸(质量浓度为50%)与H2O2 (质量浓度为5%)的混合液中加热30分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，于室温下浸泡在H2O H2O2 (质量浓度为5%) NH4OH的体积比为7 1 1 的混合液中并放置2. 5小时，取出并反复水洗至中性，真空干燥。3)在圆底烧瓶中加入IOmg步骤2)得到的干燥的硅纳米线、5mL新蒸的无水甲苯和0. 05mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 21mmol)，在氮气保护下加热至80°C后，恒温反应 12小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线，用乙醇反复超声清洗除去未反应的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线。4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入1. 5mL质量浓度为35%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应30分钟，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线。5)将步骤4)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入0. 5mL浓度为lmmol/L的氨基荧光素的丙酮溶液，室温下搅拌反应30分钟，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线。6)将步骤5)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入2mL浓度为O.Olmol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的(0. 02mmol)乙醇溶液，在温度为30°C下加热回流反应1小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线，室温干燥。7)将步骤6)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线Img置于0. 2mL乙醇中，超声使其分散，取0. 05mL的分散液置于0. 5mL 0. lmol/L的NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应2小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线，即活性基底1。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底1作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光光谱仪，用450nm的光激发，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测。取新鲜的小鼠肝脏，称重6克，于3mL除菌的PBS缓冲液中搅勻，于4000rpm离心 15分钟，取上层清液，于4000rpm离心15分钟，收集清液，得到肝脏提取液，冷冻保存。将上述得到的活性基底1作为荧光检测基底，联用荧光光谱仪，对上述制备得到的肝脏提取液进行荧光检测。在含有活性基底1的ImL PBS (除菌)中，逐渐加入10μ L肝脏提取液，之后立即进行荧光检测，用450nm的光激发，结果表明随着体系中肝脏提取液的增加，荧光特征峰强度明显的增加。实施例41)取2cmX0. 5cm的(100)硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸馏水各超声清洗10分钟；之后将该硅片浸泡在质量浓度为5%的HF水溶液中15分钟；将该硅片取出后置于含有浓度为5mmol/L AgNO3和4. 8mol/L HF的混合水溶液中；浸泡2. 5分钟后取出放入IOmL含有浓度为4. 8mol/L HF和0. 2mol/LH202混合水溶液中，体系于50°C水浴保温；15分钟后取出硅片，放入盛有4. 5mL浓盐酸(质量浓度为36% )和1. 5mL浓硝酸(质量浓度为36% )的混合液中；浸泡1小时后取出硅片，用蒸馏水冲洗，洗干净后置于表面皿中自然晾干，得到由硅纳米线构成的硅纳米线阵列，其中硅纳米线的直径为200 300nm，长度为5 25 μ m。2)将步骤1)得到的硅纳米线阵列于温度为95°C的体积比为4 1的浓硫酸(质量浓度为70%)与H2O2(质量浓度为15%)的混合液中加热90分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，然后置于氧等离子体系统中进行硅纳米线阵列的表面处理(处理条件氧气的质量含量为10%，电压为100伏，时间为10秒，温度为10°C)；3)在圆底烧瓶中加入IOmg步骤2)得到的干燥的硅纳米线阵列、30mL新蒸的无水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1. 26mmol)，在氮气保护下加热至120°C后，恒温反应12小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线阵列，用乙醇反复超声清洗除去未反应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线阵列。4)将步骤3)得到的经表面修饰有氨基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入5mL 质量浓度为10%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应1小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线阵列。5)将步骤4)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入2mL浓度为5mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应2小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列。6)将步骤5)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入 6mL浓度为0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为50°C下加热反应4小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列，室温干燥。7)将从步骤6)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列根部下刮取的IOmg 单根硅纳米线置于5mL乙醇中，超声使其分散，取0. 5mL的分散液置于5mL 1. 85mol/L的 NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应18小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线，即活性基底2。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底2作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光显微镜，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测。将活性基底2置于产生一氧化氮的溶液体系中，并于水浴(37°C )中保温，1小时之后在荧光显微镜下进行观察，氙灯作为激发光源在与NO溶液反应之后，活性基底2的荧光强度明显增强。实施例51)将实施例1中经过化学气相沉积法得到的硅纳米线于温度为95°C的体积比为8 1的浓硫酸(质量浓度为80% )与H2O2(质量浓度为20% )的混合液中加热90 分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，于室温下浸泡在H2O H2O2(质量浓度为 20% ) NH4OH的体积比为9 1 1的混合液中并放置2. 5小时，取出并反复水洗至中
性，真空干燥。2)在圆底烧瓶中加入60mg步骤1)得到的干燥的硅纳米线、30mL新蒸的无水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1. 26mmol)，在氮气保护下加热至120°C后，恒温反应36小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线，用丙酮反复超声清洗除去未反应的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线。4)将步骤3)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入IOmL质量浓度为50%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应120分钟，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线。5)将步骤4)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线置于锥形瓶中，加入3mL浓度为 6mmol/L的氨基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应3小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线。6)将步骤5)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入12mL 浓度为0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的(0. 72mmol)乙醇溶液，在温度为70°C下加热回流反应8小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线，室温干燥。7)将步骤6)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线15mg置于3mL乙醇中，超声使其分散，取0. 5mL的分散液置于5mL 0. 8mol/L的NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应24小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线，即活性基底1。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底1作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光光谱仪，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测。将活性基底1置于能够缓慢产生一氧化氮的溶液体系中，用450nm的光激发，每隔5分钟进行一次荧光检测，并记录荧光曲线。发现随着体系中一氧化氮浓度的增加，上述活性基底1的荧光特征峰(的强度逐渐增强。荧光特征峰的强度和一氧化氮浓度呈线性关系，从而绘制了荧光特征峰强度和一氧化氮浓度的线性定标曲线。实施例61)将实施例2中经过化学刻蚀法得到的硅纳米线阵列于温度为70°C的体积比为 4.5 1的浓硫酸(质量浓度为90% )与H2O2 (质量浓度为25% )的混合液中加热30分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，然后置于氧等离子体系统中进行硅纳米线阵列的表面处理(处理条件氧气的质量含量为50%，电压为300伏，时间为3分钟，温度为 25 0C )。2)在圆底烧瓶中加入60mg步骤1)得到的干燥的硅纳米线阵列、5mL新蒸的无水甲苯和0.05mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(0. 21mmol)，在氮气保护下加热至120°C后，恒温反应36小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线阵列，用丙酮反复超声清洗除去未反应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线阵列。3)将步骤2)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入5mL质量浓度为45%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应1小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线阵列。4)将步骤3)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入2mL浓度为5mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应2小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列。
5)将从步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列根部下刮取的20mg单根硅纳米线置于15mL乙醇中，超声使其分散，取1. 5mL的分散液置于18mL 5mol/L的NaBH4 水溶液中进行还原，于室温下反应14小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线，即活性基底2。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底2作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光显微镜，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测。将活性基底2置于能够产生一氧化氮的溶液体系中，并于水浴(37°C )中保温，1小时之后在荧光显微镜下进行观察，氙灯作为激发光源，结果表明在与NO溶液反应之后，活性基底2的荧光强度明显增强。实施例71)将实施例3经中过化学气相沉积法得到的硅纳米线于温度为90°C的体积比为5. 5 1的浓硫酸(质量浓度为98% )与H2O2 (质量浓度为30% )的混合液中加热90 分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，于室温下浸泡在H2O H2O2(质量浓度为 30% ) NH4OH的体积比为6. 5 1 1的混合液中并放置3小时，取出并反复水洗至中
性，真空干燥。2)在圆底烧瓶中加入60mg步骤1)得到的干燥的硅纳米线、15mL新蒸的无水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1.26mm0l)，在氮气保护下加热至95°C后，恒温反应 28小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线，用丙酮反复超声清洗除去未反应的 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线。3)将步骤2)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线置于圆底烧瓶中，加入7mL质量浓度为50%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应90分钟，然后用丙酮反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线。4)将步骤3)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线置于锥形瓶中，加入3mL浓度为 5mmol/L的氨基荧光素的丙酮溶液，室温下搅拌反应3小时，然后用丙酮反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线。5)将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线8mg置于1. 5mL乙醇中，超声使其分散，取0. 5mL的分散液置于6mL 2. 6mol/L的NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应10小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线，即活性基底1。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底1作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光光谱仪，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测。将活性基底1置于能够缓慢产生一氧化氮的体系中，用氙灯作为激发光源，用450nm的光激发，每隔6 分钟进行一次荧光检测，并记录荧光曲线，发现随着体系中一氧化氮浓度的增加，上述活性基底1的荧光特征峰的强度逐渐增强。荧光特征峰的强度和一氧化氮浓度呈线性关系，从而绘制了荧光特征峰强度和一氧化氮浓度的线性定标曲线。实施例81)将实施例4中经过化学刻蚀法得到的硅纳米线阵列于温度为90°C的体积比为3 1的浓硫酸(质量浓度为98% )与H2O2 (质量浓度为30% )的混合液中加热50分钟，之后冷却至室温，取出并反复水洗至中性，然后置于氧等离子体系统中进行硅纳米线阵列的表面处理(处理条件氧气的质量含量为80%，电压为500伏，时间为5分钟，温度为 30 0C )。2)在圆底烧瓶中加入60mg步骤1)得到的干燥的硅纳米线阵列、IOmL新蒸的无水甲苯和0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(1. 26mmol)，在氮气保护下加热至90°C后，恒温反应36小时，冷却至室温，用微型过滤器过滤收集硅纳米线阵列，用丙酮反复超声清洗除去未反应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线阵列。3)将步骤2)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入5mL质量浓度为50%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应1小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线阵列。4)将步骤3)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入2mL浓度为5mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液，室温下搅拌反应2小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列。5)将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列置于圆底烧瓶中，加入 6mL浓度为0. 024mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液，在温度为50°C下加热反应4小时，然后用乙醇反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列，室温干燥。6)将从步骤5)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列根部下刮取的8mg单根硅纳米线置于ImL乙醇中，超声使其分散，取0. 5mL的分散液置于6mL 2. 6mol/L的NaBH4 水溶液中进行还原，于室温下反应10小时，反应液室温保存，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线，即活性基底2。将上述得到的对一氧化氮具有选择性荧光响应的活性基底2作为对一氧化氮分子进行荧光检测基底，联用荧光显微镜，对溶液体系中产生的NO进行荧光检测。将活性基底2置于能够产生一氧化氮的溶液体系中，并于水浴(37°C )中保温，1小时之后在荧光显微镜下进行观察，氙灯作为光源，在与NO溶液反应之后，活性基底2的荧光强度明显增强。
1权利要求
1.一种对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器，其特征是所述的基于硅纳米线的化学传感器是由3-氨基丙基三乙氧基硅烷和硅纳米线或硅纳米线阵列反应得到的表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列，与戊二醛反应得到表面修饰有醛基的硅纳米线或硅纳米线阵列，经还原修饰在硅纳米线或硅纳米线阵列上由醛基与氨基荧光素反应得到的氨基荧光素，得到表面修饰有作为对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线的化学传感器。
2.根据权利要求1所述的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器，其特征是所述的硅纳米线是由化学气相沉积法制备得到的直径为5 20nm的硅纳米线；或是由化学刻蚀法制备得到的直径为100 300nm，长度为5 40 μ m的硅纳米线。
3.一种根据权利要求1或2所述的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器的制备方法，其特征是，所述的方法包括以下步骤1)将用化学气相沉积法制备得到的硅纳米线于温度为70 95°C的体积比为1 1 8 1的浓硫酸与H2O2的混合液中加热30 90分钟，之后冷却至室温，取出水洗至中性， 于室温下浸泡在H2O H2O2 NH4OH的体积比为3 1 1 9 1 1的混合液中并放置，取出并水洗至中性，真空干燥；或将用化学刻蚀法制备得到的硅纳米线阵列于温度为70 95°C的体积比为1 1 8 1的浓硫酸与H2O2的混合液中加热30 90分钟，之后冷却至室温，取出并水洗至中性， 然后置于氧等离子体系统中进行硅纳米线阵列的表面处理，处理条件氧气的质量含量为 10 100%，电压为100 500伏，时间为10秒 5分钟，温度为10 35°C ；2)在反应器中加入10 60mg步骤1)得到的干燥的硅纳米线或硅纳米线阵列、5 30mL无水甲苯和0. 05 0. 3mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，在惰性气体保护下加热至80 120°C后，恒温反应12 36小时，冷却至室温，过滤收集硅纳米线或硅纳米线阵列，用有机溶剂超声清洗除去未反应的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，过滤收集表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列；3)将步骤2)得到的表面修饰有氨基的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入质量浓度为10% 50%的戊二醛水溶液，室温搅拌反应，然后用有机溶剂超声清洗除去未反应的戊二醛，过滤收集表面修饰有醛基的硅纳米线或硅纳米线阵列；4)将步骤3)得到的表面修饰有醛基的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入浓度为1 6mol/L的氨基荧光素的乙醇溶液或丙酮溶液，室温下搅拌反应，然后用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的氨基荧光素，直至洗涤液无荧光，过滤收集经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列；5)将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线，或从步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线阵列上刮取的单根硅纳米线置于乙醇或丙酮中，超声使硅纳米线分散，取分散液置于0. 1 5M的NaBH4水溶液中进行还原，于室温下反应，得到表面修饰有对一氧化氮具有选择性荧光响应的还原态氨基荧光素的硅纳米线的化学传感器。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列经进一步处理后再进行步骤5)，所述的处理是将步骤4)得到的经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列置于反应器中，加入浓度为0.01 0. 06mol/L的三乙酰氧基硼氢化钠的乙醇溶液或丙酮溶液，在温度为30 70°C下加热反应，然后用有机溶剂反复超声清洗除去未反应的三乙酰氧基硼氢化钠，过滤收集得到经过氨基荧光素修饰的硅纳米线或硅纳米线阵列。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤3)所述的室温搅拌反应的反应时间为0. 5 2小时；步骤4)所述的室温下搅拌反应的反应时间为0. 5 3小时； 步骤5)所述的于室温下反应的反应时间为2 24小时。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是所述的化学气相沉积法制备得到的硅纳米线的直径为5 20nm ；所述的化学刻蚀法制备得到的硅纳米线阵列中的硅纳米线的直径为100 300nm，长度为5 40ym。
7.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是所述的有机溶剂是甲醇、乙醇或丙酮。
8.一种根据权利要求1 3任意一项所述的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器的应用，其特征是所述的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器用于对一氧化氮分子的检测，在有一氧化氮存在的体系中，所述的基于硅纳米线的化学传感器会产生荧光，通过绘制一氧化氮的浓度和特征荧光特征峰强度的定标曲线，由所述的基于硅纳米线的化学传感器检测到的特征荧光特征峰的强度确定体系中一氧化氮的浓度。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是所述的有一氧化氮存在的体系是动物肝脏提取液。
全文摘要
本发明属于纳米结构的荧光化学传感器领域，特别涉及对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器及其制备方法和应用。本发明是将基于化学气相沉积法和化学刻蚀方法制备得到的硅纳米线和硅纳米线阵列进行表面处理，然后再用有机小分子物质氨基荧光素对其进行化学共价修饰，得到对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器。本发明的对一氧化氮具有选择性荧光响应的基于硅纳米线的化学传感器可用于溶液及生物体系中一氧化氮的检测。
文档编号G01N21/64GK102419319SQ20111026616
公开日2012年4月18日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者师文生, 穆丽璇, 苗荣 申请人:中国科学院理化技术研究所