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专利名称：血红蛋白的分析方法
技术领域：
本发明涉及血红蛋白的分析方法及分析用试剂盒。
背景技术：
血红蛋白中，糖化血红蛋白的1种即血红蛋白Alc的量作为血糖值的指标，被利用于包括糖尿病和代谢综合症(Metabolic Syndrome)在内的生活习惯病的检查及血糖管理中，推测以后也会成为重要的指标之一。血红蛋白Alc中，稳定型血红蛋白Alc是特别重要的指标，需求能够更准确地测定稳定型血红蛋白Alc的技术。稳定型血红蛋白Alc能够用电泳或HPLC等分离分析方法进行分析。根据支撑体的有无、支撑体的种类等，电泳存在各种方法，例如已知有聚丙烯酰胺电泳、琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、滤纸电泳、醋酸纤维素膜电泳、电色谱法、无载体 (自由流)电泳、毛细管电泳法等。作为采用琼脂糖凝胶电泳法的分析，例如提出了使用添加有硫酸软骨素等硫酸化多糖类的琼脂糖凝胶来分离糖化血红蛋白的方法等。作为采用毛细管电泳的分析方法，例如提出了使用毛细管电泳法的一种即电色谱法并通过使泳动用缓冲液中含有硫酸软骨素等聚阴离子或聚阳离子从而在短时间内分析试样的方法(日本特开平09-105739号)；将泳动装置微芯片化从而使分析装置小型化的方法(日本特开 2009-186445 号及日本特开 2009-109230)等。

发明内容
用电泳或HPLC等分离分析方法来分析血红蛋白时，存在由于血红蛋白发生变性而使测定值产生误差的问题。例如，在电泳的情况下，随着泳动液的温度上升，血红蛋白发生氧化(高铁血红蛋白化)。此外，即使在HPLC的情况下，随着时间的经过，有时血红蛋白也会发生氧化(高铁血红蛋白化)。因此，本发明提供一种在分离分析方法中能够抑制血红蛋白的变性的分析方法。本发明涉及一种分析方法，其是利用分离分析方法来分析试样中的血红蛋白的方法，其包含在亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的存在下分离血红蛋白。在另一方式中，本发明涉及一种在本发明的分析方法中使用的分析用试剂盒，其包含含有亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物的组合物及记载了上述分析方法的说明书，所述组合物作为试样制备液、泳动液或流动相使用。根据本发明，例如可发挥在抑制血红蛋白的变性的情况下进行血红蛋白的分离分析方法的效果。此外，根据本发明，优选可发挥通过抑制血红蛋白的变性从而能够进行准确的血红蛋白的分析的效果。另外，本发明可以是以人的治疗和诊断为目的的方式，也可以是不以人的治疗和诊断为目的的方式。


图IA是表示可以用于本发明的方法的电泳芯片的一个例子的构成的示意图，图IB是沿图IA所示的电泳芯片的I-I线的剖面图。图2是表示实施例1的结果的一个例子的图表。图3是表示亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物的浓度与吸光度变化的关系的一个例子的图表。
具体实施例方式本发明基于以下认识在血红蛋白的分离分析方法中，随着时间的经过、和/或分析条件逐渐变成酸性、血红蛋白逐渐被氧化(高铁血红蛋白化)、血红蛋白的吸收特性逐渐发生变化(极大波长415nm — 405nm)，其结果是测定值有可能产生误差。进而，本发明基于以下认识分离分析中的血红蛋白的变性可以通过使用亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种来抑制。即，本发明涉及一种分析方法(以下也称为“本发明的分析方法”。)， 其是利用分离分析方法来分析试样中的血红蛋白的方法，其包含在亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的存在下分离血红蛋白。根据本发明，例如可以发挥在抑制血红蛋白的变性的情况下进行血红蛋白的分离分析方法的效果。此外，根据本发明，优选可发挥通过抑制血红蛋白的变性从而进行准确的血红蛋白的分析的效果。在亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的存在下血红蛋白的变性得到抑制的详细机制并不清楚，但推测如下对于分析中产生的氧化作用，亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物代替血红蛋白被氧化，从而作为防止血红蛋白的氧化的牺牲剂起作用。但是，本发明可以不被限定地解释为上述机制。[分离分析方法]本说明书中，“分离分析方法”是指包括利用电泳法及色谱法等的分析方法在内的、包括分离分析对象后进行检测及测定的分析方法。本说明书中，“电泳法”是指利用因物质的大小和电荷的不同等而在电场中产生的移动速度之差来分离物质的方法。关于本发明的分析方法，例如可以用于采用了聚丙烯酰胺电泳、琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、滤纸电泳、醋酸纤维素膜电泳、电色谱法、无载体(自由流)电泳、毛细管电泳等各种电泳法的分析方法中。其中，本发明的分析方法适于毛细管电泳、优选电色谱法，特别适于使用了微芯片化了的电泳芯片的毛细管电泳。[血红蛋白]本说明书中，“血红蛋白”包括血中的多种形态的血红蛋白，具体而言，可列举出正常血红蛋白、糖化血红蛋白、突变血红蛋白、修饰血红蛋白等，更具体而言，可列举出血红蛋白AO(HbAO)、血红蛋白Alc(HbAlc)、血红蛋白A2 (HbA2)、血红蛋白S(HbS、镰刀形红细胞血红蛋白)、血红蛋白(HbF、胎儿血红蛋白)、血红蛋白M(HbM)、血红蛋白C (HbC)、高铁血红蛋白、氨基甲酰化血红蛋白、乙酰化血红蛋白等。作为HbAlc，有稳定型HbAlc、不稳定型 HbAlc0本说明书中，“血红蛋白的分析”包括分离稳定型HbAlc与不稳定型HbAlc及HbAO 并检测和/或测定稳定型HbAlc和/或不稳定型HbAlc。另外，血红蛋白根据氧化的状态及有无与氧的结合而分类。与氧结合的血红蛋白是指氧合血红蛋白或氧化血红蛋白。此外，未与氧结合的血红蛋白是指脱氧血红蛋白或还原血红蛋白。进而，将血红蛋白被氧化、血红素(heme)部分的！^原子变成3价而氧结合能力消失的血红蛋白称为高铁血红蛋白或氧化血红蛋白。本说明书中，“变性的血红蛋白”包括高铁血红蛋白。[亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物]本说明书中，“亚硫酸化合物”包括亚硫酸、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、二亚硫酸盐， 作为盐的形态，包括钠盐、铵盐、钾盐。具体而言，可列举出亚硫酸钠(Na2SO3)、亚硫酸氢钠 (NaHSO3)、二亚硫酸二钠(焦亚硫酸钠、Naj2O5)。本说明书中，“连二亚硫酸化合物”包括连二亚硫酸及连二亚硫酸盐，作为盐的形态，包括钠盐、铵盐、钾盐。具体而言，可列举出连二亚硫酸钠(Na2S2O4)。[试样、泳动液、流动相]本说明书中，“试样”是指由试样原料制备的物质。作为试样原料，可列举出生物试样，优选含有血红蛋白的试样。作为生物试样，包括血液、含有红细胞成分的血液来源物、 唾液、脑脊液等。作为血液，可列举出从生物体采集的血液，优选为动物的血液，更优选为哺乳类的血液，进一步优选为人的血液。作为含有红细胞成分的血液来源物，可列举出由血液分离或制备得到的含有红细胞成分的物质，例如包括除去了血浆的血细胞级分、或血细胞浓缩物、血液或血细胞的冷冻干燥物、对全血进行溶血处理而得到的溶血试样、离心分离血液、自然沉降血液等。本说明书中，“试样制备液(试样稀释液)”是指用于与试样原料混合来制备试样的溶液，例如包括用于稀释试样原料的溶液。作为试样中的试样原料浓度(含量)，从抑制血红蛋白的变性的观点出发，优选为1 30重量％。本说明书中，“泳动液”是指电泳法中用于分离试样的流路、载体、空间等中填充或渗透的液体。此外，本说明书中，“流动相”是指在液相色谱法中使用的流动相。[缓冲剂]从试样的稳定化及抑制pH的变化的角度出发，本发明中使用的试样、泳动液及流动相优选含有缓冲剂。试样、泳动液及流动相中所含的缓冲剂可以是一种也可以是多种。作为缓冲剂，可以使用具有缓冲功能的公知的溶液，具体而言，例如可列举出柠檬酸、琥珀酸、 酒石酸、苹果酸等有机酸及其盐类；甘氨酸、牛磺酸、精氨酸等氨基酸类；盐酸、硝酸、硫酸、 磷酸、硼酸、醋酸等无机酸及其盐类等。[血红蛋白的分析方法]本发明的分析方法涉及一种分析方法，如上所述，其是通过分离分析方法来分析试样中的血红蛋白的方法，其包含在亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的存在下分离血红蛋白。作为“在亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的存在下分离血红蛋白”的一个实施方式，可列举出使用含有亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的泳动液或流动相通过电泳法或液相色谱法来分离血红蛋白。例如，在使用了微芯片化了的电泳芯片等的电泳法中，在分离血红蛋白的工序中血红蛋白的周边温度达到30°C以上、或40°C以上、根据情况达到50°C以上，血红蛋白处于非常容易氧化(高铁血红蛋白化)的状态。此外，即使在室温或低温状态下，在存在溶解氧或存在氧化物质的条件下血红蛋白也有可能氧化(高铁血红蛋白化)。根据本发明的分析方法，能够抑制这种血红蛋白的变性。[pH]从亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物的稳定性的观点出发，分离血红蛋白时的泳动液及流动相的PH优选为6以下，更优选为5. 5以下，进一步优选为5以下。此外，从抑制血红蛋白的变性的观点出发，上述PH优选为3以上，更优选为3. 5以上，进一步优选为4以上。从同样的观点出发，试样及试样制备液的PH也优选为同样的范围。[浓度]作为分离血红蛋白时的亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物的浓度，从抑制血红蛋白的变性的观点出发，优选0. OOlmM以上，更优选0. OlmM以上，进一步优选0. ImM以上。尤其是从抑制血红蛋白的高铁血红蛋白化的角度出发，亚硫酸氢钠、亚硫酸钠及二亚硫酸钠的浓度优选为0. 5mM以上，更优选为ImM以上，连二亚硫酸钠的浓度优选为0. 25mM以上，更优选为0. 5mM以上。此外，从在不使血红蛋白脱氧化(还原型)地维持氧合Hb的状态的情况下进行血红蛋白的测定的观点出发，亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物的浓度优选为20mM以下，更优选为IOmM以下。具体而言，在使用亚硫酸化合物(亚硫酸氢钠、亚硫酸钠)的情况下，从不使血红蛋白脱氧化(还原型)地维持氧合Hb的状态的情况下进行血红蛋白的测定而的观点出发，亚硫酸化合物的浓度优选为20mM以下，更优选为15mM以下，进一步优选为IOmM 以下。尤其是在使用二亚硫酸钠的情况下，从同样的观点出发，连二亚硫酸钠的浓度优选为IOmM以下，更优选为5mM以下，进一步优选为2mM以下。此外，在使用连二亚硫酸化合物 (连二亚硫酸钠)的情况下，从同样的观点出发，连二亚硫酸化合物(连二亚硫酸钠)的浓度优选为IOmM以下，更优选为5mM以下，进一步优选为2mM以下。泳动液及流动相中的亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物的浓度也优选为上述的范围。因而，在制备试样的情况下，也优选使用能够使亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物的浓度达到上述范围的试样制备液(试样稀释液)。本发明的分析方法中，从抑制测定误差的角度出发，血红蛋白优选在脱氧Hb或氧合Hb中的任一种状态下进行测定，优选在氧合Hb的状态下进行测定。[分光光度计]本发明的分析方法中，从能够简便地检测血红蛋白的观点出发，血红蛋白的检测及测定优选通过用分光光度计测定吸光度来进行。这种情况下，从抑制亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物的分解的观点出发，从分光光度计的光源照射的光的波长优选为300nm以上。[分析用试剂盒]在另一方式中，本发明涉及一种分析用试剂盒，其包含本发明的分析方法中使用的组合物及记载了上述分析方法的说明书，所述组合物含有亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物且作为试样制备液、泳动液或流动相使用。需要说明的是，本发明的分析用试剂盒也可以包括说明书不与本发明的分析用试剂盒付在一起而由网络提供的情况。本发明的分析用试剂盒中，试样制备液、泳动液或流动相如上所述。此外，作为一个实施方式，本发明的分析用试剂盒优选还包含电泳芯片。电泳芯片优选为包括试样储存槽、泳动液储存槽及流路、且试样储存槽与泳动液储存槽通过流路连通的电泳芯片。 此外，电泳芯片的流路中可以填充上述泳动液。作为电泳芯片，例如可列举出国际公开第 2008/136465号中记载的电泳芯片。以下，使用实施例及比较例进一步说明本发明。但是，本发明并不被限定地解释为以下的实施例。
实施例[Hb变性抑制效果]如下所述由试样原料(全血)制备试样，通过下述的Hb变性检测方法测定Hb有
无变性。〔试样的制备方法〕向IOOmM苹果酸-精氨酸缓冲液(pH为5. 0) 1. 5mL中添加添加剂使其达到下述表1 的最终浓度，制备试样制备液，向该试样制备液1. 49mL中添加0. OlmL作为试样原料的全血并进行混合，从而制备试样(实施例1 8、比较例1 7)。作为添加剂，实施例1及5中使用亚硫酸氢钠(NaHS03、NACALAI TESQUE，INC.制)，实施例2及6中使用亚硫酸钠(Na2S03、 NACALAI TESQUE, INC.制)，实施例3、7及8中使用二亚硫酸二钠(焦亚硫酸钠、Na2S2O5, NACALAI TESQUE, INC.制)，实施例 4 中使用连二亚硫酸钠(Na2S2O4、NACALAI TESQUE, INC. 制)，比较例2中使用苄基三甲基铵(和光纯药公司制)，比较例3中使用还原型谷胱甘肽 (NACALAI TESQUE, INC.制)，比较例4中使用TAPS-磺酸盐(C7H18BrNO2S2、和光纯药公司制)，比较例5中使用抗坏血酸(和光纯药公司制)，比较例6中使用硫酸羟基胺(NACALAI TESQUE, INC.制)，比较例7中使用亚硝酸(和光纯药公司制)。另外，比较例1未添加添加剂。〔 Hb变性的检测〕将如上所述制备的实施例1 8及比较例1 7的试样在50°C下孵育60秒钟，在其前后测定400nm的吸光度，求出变化量(60秒后的吸光度-初期吸光度)。将其结果示于下述表1中。另外，吸光度的测定使用分光光度计(商品名UV-2400PC、岛津制作所公司制)进行。表 权利要求
1.一种分析方法，其是利用分离分析方法来分析试样中的血红蛋白的方法，其包含在亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的存在下分离血红蛋白。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述分离分析方法为电泳法或液相色谱法。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，分离分析的试样、泳动液或流动相的PH为3 6ο
4.根据权利要求3所述的分析方法，其中，所述试样、泳动液或流动相的亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物的浓度为IOmM以下。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其中，包含用分光光度计进行血红蛋白的检测或测定。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其中，从所述分光光度计的光源照射的光的波长为300nm以上。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的分析方法，其中，分离工序中的血红蛋白的周边温度为30°C以上。
8.—种在权利要求1 7中任一项所述的分析方法中使用的分析用试剂盒，其包含含有亚硫酸化合物或连二亚硫酸化合物的组合物及记载了所述分析方法的说明书，所述组合物作为试样制备液、泳动液或流动相使用。
全文摘要
本发明提供一种在分离分析方法中能够抑制血红蛋白的变性的分析方法，其是利用分离分析方法来分析试样中的血红蛋白的方法，其包含在亚硫酸化合物及连二亚硫酸化合物中的至少一种的存在下分离血红蛋白。
文档编号G01N30/02GK102375067SQ20111023516
公开日2012年3月14日 申请日期2011年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者中山雄介 申请人:爱科来株式会社