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专利名称：一种盐酸西布曲明的酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及一种减肥药残留检测方法，更具体的说是对盐酸西布曲明的一 种酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。
背景技术：
盐酸西布曲明，英文名称Sibutramine Hydrochloride,其化学名称为 (士)N^l-[l-(4-氯苯基)环丁基]-3-甲基丁基卜N,N-二甲胺盐酸盐一水合 物，CAS号106650-56-0，分子式是C17H26C1N'HCKH20，是西布曲明的盐酸盐 水合物。本品由德国Kno 11公司研制，该药于1997年11月获美国FDA批准 在美国上市;2000年5月，该药获国家药品监督管理局(SDA)批准在中国上市: 用于治疗肥胖症。盐酸西布曲明为口服中枢作用的减肥药，它口服迅速被吸收， 经肝脏首过效应，被肝脏的细胞色素P450 3A4同工酶代谢为两种活性产物，即 单去甲基西布曲明(仲胺类，Ml)和双去甲基西布曲明(伯胺类，M2)而产生作用。 西布曲明体内代谢产物的主要作用机制是抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺 的再摄�。�增加突触间隙去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的浓度，引起食欲中 枢饱胀感增强，产热量增加；而对去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的释放无明 显影响。研究还表明，西布曲明及其胺类活性代谢产物无明显抗胆碱、抗组胺 和单胺氧化酶抑制作用。适用于运动及饮食控制仍不能减轻的肥胖症。西布曲 明常见的消化系统不良反应主要有口干、厌食和便秘，还有少见的消化系统不 良反应为腹泻、胃肠炎和味觉异常，发生率一般<1%，偶有肝和肾损害的报道。 西布曲明具有升高血压和加快心率的作用，它的神经系统不良反应有失眠、头 痛、头昏、头晕等，也可有感觉异常、肢体痉挛、张力增加、思维异常、癫痫 发作。2002年12月后，"药健"批准文号被取消，保健品从此分流成药品和食 品。"曲美"、"赛尼可"等以化学药物成分为主的减肥保健品成为受到严格 监管的药品，而以食品为主要成分的减肥保健品则成为了保健食品。目前，我 国减肥保健食品面临两个主要问题， 一是虚假、夸大宣传，二是添加违禁药物。 针对减肥市场上的保健减肥食品夸大、虚假宣传问题，国家有关部门给予了高 度重视，并加大了执法力度， 一批有夸大、虚假宣传的问题被集中曝光。然而 相对于夸大宣传，在食品中添加一些药物及其结构改造物，此类违禁添加情况隐 蔽，它不仅违反了食品卫生法规，而且由于消费者对食品、保健品安全性的信 赖，不加限制地服用此类食品、保健品，对其健康的�：�极大。对于这种违禁 添加行为的监督和控制在技术上就显得比较困难。因大部分监督检验部门缺乏相应的检验方法和标准品，难以对产品中的该成分进行确证的检验，使得产品 添加违禁药物情况难以査处。现今盐酸西布曲明主要的分析方法有高效液相
色谱法、毛细管电泳法、LC-MS、 LC-MS/MS、 GC/MS、衍生化荧光分光光度 法、紫外光谱法及薄层色谱法等。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适用范 围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间长， 因此有必要研究特异性强，灵敏度高同时价格低廉，能快速简便的免疫检测技 术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内外尚没有针 对盐酸西布曲明结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以盐酸西 布曲明的代谢物双去甲基盐酸西布曲明M2为半抗原的用于盐酸西布曲明结构 检测的完全抗原。

发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测盐酸西布曲明残留的免疫学检测方 法，并且有较高的灵敏度和特异性。
本发明的技术方案如下利用胥传来、李灼坤、马伟等(一种适用于盐酸西 布曲明的免疫原合成方法)合成的免疫原免疫得到多克隆抗体，以双去甲基盐酸
西布曲明半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了盐酸西布曲明残留的间
接竞争酶联免疫法。
本发明通过以下步骤实现
一种盐酸西布曲明的酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的双去甲基 盐酸西布曲明免疫原免疫得到多克隆抗体，以盐酸西布曲明为标准品，以双去
甲基盐酸西布曲明半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立盐酸西布曲明的
间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下
(1) 以0.05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1:5000 1:8000，加入酶 标板中，每孔100pL， 4'C孵育过夜，然后用含0.1%明胶的上述碳酸盐缓冲液 作为封闭液，封闭2h;
(2) 用PBS将盐酸西布曲明标准品稀释成0.01， 0.1， 0.5， 1，5， 10，20ng/mL 系列浓度，及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50^iL/ L;以抗 体稀释液将多克隆抗体以1:6000 1:9000比例进行稀释，然后每孔加入50pL 稀释好的多克隆抗体，于37"温育lh，然后以PBST洗涤液洗涤3 5次；
(3) 将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以 1:3000-1:5000进行稀释，然后每孔加入100pL， 37。C作用lh后以PBST洗涤 液洗涤3~5次；
(4) 每孔加入显色液100pL， 37-C显色15min;加入终止液2M硫酸溶 液，每孔lOOpL;酶标仪450nm测吸光值A45()，与所作标准曲线对比算出待 测样品的盐酸西布曲明含量。配置显色液
A液0.933 g拧檬酸，3.68gNa2HP04'12H20， 18 nL30%H2O2用超纯水 定容至100 mL;
B液60 mg 3乂5,5^四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中；
使用前将A液与B液以5:1体积比混合。
更详细的步骤为
主要溶液配制
1) 配制磷酸盐0.01M(PBS)缓冲液 Na2HP04.12H20 3.62 g KH2P04 0.2 g NaCl 0.2g KC1 8.0g 加超纯水稀释至1000 mL;
2) 配制碳酸盐(CBS)缓冲溶液(0.05M) pH9.6 Na2C03 1.59g
NaHC03 2.93g 加超纯水稀释至1000 mL;
3) 配制PBST溶液含0.05% Tween-20的PBS溶液。
4) 配制封闭液含0.1%明胶的碳酸盐缓冲液。
5) 配制抗体稀释液含0.1Q/。明胶的PBST溶液。
6) 显色液
A液0.933 g拧檬酸，3.68gNa2HP04'12H20， 18 (xL 30%H2O2用超纯水 定容至100 mL;
B液60 mg 3,3^5，5L四甲基联苯胺(TMB)溶于100 mL乙二醇中； 使用前将A液与B液以5:1体积比混合。
7) 终止液2M的H2S04。 间接竞争ELISA实验方法的步骤如下
预先将盐酸西布曲明的标准品配制成lOOpg/mL的甲醇溶液作为工作母液， 在4。C保存待用。配制PBST溶液(0.01mol/L， pH7.4， 0.15mol/L NaCl， 0.5%Tween-20)，以此为基础配制系列反应液，用以稀释竞争物标准液和多克隆 抗体。
a、 包被用设定浓度的包被原包被酶标板，100pL/孔，4'C过夜。
b、 洗涤用PBST洗涤酶标板3次，每次3min,200pL/孔，然后甩干酶标板。
c、 封闭含0.1%明胶的包被缓冲液，200pL/孔，37。C封闭2h。d、 洗涤同b。
e、 竞争用PBST将盐酸西布曲明稀释成0.01， 0.1， 0.5， 1， 5， 10， 20 ng/mL 系列浓度，另设一个PBST空白对照，50pL/孔。然后每孔加入50pL稀释8100 倍的多克隆抗体，于37-C温育lh。
f、 洗涤同b。
g、 加酶标二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000)， 100(iL/孔，37 C反应lh。
h、 洗涤同b。
i、 显色加显色液100pL/ L，显色15min。 j、终止加终止液100pL/孔。
k、测定用酶标仪检测450nm的吸光值。
本发明的有益效果本发明建立了盐酸西布曲明的间接ELISA方法，为盐 酸西布曲明残留检测提供了一种快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗 体，费用较低且稳定性和重复性较好。灵敏度为0.1ng/mL，线性范围为0-100ng/mL， 半数抑制量(IC5o)为9.6ng/mL。免疫反应的高特异性和高亲和性使ELISA具有极 高的选择性和灵敏性，样本前处理过程简单。


图l盐酸西布曲明的标准抑制曲线。 具体实施方案
以下通过实施例进一步说明本发明。
一、 仪器
TGL - 40B台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂； KFLOW纯水机，凯佛隆公司； ZD-9556水平摇床，太仓科教器材厂；
Costar96孔8x12可拆酶标板，上海吉泰生物科技有限公司； MuLtiska Mks酶标仪，Thermo Labsystems公司； 可调试移液器，Thermo Labsystems公司；
涡旋混合器，上海沪西仪器分析厂。
二、 试剂
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(GAR-HRP)，康成生物工程公司； 四甲基联苯胺(TMB)，华美生物工程公司； 其他试剂均为分析纯试剂。
三、 步骤
1.免疫原和包被原的合成
合成免疫原(双去甲基盐酸西布曲明半抗原与牛血清白蛋白BSA偶联物) 和包被原(双去甲基盐酸西布曲明半抗原与卵清蛋白OVA偶联物)用衍生化后的混合酸酐法偶联，具体步骤如下
① 制备A液20mg(0.06627mmo1)双去甲基盐酸西布曲明溶液溶于1.5mL 溶解有8mg(0.08mmol)丁二酸酐的吡啶溶液中，然后常温下避光搅拌23小时后 用氮气吹干，再加N，N-二甲基甲酰胺DMF : 1,4-二氧六环体积比1 : 1的混合溶 剂1.2mL充分溶解后，加入21.2iiL(0.08mmol)三丁胺在冰水中搅拌IO分钟，再 加入12pL(0.08mmol)氯甲酸异丁酯室温搅拌反应lh,此液为A液。
② 制备B液称取100mg(0.00151mmol)牛血清白蛋白BSA(或67.95mg 卵清蛋白OVA)溶于5.8mL pH8.5的硼酸纳缓冲溶液中，低温保存。此液为B 液。
③ 在低速搅拌下，将A液逐滴地滴加到B液中，室温下搅拌反应24h， 离心去掉沉淀，取上清液即得到人工抗原混合液。
④ 将人工抗原混合液移入透析袋中，用6X1L的去离子水透析4-6天。最 后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原双去甲基盐酸西 布曲明-牛血清蛋白(或包被原双去甲基盐酸西布曲明-卵清蛋白)。
2、 ELISA反应过程
抗体效价测定步骤
1) 将包被原用碳酸盐缓冲液作系列稀释包被96孔酶标板，100 ^L/孔，于 4 'C冰箱过夜。次日取出酶标板回至室温，每孔注入200 ^iLPBST溶液，摇床 上振荡3min，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤2次。以下洗 涤方法相同。
2) 充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200pL/ L，于37 "C温育箱 内温育2h后取出烘干待用。
3) 将阳性血清系列稀释对应加入到酶标板的前7行列，第8行加入阴性血 清，100pL/孔，37。C孵育lh后洗涤、拍干。
4) 毎孔加入100mL， 1:4000稀释的hrp标记的羊抗兔gar-hrp， 37°。孵 育lh后洗涤、拍干。
5) 每孔加入100pL显色液(TMB与底物液比例为1:5)，暗处37'C反应15min， 取出后每孔加入100pL终止液(2 mol/L的硫酸)，用酶标仪测定吸光值~50。
抗体特异性测定步骤
a、 包被用设定浓度的包被原包被酶标板，100nL/孔，4"C过夜。
b、 洗涤用PBST洗涤酶标板三次，每次3min， 200pL/ L,然后甩干酶标板。
c、 封闭含0.1%明胶的碳酸盐缓冲液，20(HiL/孔.37'C封闭2h。
d、 洗涤同b。
e、 竞争用PBST将盐酸西布曲明母液稀释成O.Ol， 0.05， 0.1， 1， 5， 10，50ng/mL系列浓度，另设一个PBST空白对照，50pL/孔。然后每孔加入50pL 稀释4000倍的多克隆抗体，于37'C温育lh。
f、 洗涤同b。
g、 加酶标二抗(羊抗兔GAR-HRP， 1:4000)， 100pL/孔，37 C反应lh。
h、 洗涤同b。
i、 显色加显色液100^iL/孔，显色15min。 j、终止加终止液lOOiaL/孔。
k、测定用酶标仪检测450nm的吸光值。 试验结果如下
1、 标准曲线本实验所获得的抗体检测的线性范围是为0 100ng/mL。
2、 灵敏度灵敏度是所得90%最大吸光值所对应的标准品的浓度，即IC90 为0. lng/mL。
权利要求
1、一种盐酸西布曲明的酶联免疫检测方法，其特征在于利用合成的双去甲基盐酸西布曲明免疫原免疫得到多克隆抗体，以盐酸西布曲明为标准品，以双去甲基盐酸西布曲明半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立盐酸西布曲明的间接竞争酶联免疫检测方法；步骤如下(1)以0. 05M的碳酸盐缓冲溶液稀释包被抗原1∶5000～1∶8000，加入酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜，然后用含0.1％明胶的上述碳酸盐缓冲液作为封闭液，封闭2h；(2)用PBS将盐酸西布曲明标准品稀释成0.01，0.1，0.5，1，5，10，20ng/mL系列浓度，及处理好的样品，分别加入到各自的酶标孔中，加50μL/孔；以抗体稀释液将多克隆抗体以1∶6000～1∶9000比例进行稀释，然后每孔加入50μL稀释好的多克隆抗体，于37℃温育1h，然后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(3)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔GAR-HRP用抗体稀释液以1∶3000～1∶5000进行稀释，然后每孔加入100μL，37℃作用1h后以PBST洗涤液洗涤3～5次；(4)每孔加入显色液100μL，37℃显色15min；加入终止液2M硫酸溶液，每孔100μL；酶标仪450nm测吸光值A450，与所作标准曲线对比算出待测样品的盐酸西布曲明含量。
全文摘要
一种盐酸西布曲明的酶联免疫检测方法，属于免疫检测技术领域。本发明利用合成的双去甲基盐酸西布曲明免疫原免疫得到多克隆抗体，以盐酸西布曲明为标准品，以双去甲基盐酸西布曲明半抗原与OVA的偶联物作为包被抗原，建立了盐酸西布曲明的间接竞争酶联免疫分析方法。本发明建立了盐酸西布曲明的间接竞争ELISA方法，为盐酸西布曲明的残留检测提供了一种快速高效的检测方法，由于采用的是多克隆抗体，费用较低且稳定性和重复性好，灵敏度为0.1ng/ml，线性范围为0～100ng/ml，免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。
文档编号G01N33/543GK101413946SQ20081023485
公开日2009年4月22日 申请日期2008年10月31日 优先权日2008年10月31日
发明者徐丽广, 李灼坤, 胥传来, 伟 马 申请人:江南大学