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专利名称：一种快速测定乳酸菌发酵产物有机酸种类和产量的方法
技术领域：
本发明涉及乳酸菌发酵产物检测领域，特别涉及一种快速测定乳酸菌发酵产物有机酸种类和产量的方法。
背景技术：
目前对乳酸菌发酵液中有机酸种类和产量的测定还没有统一的标准。故建立一种快速测定乳酸菌产有机酸产量的方法具有重要的意义。乳酸菌的培养基中一般以糖类物质作为碳源，在细菌生长代谢过程中会将培养基中的碳 源物质分解成为甲酸、乙酸、丙酸、乳酸等有机酸，测定这些有机酸的成分、含量及其在发酵过程中的变化，对了解乳酸菌的代谢特性和发酵过程中代谢产物的监控都是非常有用的。目前，有机酸的检测方法主要有分光光度法、酶法、薄层色谱法、气相色谱法、离子色谱法和液相色谱法。分光光度法是以有机酸和一些特定物质反应能生成有色物质为机理测定有机酸含量，该法易受干扰，通常需要将提取液进行沉淀、离子交换树脂等前处理，步骤繁冗。酶法虽然特异性较强，能够测定有机酸的构型，但是每次只能测定一种有机酸，比较耗时。气相色谱法不仅需要通过液液萃取将有机酸萃取到有机相中，还需进行柱前衍生化以提高其挥发性，且常因为衍生化反应不易定量而直接影响测定结果的准确性。离子色谱法虽然对于样品预处理的要求比较简单，但高浓度的无机离子可能会干扰有机酸根离子的测定。

发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种快速测定乳酸菌发酵产物有机酸种类和产量的方法。本发明的快速测定乳酸菌发酵产物有机酸种类和产量的方法，包括分别制备样品溶液和标准品溶液，用反相HPLC梯度洗脱法测定乳酸菌发酵产物中有机酸的种类和含量，其中，流动相A液为甲醇，流动相B液为0. OlM的磷酸二氢钠水溶液，(T9. 5min为100%B液，9. 5 IOmin A 液升至 55%，B 液降至 45%，l(Tl3min 保持 55%A 液，45%B 液，13 15min A 液降至 45%，B 液升至 55%，15 25min 保持 55%A 液，45%B 液，25 28min B 液升至 100%，28 30min保持100%B液。其中，所述的反相HPLC的色谱条件为色谱柱为C18柱，250mmX4. 6mm，5iim，采用低压梯度洗脱，检测波长为215nm，柱温3(T40°C，采样时间为30min。优选地，所述的柱温为35。。。其中，所述的样品溶液制备方法为取乳酸菌发酵液lmL，加入体积分数50%的硫酸200 V- L, 10000r/min离心5min,取上清液100 u L稀释至500 u L,经0. 45 u m滤膜过滤。其中，所述的标准品溶液制备方法为分别取有机酸标准品，加入水配成50mg/mL> lOOmg/mL或150mg/mL母液备用，使用时混合并稀释至所需浓度,经0. 45 y m滤膜过滤。所述的标准品为酒石酸、氨基丁酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、丙酸、丁酸。其中，梯度洗脱流速0 IOmin 为 0. 7mL/min, 10 30min 为 lmL/min。
其中，所述的0. OlM磷酸二氢钠水溶液pH值为2. 8^3. O。其中，进样量为IOii L。本发明采用反相HPLC低压梯度洗脱测得乳酸菌发酵产有机酸种类和含量，可以做到7种有机酸基线分离、峰形良好。本发明方法简便、迅速，灵敏度高，重现性好。


图I为7种有机酸混合标准品色谱图。图2为干酪乳杆菌发酵液色谱图。 图3为植物乳杆菌发酵液色谱图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I标准品的HPLCI.仪器与样品LC-20A (日本岛津)高效液相色谱仪，BT25S型电子天平(d=0. Olmg赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，KQ5200B型超声清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；色谱甲醇(Fisher Scientific),水(18. 2MQ cm Millipore Rios 系列),其他试剂均为分析纯。乳酸菌发酵产有机酸标准品为酒石酸、氨基丁酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、丙酸、丁酸(Sigma 试剂)。2.方法与结果2. I标准品溶液的制备分别取有机酸标准品，加入超纯水配成100mg/mL或50mg/mL、150mg/mL母液备用，使用时混合并稀释至所需浓度，经0. 45 y m滤膜过滤后分析。2. 2色谱条件与系统适用性试验色谱条件为色谱柱为C18 柱(250_X4. 6mm, 5 ii m, GLSciences Inc.),流动相为甲醇-0. OlM的磷酸二氢钠水溶液，其中流动相A液为甲醇，流动相B液为0. OlM的磷酸二氢钠水溶液(浓磷酸调节PH值为2. 8^3. 0)，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1，检测波长为215nm,柱温35°C,进样量为IOy L,记录时间为30min。在上述色谱条件下,标准品混合色谱图见图I。从图I中可以看出，在本试验条件下可以做到7种有机酸基线分离且峰形良好。表I梯度洗脱程序时间程序流速流动相i组成 0~9.5min 0.7 inL/min 100% B 9.5 I Omin 0.7 mL/min 55% A+45% B IO^ Bmin I mL/min 55% A+45% B13-15min I mL/min 45% A+55% B 15~25min I mL/min 45% A+55% B 25~28min I mL/min 100% B 28~30minI mL/min_100% B_
实施例2样品的HPLC分离乳酸菌为干酪乳杆菌和植物乳杆菌。分别取干酪乳杆菌和植物乳杆菌的发酵液lmL，加入50%硫酸200 u L，10000r/min离心5min,取上清液100 V- L稀释至500 u L,经0. 45 y m滤膜过滤后分析。将制备好的样品放入自动进样器的样品架上，每个样品重复3次进样、每次进样IOuL, HPLC的色谱条件以及洗脱程序与实施例I相同。干酪乳杆菌和植物乳杆菌的色谱图分别如图2和图3所示。从图2、图3中可以看出，在本试验条件下可以做到发酵液产有机酸基线分离且峰形良好，且重复性好。进样后根据峰面积用标准曲线法计算样品中有机酸含量，取其平均值为平均百分含量，结果见表2。由表2可以看出，在本实施例中的2种发酵液样品中检测到3种有机酸的含量。表2乳酸菌发酵液中各有机酸含量单位:mg/mL
权利要求
1.一种快速测定乳酸菌发酵产有机酸种类和产量的方法，包括分别制备样品溶液和标准品溶液，用反相HPLC梯度洗脱法测定乳酸菌发酵产物中有机酸的种类和含量，其特征在于，流动相A液为甲醇，流动相B液为0. OlM的磷酸二氢钠水溶液，(T9. 5min为100%B液，9.5 IOmin A 液升至 55%，B 液降至 45%，l(Tl3min 保持 55%A 液，45%B 液，13 15min A 液降至 45%，B 液升至 55%，15 25min 保持 55%A 液，45%B 液，25 28min B 液升至 100%，28 30min保持100%B液。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的反相HPLC的色谱条件为色谱柱为C18柱，250mmX4. 6mm, 5 u m,采用低压梯度洗脱，检测波长为215nm，柱温3(T40°C，采样时间为30min。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的柱温为35°C。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的样品溶液制备方法为取乳酸菌发酵液ImL,加入体积分数50%的硫酸200 u L, 10000r/min离心5min,取上清液100 u L稀释至500 u L,经0. 45 u m滤膜过滤。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的标准品溶液制备方法为分别取有机酸标准品，加入水配成50mg/mL、lOOmg/mL或150mg/mL母液备用，使用时混合并稀释至所需浓度，经0. 45 ii m滤膜过滤。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，梯度洗脱流速(TlOmin为0.7mL/min,10 30min 为 lmL/min。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的0.OlM磷酸二氢钠水溶液pH值为2.8 3. O。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，进样量为10yL。
全文摘要
本发明公开了一种快速测定乳酸菌发酵产物有机酸种类和产量的方法，包括分别制备样品溶液和标准品溶液，用反相HPLC梯度洗脱法测定乳酸菌发酵产物中有机酸的种类和含量，其中，流动相A液为甲醇，流动相B液为0.01M的磷酸二氢钠水溶液，0~9.5min为100%B液，9.5~10minA液升至55%，B液降至45%，10~13min保持55%A液，45%B液，13~15minA液降至45%，B液升至55%，15~25min保持55%A液，45%B液，25~28min B液升至100%，28~30min保持100%B液。本发明采用反相HPLC低压梯度洗脱测得乳酸菌发酵产有机酸种类和含量，可以做到7种有机酸基线分离、峰形良好。本发明方法简便、迅速，灵敏度高，重现性好。
文档编号G01N30/89GK102721781SQ20121021672
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者刘媛媛, 张军, 汪攀, 王安如 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 吉林大北农农牧科技有限责任公司, 漳州大北农农牧科技有限公司