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专利名称：具有多层膜结构的dna芯片的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及一种DNA芯片，并且更特定地涉及具有多层膜结构的DNA芯片，其可以增加DNA探针和靶DNA之间杂交反应产生的杂交信号的检测灵敏度。
相关技术描述生物技术的发展已经弄清楚了提供有机体遗传信息的DNA序列。因此，研究和开发DNA芯片用于DNA序列分析和疾病诊断已经成为一个活跃的R&D领域。
DNA芯片可以使DNA分析体系微型化，从而可以进行微量样品的遗传分析，并可同时检测靶DNA的许多不同的序列，从而可以降低分析成本并快速地提供遗传信息。而且，DNA芯片不仅能同时分析大量的遗传信息，而且可以在短时间内检测基因之间的相互关系。
因此，预期DNA芯片的应用将有助于开发遗传性疾病或癌症、突变研究、病毒检测、基因阐明的诊断性工具以及新药的发展。
此外，DNA芯片在生命相关工业领域的应用预期将带来革新性的结果。例如，可以利用DNA芯片作为工具进行微生物的检测或环境污染，可以发现有毒物质的基因，从而可以减少特定物质解毒剂的鉴定和生产时间。
这样，DNA芯片可用于抗许多有毒物质的解毒剂的生产过程中，用于医学和农业目的，如低脂肪肉类的生产。
参照

图1和2，常规的DNA芯片10具有许多在载体11上以微阵列进行排列的DNA探针14，载体由硅片和玻璃制成。更具体地，DNA芯片10为在载体11上成百上万个预定位置圆点13形式的DNA探针14的固定芯片，各DNA探针14为已知DNA序列的单链的DNA。一般地，形成包括氨基和醛基的涂层膜12，以在载体11表面上固定DNA探针14。进行DNA分析的时候，将要分析的靶DNA 15与DNA芯片10反应。如果靶DNA 15的碱基序列与DNA探针14匹配，杂交反应的结果为形成双链DNA。此时，杂交程度依据DNA探针14和靶DNA 15之间的互补程度而变化。因此，可通过检测载体11上特定点13的杂交程度来分析靶DNA 15的碱基序列。杂交程度可通过光学方法进行检测，其中在标记荧光染料16的靶DNA 15和DNA探针14之间杂交反应之后，测量荧光染料16产生的信号。
DNA芯片根据所用的探针可分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片，也可根据制备方法分为光刻芯片、针方法点样芯片以及喷墨方法点滴芯片。但是，所有DNA芯片共有的特征是将不同类型的为单链DNA的DNA探针固定在DNA芯片上，并通过检测靶DNA和DNA探针之间杂交反应的程度来获取需要的信息。
因此，开发能正确检测探针DNA 14和靶DNA 15之间杂交反应信号结果的DNA芯片，对获取正确的遗传分析结果非常重要。
在常规的DNA芯片中，在DNA探针和标记荧光染料16的靶DNA之间反应后保留在DNA芯片表面上的荧光染料16的信号，是通过利用共聚焦显微镜或CCD相机来进行检测的，如美国专利U.S.6,141,096中所公开的那样。
共聚焦显微镜可提供高质量的图象，但是信号检测较慢；而CCD相机提供低质量的图象，但信号检测迅速。因此，许多研究者正在进行通过增加靶DNA的荧光染料16的标记量，通过利用不太昂贵的扫描仪如CCD型而不是相对昂贵的扫描仪如共聚焦显微镜来进行快速和正确的信号检测。这方面的一个实例是在美国专利U.S.6,117,631中公开的三维水凝胶小块。
但是，上述光学检测方法具有缺陷，检测微小杂交信号困难。特别地，当斑点周围存在背景噪音的时候，杂交信号的正确检测是困难的。
因此，对利用DNA探针和靶DNA之间互补的杂交反应的DNA芯片，需要增加杂交信号的检测灵敏度，使杂交信号和背景信号之间的信号差异尽可能地大。
发明概述为了解决上述及其他问题，本发明提供了具有多层结构的DNA芯片，其中形成高反射区和低反射区以增加杂交信号的检测灵敏度，所述杂交信号由DNA探针和靶DNA之间的杂交反应所产生。
根据本发明的一方面，DNA芯片包括一种载体，具有高于载体反射率的高反射区，高反射区包括依次堆积在载体预定区域的具有相对低折射率的薄膜以及具有相对高折射率的薄膜；具有低于载体反射率的低反射区，低反射区包括具有相对低折射率的薄膜，其堆积在载体高反射区的周围；以及至少在高反射区固定的DNA探针，在其上发生DNA探针和靶DNA之间的杂交反应。
这里，高反射区可按照下述方式成形，低折射率薄膜和高折射率薄膜交替堆积，并且低反射区可通过低折射率膜的薄膜多重堆积而形成。
优选地，在高反射区的高折射率薄膜的厚度为70％～130％λF/4nH，其中λF为标记靶DNA荧光染料的发射波长，nH和nL分别为为高折射率薄膜的折射率和低折射率薄膜的折射率，并且低反射区低折射率薄膜的厚度为70％～130％λF/4nL。特别地，进一步优选高折射率薄膜的厚度实际上为λF/4nH，低折射率薄膜的厚度为λF/4nL。
而且，优选地，当λF为荧光染料的发射波长且nL为低折射率薄膜的折射率的时候，低折射率薄膜的厚度为λF/4nL的奇数倍。
高折射率薄膜可由金属氧化物形成，所述金属氧化物选自TiO2、ZrO2、CeO2和Ta2O5，其折射率范围为2.0～2.5，且低折射率薄膜可由氧化硅形成。
载体可由选自硅片、玻璃、石英和塑料的材料形成。
可在高反射区和低反射区的表面形成用于固定DNA探针的涂层膜，优选地，涂层膜可由氨基和醛基物质之一形成。
附图简述参考下述附图对本发明的典型技术方案进行详细的描述，本发明的上述方面和优点将更明显，其中图1为常规DNA芯片的透视图；图2为在图1中描述的常规DNA芯片的横截面图；图3为根据本发明的第一典型实施方案的DNA芯片的透视图；图4为图3中描述的多层膜结构的DNA芯片的横截面图；图5为根据本发明的第二典型实施方案的多层膜结构的DNA芯片的横截面图6为根据本发明的第三典型实施方案的多层膜结构的DNA芯片的横截面图；图7为显示图4中描述的根据本发明的第一典型实施方案的DNA芯片的载体和高反射区之间的反射率比较图；以及图8为显示图4中描述的根据本发明的第一典型实施方案的DNA芯片的载体和低反射区之间的反射率比较图。
发明详述下面，根据本发明实施方案的多层膜结构的DNA芯片，将参考附图进行更充分的描述。为了便于理解，在可能的情况下，使用相同的参考数字来代表附图共有的同样元件。
图3为根据本发明的第一典型实施方案的DNA芯片的透视图。图4为图3中描述的多层膜结构DNA芯片的横截面图。
参考图3和4，根据本发明的第一典型实施方案的DNA芯片100包括载体110、在载体110上形成的高反射区H和低反射区L，以及至少在高反射区H的表面上固定的DNA探针140。
在载体110上以微阵列的形式形成高反射区H，该反射区比载体110具有较高的反射率。在载体110上高反射区H的周围区域形成比载体110反射率低的低反射区L。
载体110可由折射率为3.5的硅片形成。或者，固体载体例如玻璃、石英或塑料可代替硅片用作载体110。
具有相对低的折射率的第一层薄膜121堆积在载体110上。该层薄膜可由折射率为1.45的二氧化硅(SiO2)形成。
在第一层薄膜121上堆积相对高折射率的第二层薄膜122以及相对低折射率的第三层薄膜123。更具体地，在高反射区H的第一层薄膜121上形成高折射率的第二层薄膜122，并且在低反射区L的第一层薄膜121上形成低的折射率第三层薄膜123。第二层薄膜122可由折射率为2.3的氧化钛(TiO2)形成，并且第三层薄膜123，可与第一层薄膜121一样，由折射率为1.45的氧化硅(SiO2)形成。第二层薄膜122也可由折射率为2.0～2.5的金属氧化物例如不仅TiO2而且ZrO2、CeO2或Ta2O5形成。
如上所述，高反射区H形成具有多层膜结构的构造，其中依次堆积低折射率的第一层薄膜121和高折射率的第二层薄膜122。已知高反射区H的堆积膜的反射率高于载体110的反射率。另一方面，低反射区L具有多层膜结构的构造，其中依次堆积具有低折射率的第一层和第三层薄膜121和123。
在下文中，多层膜结构的反射率将参考方程1、2和3进行简单的描述。
方程1为射光的电矢量B振幅和磁矢量C振幅的矩阵形式。BC={Πr=1q[cosδrisinδr/nrinrsinδrcosδr}1nm]]>其中q代表堆积薄膜的层数，nr和nm分别代表薄膜和载体的反射率，且如果薄膜的厚度为d，则δr表示为(2πnr·d)/λ，其中λ为入射光的波长。
方程2用于计算薄膜的反射率R，可由方程1得到。R=(n0B-Cn0B+C)·(n0B-Cn0B+C)*]]>如果C/B定义为导纳Y(admittance Y)，方程3可从方程2得到。R=[n0-Yn0+Y]·[n0-Yn0+Y]‾]]>从方程1、2和3，可以看出堆积低折射率薄膜和高反射薄膜形成的多层膜具有高于载体的反射率。而且，随着堆积薄膜数目的增加，反射率也逐渐地增加。
而且，也知道当低折射率薄膜和高折射率薄膜的光学厚度分别地等于入射光波长的四分之一的时候，多层膜的反射率达到最高值。因此，优选地低折射率薄膜和高折射率薄膜分别地具有满足方程4的光学厚度。nrd＝(1/4)λ其中nr表示薄膜的折射率，d代表薄膜的厚度，且λ表示入射光的波长。
参考图4，在本发明的第一典型实施方案中，在高反射区H的第一层薄膜121和第二层薄膜122的各自厚度优选地利用方程4来确定，其中第一层薄膜具有低折射率，所述第二层薄膜具有高折射率。
第一层薄膜121的厚度可定义为约在70～130％λF/4nL的范围，其中λF为荧光染料152的发射波长，并且nL为第一层薄膜121的折射率。第二层薄膜122的厚度可定义为在约70～130％λF/4nH的范围，其中nH为第二层薄膜122的折射率。优选地第一层和第二层薄膜121和122的厚度分别为λF/4nL和λF/4nH，，但是，在实际操作上，分别沉积准确厚度为λF/4nL和λF/4nH的第一层和第二层薄膜121和122非常困难。但是，当第一层和第二层薄膜121和122的厚度分别在70～130％λF/4nL和λF/4n的时候，高反射区H可得到如图7中所示的高于载体110的反射率。
另一方面，低反射区L不具有如同高反射区H那样的多层膜特征，因为低反射区L由具有低折射率的第一层和第三层薄膜121和123组成。因此，低反射区L的总厚度由下列事实所决定当薄膜的光学厚度为二分之一波长的倍数，即为四分之一波长的偶数倍的时候，低反射区L的反射率与载体110的相等，当薄膜的光学厚度为四分之一波长的奇数倍的时候，薄膜的反射率变为最低。
因此，低反射区L的总厚度优选地为奇数倍λF/4nL，其中λF为荧光染料的发射波长，并且第一层和第三层薄膜121和123的折射率为nL。但是，当高反射区H和低反射区L的总厚度之间存在大的厚度差距(step coverage)的时候，可调节低反射区的厚度L以减少厚度差距。在这种情况下，可调节低反射区L的总厚度，使低反射区L的反射率低于载体110的反射率。
根据本发明的第一典型实施方案，高反射区H具有高于载体110的反射率，但是，低反射区L具有低于载体110的反射率。
通过多种方法将已知DNA序列的单链DNA探针140固定在高反射区H。为了实现该目的，可在高反射区H和低反射区L形成包含氨基或醛基的涂层膜130。
在图4中，DNA探针140只固定在高反射区H，但是DNA探针140不仅可以固定在高反射区H也可以固定在低反射区L。换句话说，在前一种情况下，当靶DNA 150分散在DNA芯片100的整个表面上的时候，杂交反应只在高反射区H上发生，因为DNA探针140只固定在高反射区H。但是，在后一种情况下，靶DNA 150只分散在高反射区H，以使杂交反应只在高反射区H发生，因为DNA探针140同时固定在高反射区H和低反射区L。
根据本发明的第一典型实施方案，当荧光染料152标记的靶DNA 150与DNA芯片100表面的DNA探针140反应的时候，如果DNA探针140的DNA序列与靶DNA 150的DNA序列匹配，将由于杂交反应形成双链DNA。杂交程度取决于DNA探针140和靶DNA 150之间的互补程度。在清洗过程中，通过杂交反应与DNA探针140形成了双链的靶DNA 150保留在DNA芯片100上，并且没有形成双链的靶DNA 150被去除。但是没有被清洗的用荧光染料152标记的靶DNA 150的部分可保留在低反射区L。
接着，来自光源(未显示)例如发光二极管(LED)、激光二极管(LD)或卤灯的激发光照射到DNA芯片100上激发荧光染料152，并且根据Stock定律，荧光信号具有比激发光较长的波长，即，由荧光染料152产生发射波长λF，并且通过光检测器160检测荧光信号。
荧光信号的强度SF可以方程5表示。 在方程5中，F(λ)为表示荧光信号幅度的函数。
光检测器160检测的高反射区H的杂交信号不仅包括从荧光染料152产生的荧光信号而且也包括反射信号，后者是由于高反射区H的多层膜荧光信号反射所致。
因此，杂交信号的强度SH可以方程6表示。 在方程6中，RH(λ)为高反射区H反射率RH的函数，可从方程1、2和3推导出来。
参考方程6，反射信号的强度随着高反射区H反射率RH的增加而增加，并相应地，杂交信号的强度SH也增加。
另一方面，光检测器160检测的低反射区L的背景信号SB包括从残留荧光染料152产生的荧光信号及其反射信号，以及从射向低反射区L的光源辐射的激发光的反射信号。因此，低反射区背景信号SB的强度可以方程7表示。
在方程7中，I(λ)为从光源辐射的激发光波幅的函数，且RL(λ)为表示低反射区L反射率RL的函数，其可从方程1、2和3推导得出。
参考方程7，随着低反射区L的反射率RL的降低，反射信号的强度降低，并因此地背景信号SB的强度也降低。
如前所述，作为DNA探针140和靶DNA 150之间杂交反应结果的杂交信号SH的强度，可由于高反射区H的高反射率RH而进一步增加，而作为噪音的背景信号SB的强度，可由于低反射区L的低反射率RL而进一步地降低。因此，光检测器160检测杂交信号的检测灵敏度增加。
图5为根据本发明的第二典型实施方案的多层结构的DNA芯片的横截面图。在本发明的第一典型实施方案中，高反射区和低反射区只由2层薄膜组成。但是，在图5描述的第二典型实施方案中，高反射区和低反射区由更多层膜组成。
参考图5，在根据本发明的第二典型实施方案的DNA芯片200中，高反射区H这样形成具有低折射率的第一层薄膜221和具有高折射率的第二层薄膜222交替堆积在载体210上。低反射区L在载体210上由多层具有低折射率的第一层薄膜221和具有低折射率第三层薄膜223的多重结构交替形成。
载体210可由例如折射率为3.5的硅片、玻璃、石英或塑料的固体物质形成，如在本发明的第一实施方案中一样。具有高折射率的第二层薄膜222可由TiO2形成，并且具有低折射率的第一层和第三层薄膜221和223可由氧化硅形成，如在本发明的第一典型实施方案中描述的那样。
在高反射区H具有低折射率的第一层薄膜221以及具有高折射率的第二层薄膜222的厚度可分别地如第一典型实施方案中的方法确定。同时，低反射区L的总厚度也可如第一实施方案中确定。但是，随着高反射区H总厚度的增加，低反射区具有奇数倍例如3、5或7倍λF/4nL的厚度。
可在高反射区H和低反射区L的表面上形成具有氨基或醛基的涂层膜230以固定DNA探针240。至少将已知序列DNA的单链DNA探针240固定在高反射区H。
在根据本发明的第二典型实施方案成形的DNA 200芯片中，由于高反射区H具有第一层薄膜221和第二层薄膜222的交替堆积结构，根据方程1、2和3，高反射区H的反射率较高。
相应地，当用荧光染料252标记的靶DNA 250在DNA芯片200的表面反应的时候，从DNA探针240和靶DNA 250之间杂交反应产生的杂交信号强度SH就增加，并且光检测器260的杂交信号检测灵敏度也增加。
图6为根据本发明的第三典型实施方案的多层结构DNA芯片的横截面图。本发明的第三典型实施方案的主要特征是低反射区L由单层膜形成，与本发明的第一和第二实施方案的低反射区L不同。
参考图6，在根据本发明的第三典型实施方案的DNA芯片300中，高反射区H包括依次堆积在载体310上的具有低折射率的第一层薄膜321和具有高折射率的第二层薄膜322。第一层薄膜321和第二层薄膜322如第二典型实施方案中一样依次堆积。
低反射区L由沉积在载体310上的具有低折射率的单层薄膜323形成。
在第三典型实施方案中，在高反射区H的第一层和第二层薄膜321和322以及在低反射区L的第三层薄膜323的厚度和材料，与本发明的第一和第二典型实施方案中的一样。同样，在高反射区H和低反射区L表面的涂层膜330的形成，以及已知DNA序列的单链DNA探针340的固定，与本发明的第一和第二典型实施方案中一样。
因此，根据本发明的第三实施方案的DNA芯片300，也产生了如前述典型实施方案中相同的效果。此外，第三实施方案的DNA芯片300可很方便地制备，由于低反射区L由单层低折射率的薄膜323形成。
在下文中，根据如图4中描述的本发明的第一典型的实施方案，将描述关于DNA芯片100中高反射区H和低反射区L的反射率的试验结果以及根据反射率的杂交信号和背景信号的结果。
在该试验中，载体110由折射率为3.5的硅片形成，第一层薄膜121和第三层薄膜123由折射率nL为1.45的二氧化硅(SiO2)形成，并且第二层薄膜122由折射率nH为2.3的氧化钛形成。用于标记靶DNA 150的荧光染料152的发射波长λF为550nm。
同时，根据如上所述的确定高反射区H厚度的方法确定薄膜的厚度。第一层薄膜121的堆积厚度为94.18nm，其约为99％λF/4nH，并且第二层薄膜122的堆积厚度为57.65nm，其约为96％λF/4nL。另一方面，优选地根据确定厚度的方法在低反射区L不形成第三层薄膜123，但是形成厚度为29.26nm的第三层薄膜以减少高反射区H和低反射区L之间的厚度差距，如在本发明说明书的前面部分所述。因此，低反射区L的总厚度为123.44nm，其约为130％λF/4nL。
图7显示了根据方程1、2和3得到的如上所述形成的DNA芯片100的高反射区H和低反射区L的反射率的计算结果。
参考图7，可以看出在400～700nm的波长范围里，高反射区H的反射率高于载体110。特别地，高反射区H的反射率在550nm波长附近最高，其为荧光染料152的发射波长λF。
参考图8，在400～700nm的波长范围里，低反射区L的反射率低于载体110。在700nm波长附近，低反射区L的反射率最低。这是因为形成了厚度约130％λF/4nL的低反射区L的原因。但是，在550nm波长附近，低反射区L的反射率低于载体110，该波长为荧光染料152的发射波长λF。
根据方程5、6和7计算出在具有上述反射率的高反射区H的杂交信号强度SH以及在具有上述折射率的低反射区L背景信号强度SB，并总结在表1中。
表1
参照表1，可以看出，与使用常规Si载体制备的芯片的情况相比，在本发明DNA芯片高反射区检测的杂交信号强度SH增加了约38.5％，在低反射区L检测的背景信号的强度SB下降了约21.3％。
相应地，杂交信号SH和背景信号SB之比SB/RH，其直接涉及杂交信号SH的检测灵敏度，与使用常规的Si载体制备的芯片的情况相比，在本发明DNA芯片中增加了74.2％。DNA芯片检测灵敏度的增加可以得到杂交信号的正确检测，从而可以进行靶DNA的DNA序列的有效分析。
如上所述，根据本发明的DNA芯片由具有高反射区和低反射区的薄膜的多层结构形成。这样，由于高反射区的高反射率，由DNA探针和靶DNA之间杂交反应产生的杂交信号在高反射区具有较高的强度，并且由于低反射区的低反射率，低反射区的背景信号具有较低的强度。因此，通过增加DNA芯片的检测灵敏度，可以得到正确的杂交信号。
尽管本发明参照其典型的实施方案进行了具体的描述和说明，但不应该被理解为局限于这里公开的实施方案。本领域普通技术人员在不偏离本发明范围的情况下可对上述描述的实施方案进行各种修饰。因此，本发明的准确范围不是由上述说明书所确定，而是由附加的权利要求及其等当物所决定。
权利要求
1.一种DNA芯片，包括载体；高反射区，其具有比载体高的反射率，该高反射区包括依次堆积在载体预定区域的具有相对低折射率的薄膜以及具有相对高折射率的薄膜；低反射区，其具有比载体低的反射率，该低反射区包括在载体高反射区周围堆积的具有相对低折射率的薄膜；以及至少在高反射区固定的DNA探针，在其上发生DNA探针和靶DNA之间的杂交反应。
2.权利要求1的DNA芯片，其中高反射区加工成形以使低折射率薄膜和高折射率薄膜在载体上交替堆积。
3.权利要求1的DNA芯片，其中低反射区加工成形以使低折射率薄膜堆积在载体上。
4.权利要求1的DNA芯片，其中在高反射区的高折射率薄膜的厚度为70％～130％λF/4nH，其中λF为标记靶DNA荧光染料的发射波长，nH和nL分别为高折射率薄膜的折射率和低折射率薄膜的折射率，并且在低反射区的低折射率薄膜的厚度为70％～130％λF/4nL。
5.权利要求4的DNA芯片，其中高折射率薄膜的厚度为λF/4nH，且低折射率薄膜的厚度为λF/4nL。
6.权利要求1的DNA芯片，其中低折射率薄膜的厚度为奇数倍λF/4nL，其中λF为标记靶DNA荧光染料的发射波长并且nL为低折射率薄膜的折射率。
7.权利要求1的DNA芯片，其中高折射率薄膜由选自具有折射率为2.0～2.5的TiO2、ZrO2、CeO2和Ta2O5的金属氧化物形成。
8.权利要求1的DNA芯片，其中低折射率薄膜由氧化硅形成。
9.权利要求1的DNA芯片，其中载体由选自硅片、玻璃、石英和塑料的材料形成。
10.权利要求1的DNA芯片，还包括在高反射区和低反射区表面上形成用于固定DNA探针的涂层膜。
11.权利要求10的DNA芯片，其中所述涂层膜由氨基和醛基物质之一形成。
全文摘要
本发明提供了一种具有多层薄膜结构的DNA芯片。所述DNA芯片包括载体；高反射区，其具有比载体高的折射率，并包括依次堆积在载体的预定区域之上的具有相对低折射率的薄膜以及具有相对高折射率的薄膜；低反射区，具有比载体低的反射率，并包括具有相对低的折射率薄膜，其堆积在载体高反射区的周围；至少固定在高反射区的DNA探针。DNA探针和用荧光染料标记的靶DNA之间的杂交反应发生在高反射区。DNA芯片杂交信号的检测灵敏度的增加为杂交信号提供了正确检测。
文档编号G01N33/53GK1538163SQ200410034658
公开日2004年10月20日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月16日
发明者刘在镐, 南升浩, 崔桓荣, 徐五权, 李相勋 申请人:三星电子株式会社