专利名称：新的超灵敏的基于细胞的传感器及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的基于细胞的传感器，其有效用于药物发现，诊断和测定分析物，所述基于细胞的传感器包括具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的细胞系，所述细胞系用作为报道分子多肽的存储在具有专职受控胞吐作用的细胞系的受控分泌颗粒中的蛋白酶转染，并具有作为受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的内源或异源分子，所述颗粒存储的蛋白酶报道分子至少具有:针对颗粒内已经存在的条件诸如低PH和其他蛋白酶的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特异性切割序列；在无刺激或基础条件下非常低的分泌水平；和在与细胞培养物生存力和颗粒胞吐作用相容的培养基中高信号与背景活性比，以获得高通量的可靠且灵敏的检测。当基于细胞的传感器使用胞吐作用调节剂的特异性配体温育时，报道分子多肽由颗粒释放至胞外培养基中并且这些释放的报道分子多肽的酶活性使用特异性底物来检测。本发明还容许开发多重测定，其通过在同一反应器中混合至少两种细胞系(各细胞系具有不同的成对的胞吐作用调节剂-颗粒存储的蛋白酶报道分子)和使用各颗粒存储的蛋白酶报道分子的高特异性底物来检测胞吐作用来进行。这些灵敏的基于细胞的传感器有效用于测试至少两个分子之间的相互作用，一个分子担当胞吐作用调节剂且另一个担当胞吐作用调节剂的特异性配体。所述传感器的应用的实例是:为了测试药物发现中分子间相互作用，为了定量分子诸如蛋白从而诊断和检测例如食品工业中、环境样板中和制药工业中数种样品中的药物或分子。
背景技术：
发现新的治疗剂的方法传统上涉及以下阶段:在患者中或在合适的模型系统中，(I)鉴定药物靶标，(2)验证所述靶标，(3)筛选影响靶标活性的化合物，(4)测试前导化合物毒性，(5)测试前导化合物副作用，和(6)检验前导化合物的代谢和稳定性。高通量筛选(HTS)是药物发现过程的最初阶段之一。其容许测试数十万化学化合物/日，从而选择最卓越的候选者进行未来的检验。化合物针对治疗靶标进行测试。近期现代大规模筛选的发展受到由基因组学鉴定的数量越来越多的靶标和利用组合化学方法合成的化合物文库的扩大的高度影响。例如，质膜接纳超过20种不同的受体家族，包括超过1000种不同的蛋白，其被称为受体组(receptorome)。G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族代表受体组的单个最大部分,尽管受体组还包括toll样受体、整联蛋白受体、低密度脂蛋白受体、蛋白酪氨酸激酶受体和磷酸酶、细胞因子受体和甚至一些起受体作用的离子通道。胞外和细胞表面受体之间的相互作用的治疗开发，其作为“药物-受体”概念发起，被认为是20世纪生物医学科学中的重大思想和见解之一。由于靶标鉴定的持续进步，筛选技术和靶标验证，基于受体组的药物发现努力可能在未来数十年中具有生产价值。毫不意外地，大多数专家断定受体组占可药用基因组的最大部分，其中GPCR始终引领该团体。最初的大规模筛选技术之一是竞争性放射性配体结合测定，其依赖于选择性靶向目的受体的高度特异活性放射性配体的使用。竞争性放射性配体结合测定，在典型地进行时，提供关于特定分子靶标的药物亲和性的可靠评估，但是不提供关于功效(作为激动剂、拮抗剂或部分激动剂)的信息。传统上，药理学家已经依赖竞争性放射性配体结合测定来测量配体亲和性和受体特异性，并将生理学相关性归因于GPCR。竞争性放射性配体筛选经得起近-HTS(near-HTS)技术的检验，因为它们可以在96+孔板中进行，这已经被证实对于有效筛选针对受体阵列的受关注化学品文库具有无法估计的价值。竞争性放射性配体结合测定还有助于使化学结构与药物副作用相联系。即使放射性配体筛选在不同细胞表达系统之间是一致的，它们具有数种缺点，这些缺点使得研究转向另外的技术。例如，放射性配体测定不区分激动剂、部分激动剂、拮抗剂和反激动剂。但是更重要地，放射性配体测定不能检测配体结合下游发生的响应，并且同样不适合使孤独受体脱孤(deorphanizing)，这是因为，通过定义，这些oGPCR具有未知的配体。另外，放射性配体结合测试，典型地，对于检测与内源受体位点(正构位点，orthosteric site)结合的配体具有偏差并因此可能不能检测在与内源位点不同的位点，即变构位点处发挥其作用的小分子调节剂。与放射性配体结合测试相反，功能性测定产生信息丰富的配体特征，其揭示配体如何调节例如GPCR中的信号转导。这样的功能性测定依赖于第二信使的检测，其作为受体-特异性信号转导途径的结果产生。这样的方法之一，使用利用钙灵敏性荧光团作为信号测量的胞内钙增加；而其他方法使用与报道分子如荧光素酶偶联的钙或cAMP灵敏性启动子来测量受体活化或抑制。胞内钙增加利用钙灵敏性染料(其在胞内染料结合钙时增加其荧光)和通过钙传感蛋白，称为水母发光蛋白(aequorin，其在添加肠腔素(coelenterazine)衍生物时产生发光信号)来测量。但是这两种钙测定均具有以下缺陷:(1)它们不能用于筛选反激动剂；(2)配体添加和钙增加之间的短时间间隔要求高度专门化设备进行同时的配体添加和钙测量；和(3)不放大信号。存在许多测量基于细胞或膜的 cAMP 累积的技术，诸如 SPA (GE Healthcare (GE 卫生保健))、FlashPlate (PerkinElmer) >AScreen (Perkin Elmer)、HTRF cAMP(Cisbio)和 HitHunter (DiscoveRx)。基于报道基因的筛选技术是基于细胞的测定，其中第二信使的增加诱导报道分子，例如荧光素酶、β -内酰胺酶、SEAP和β -半乳糖苷酶的表达。理想的筛选技术应该是简单、非放射性、具有高信噪比、均相、具有最少的试剂添加和可按照微量滴定板形式处理以促进自动装置自动操作。另外的考虑因素是是否测量最近或最远信号传导步骤。最接近靶标活化处事件的测量将减少假阳性的发生率；然而信噪比可以随信号转动级联向下移动而得到提高，这归因于信号放大。使用与第二信使如钙或cAMP灵敏性启动子偶联的报道分子的另一个缺点是那些方法依赖于诱导型启动子，所述诱导型启动子通常是具有高背景的弱启动子，且报道分子需要在溶解产物中或作为分泌产物在转录和翻译后进行测量。使用其中报道分子随配体-蛋白相互作用迅速分泌至胞外培养基中的方法在药物发现筛选中应该是理想的，因为其消除细胞溶解步骤，以释放胞内报道分子。而且，使用方法，如使用特异性荧光团测量胞内钙，消除了转录和新合成的需要，由此缩短了测定时间。这种测定时间的缩短在方法，如均相3456纳米板筛选(homogeneous3456 nanoplate screening)中非常重要,其中反应体积非常低，因此使得试剂蒸发特别相关。而且，使用纳米板来筛选要求非常灵敏的方法来定量非常小量的报道分子或第二信使，并且因此可以随着信号放大级联随意偶联的报道分子是理想的。但是，由于背景在信号放大级联中也会被放大，特别是由于所述级联中第一步引起的背景，所以存在对具有最低可能信号背景比的高度特异性报道分子的需要。最后，向纳米板的各个孔中添加一种或两种试剂的方法在药物发现过程中是优选的。因此，理想的筛选技术应该是以下的混合:(I)基于报道分子的方法的高灵敏性；(2)第二信使方法的低假阳性率；(3)无转录的第二信使方法的短测定时间；(4)基于蛋白报道分子的方法的稳定信号；(5)均相法的最少试剂添加或测定产物分离；(6)具有高信噪比的可靠信号；(7)可放大的信号以减小测定体积同时保持高信噪比和(8)可以用于绝大多数人类可药用基因组的通用读数。具有预先形成的报道分子的受控胞吐作用的细胞可以达到数种上述条件，并且因此这样的基于细胞的传感器可以在药物发现和化合物表征中具有高效用。内源性β_氨基己糖苷酶已经是最广泛用于脱粒的溶酶体报道分子，但是该蛋白被认为是低灵敏性报道分子。例如，Tiberghien 等(Tiberghien 等.Journal of Immunological Methods (免疫学方法杂志)223_1999.63-75)开发了一种方法，其中早幼粒HL-60细胞分化并用于构建96孔微量板方法，其利用过滤而非离心法收集胞外流体以及β_氨基己糖苷酶，作为通过酶学测量的细胞释放酶。该方法使用非专职细胞，所述非专职细胞需要分化以诱导分泌，β_氨基己糖苷酶报道分子和化学引诱物受体二者均是内源性的且由此低表达，并且以上因素的组合导致需要至少250.000个细胞/孔来进行筛选的方法。因此，作者主张他们的方法的主要优点是使用过滤而非离心法来收集胞外流体。在其他测定中，Naal RM等.Biosens Bioelectron(生物传感器和生物电子学)2004年11月I日；20(4):791_6。Naal等已经开发了直接脱粒测定，从而容许在单一步骤中使用RBL-2H3肥大细胞作为生物传感器来筛选用于药物发现的化学品文库，并基于内源性β_氨基己糖苷酶向胞外环境中的释放进行环境毒性评价。该作者预期使用该方法检测半抗原-1gE相互作用和筛选对于脱粒非常关键的syk酪氨酸激酶活性的药理学抑制剂。那些作者还使用内源性β_氨基己糖苷酶作为报道分子，并仅使用该方法检测半抗原-1gE相互作用和筛选参与脱粒的酪氨酸激酶的药理学抑制剂。另外，在该方法中，仅使用贴壁细胞并且因此需要进行各孔的洗涤步骤以消除背景，所述背景由测定前16-24小时细胞培养过程中累积的基本氨基己糖苷酶活性和细胞培养基中使用的牛血清中正常存在的β_氨基己糖苷酶活性引起。这种各孔的洗涤步骤限制通量，增加成本，并且当在具有自动化移液自动装置的HTS环境中进行时，测定中的信号背景比减�。夤橐蛴诳字胁辛籼寤邪被禾擒彰富钚�。最后，由于氨基己糖苷酶通过大多数具有专职受控胞吐作用的造血细胞系来表达，所以该酶仅容许开发单重测定(monoplex assay)而非多重测定(multiplex assay)。在第三种方法中，Graminski,GF等(见Graminski GF 等 J.Biol.Chem.(生物化学杂志)(1993)，268，8，5957-5964)已经使用由受体介导的青蛙载黑素细胞(melanophore)中的色素分散，所述受体激活蛋白激酶A或蛋白激酶C，从而通过功能性测定迅速评估化学品对于激活PKA或PLC的受体的作用，所述功能性测定用于研究配体-受体相互作用和大规模药物筛选。该方法的主要缺点是使用非哺乳动物来源的细胞进行受体-配体相互作用的功能性评估和比色法检测在与荧光或化学发光方法相比时具有低灵敏度。已经开发了其他方法来研究胞内运输和溶酶体靶向的配偶体和荧光蛋白，诸如GFP之间的融合蛋白分泌。在第一种方法中，EI Meskini, R等(见EI Meskini R等.Endocrinology (内分泌学)2001，142-2，864-873)已经使用具有GFP的前原神经肽(preproneuropeptide) Y融合体来探查AtT_20细胞、PC-12细胞和初级垂体细胞中嵌合蛋白在经历受刺激释放的LDCVs中产生GFP存储的轨迹。在2002年，Rajotte (W02004/016212)声称他已经开发了通过使RMCP与GFP融合来检测和定量脱粒的技术，但是该方法仅有效用于测量运输而不能定量，这是由于细胞释放GFP的低灵敏度。其他研究者已经将GPCR转染至专职分泌细胞如RBL-2H3中，但是内源性β -氨基己糖苷酶始终是用于测量脱粒的报道分子，仅贴壁细胞被用于进行测定，并且因此需要另外的洗涤步骤来消除背景，因此损害通量，并且该酶仅容许单重测定的开发。而且，用于将表面受体如GPCR表达至造血细胞诸如RBL-2H3中的启动子和条件需要仔细优化，以获得一致的结果。例如，腺苷3受体被认为是这样的GPCR，其本身不脱粒但是加强由未达最佳标准量的IgE-变应原诱导的脱粒。因此，目前的技术状态未教导我们如何开发适合用于HTS中的基于脱粒的可靠且灵敏的传感器。直至本发明，不存在关于使用高度特异性丝氨酸蛋白酶如粒酶Α、B，人胃促胰酶，蛋白酶3或嗜中性粒细胞弹性蛋白酶作为存储在分泌溶酶体中的报道分子从而开发有效用于药物发现或检测用于诊断的分子的造血基于细胞的传感器的报道。目前的技术状态使用内源性β -氨基己糖苷酶作为报道分子，其通过测量来自至少50.000个细胞，即相对大量细胞的该酶活性进行(见Schwartz等.J.1mmunol.(免疫学杂志)123:1445-1450，1979 ；和 Dragonetti 等.J.Cell Sc1.(细胞科学杂志)113:3289_3298，2000)，或者与 GFP 融合从而追踪分泌溶酶体运动的溶酶体酶受到实时监测。本发明描述了基于蛋白酶报道分子脱粒的高度灵敏的基于造血细胞的传感器，其有效用于测试至少两个分子之间的相互作用，具有高信号背景比从而进行可靠测量，快速的动力学，具有适用于高通量筛选的最少步骤，并使用报道分子酶的灵敏底物以检测来自少量细胞的分泌酶从而减小成本。该基于细胞的传感器可以用于单重或多重测定中。多重测定具有数种超越单重测定的优势，例如:增加的通量、不损害数据质量条件下的成本降低，或甚至提高的数据质量，这是因为各测定具有作为内部对照的在同一孔中进行的另一个测定。发明目的定义转导器定义为将信号由一种形式变换为另一种形式的任何装置。例如，基于本发明生物传感器的细胞将细胞表面处的配体与受体相互作用变换为预先存储在细胞内部的报道分子多肽的分泌，因此该报道分子的酶活性测量与配体-受体相互作用相关。传感器是一种类型的转导器。转换生物信号的传感器称作生物传感器。所有活生物体包含生物传感器，其具有与机械传感器类似的功能。大多数生物传感器是对以下敏感的特化细胞:光、运动、温度、磁场、重力、湿度、振动、压力、电场、声音，和外部环境的其他物理方面；内部环境的物理方面，诸如伸展、生物体运动和附肢位置(本体感受)；环境分子，包括毒素、营养物和信息素的巨大阵列；许多内部代谢环境方面，诸如葡萄糖水平、氧水平或摩尔渗透压浓度；和变化范围的内部信号分子，诸如激素、神经递质和细胞因子。通过使用生物灵敏性元件模拟生物传感器的人工传感器称作生物传感器。
受控胞吐作用，是这样的过程，其中特化细胞分泌神经递质、激素、酶、肽或低分子量物质(例如儿茶酚胺、谷氨酸盐等)。在胞吐作用过程中，细胞活化产生一系列胞内事件，其导致包含货物的小泡递送至细胞表面膜(质膜)，其以这些小泡的子集与质膜特化区的融合而终结。虽然胞内Ca2+浓度上升经常触发胞吐作用，但是其他胞内信号包括cAMP、二酰甘油(DAG)、磷脂和ATP也控制或调节Ca2+_触发的胞吐作用。分泌颗粒或分泌小泡或分泌溶酶体是特化的胞内细胞器，其担当选择的分泌产物的存储库。分泌颗粒通过刺激剂或调节剂作用向细胞外周运动，它们的膜与细胞膜融合，并且它们的内容物负荷被释放。尽管在大多数细胞类型中，分泌颗粒似乎代表完全新的细胞器，不同造血细胞和某些其他细胞类型中的颗粒与溶酶体共享数种性质。造血细胞，是源自骨髓干细胞并包含全部血细胞类型的细胞，其包括髓样(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和一些树突细胞)和淋巴样谱系(T-细胞、B-细胞、NK-细胞、一些树突细胞)。具有受控胞吐作用的细胞系:用于本文中时，术语“具有受控胞吐作用的细胞”、“专职分泌细胞系”和“具有专职受控胞吐作用的细胞系”可以互换使用。对于本发明方法重要的细胞系是具有专职受控胞吐作用的造血细胞系。所有这些术语还包括它们的后裔，即任意和所有后代。已知所有后裔可能不相同，其归因于蓄意或无意的突变。有效用于基于细胞的传感器的具有受控胞吐作用的细胞系是通常改造为表达颗粒存储的报道分子的宿主细胞，所述报道分子通过胞吐作用调节剂如细胞表面受体，诸如GPCR的作用，在激动剂配体结合后释放至培养基中。报道分子多肽或报道分子:是基因，研究者将该基因与细胞培养、动物或植物中的另一目的基因连接。某些基因被选作报道分子，因为它们赋予表达它们的生物体的特征是容易鉴定和测量的，或因为它们是可选择性标记物。报道基因通常用于确定目的基因是否被细胞群或生物体群吸收或表达。本文中的报道基因是存储在专职分泌细胞系如某些造血细胞的分泌颗粒内部的多肽，并且通过胞吐作用刺激剂或调节剂作用释放至胞外培养基中。蛋白酶:蛋白由作为基本成分的氨基酸组成，其中酰胺键在一个氨基酸的COOH和下一个氨基酸的NH2之间形成，从而形成肽键。术语蛋白酶与肽酶同义，其意指肽键水解酶，并包括内肽酶和外肽酶。因此，催化在中性PH和环境温度下肽键水解的能力表征蛋白酶，其中不同催化机制位于多种在除此之外的其他情况下为不相关的蛋白支架中。目前存在6类蛋白酶:丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶(例如，疟原虫天冬氨酸蛋白酶(plasmepsin))/金属蛋白酶和谷氨酸蛋白酶。用于切割肽键的机制包括制备具有半胱氨酸和苏氨酸(肽酶)或水分子(天冬氨酸、金属和谷氨酸肽酶)亲核性的氨基酸残基，以使其攻击肽羰基。一种制备亲核物质的方法是通过催化三联体，其中使用组氨酸残基激活丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸作为亲核物质。所有蛋白酶中的底物结合位点由相当大量氨基酸残基组成，所述氨基酸残基确保水解前底物的正确排列并有助于通过稳定过渡态促进催化。结合位点被分为许多亚位点，其各自多重相互作用固定底物的单个氨基酸残基。除与特异性侧链的相互作用以外，肽主链的结合也在催化作用中扮演重要角色。蛋白酶特异性经常在侧邻催化残基的亚位点背景中研究，并提供对肽或蛋白底物具有特别偏爱的酶。为了分析蛋白酶特异性，使用Berger和Schechter的命名法(见SchechterI,Berger A.Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学和生物物理研究通信)(1968) 32:898-902)。根据该命名法，蛋白酶反应位点中存在的氨基酸表示为S4，S3，S2，SI，SI,，S2,，S3'，且它们对应于具有序列P4，P3，P2，Pl，Pl'，P2'，P3'的底物中存在的氨基酸，其中切割Pl-PP肽键。例如，木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶家族具有明确的S3至SI'位点，其中一些个体蛋白酶具有更广泛的特异性。例如，粒酶B肽IIe-Glu-PiO-Asp-氨基甲基香豆素具有IIE作为P4，Glu作为P3，Pro作为P2且Asp作为Pl。关于数种蛋白酶，切割肽键后的氨基酸残基，即Pn'残基，也对特异性有贡献。例如，小鼠粒酶B在P2'位置处需要甘氨酸，从而有效切割底物。而且，人粒酶B的良好扩展底物是Ile-Glu-PiO-Asp-Ser-Gly-Met-Glu(P4-P3-P2-P1-P1; - 2' -P3/ -P4')。作为酶，蛋白酶可以通过它们的底物亲和性、反应催化速率以及它们的底物特异性或催化效率来动力学表征。Michaelis和Menten方程式描述关于简单的单位点反应的反应速率和特异性。Michaelis和Menten将底物S转化为产物P的过程分成两个步骤，如下
所示:·Km teatE + S <=> ES <=> E + P第一反应步骤描述底物与酶(催化剂)的结合，且常数Km对应于在这样的条件下的平衡解离常数，在所述条件下产物形成与底物解离过程相比非常低。Km等于半最大反应速率Vmax/2时的底物浓度。在该情形中，Km是是解离常数的合适近似值，且因此描述底物对酶的特异性。对于更复杂的反应，该常数反映与酶结合的所有底物的解离平衡。第二反应步骤描述催化速率或产物形成速率，并表示为转换数kMt。转换数定义为产物P的最大数量/活性位点/单位时间。Michaelis-Menten动力学仅在饱和条件下，即当底物S浓度比酶浓度高得多时有效。蛋白酶的另一种重要特性是它们的底物特异性。比率kMt/KmS义成对酶-底物的催化效率的度量。它表示游离酶和游离底物的性质和反应。酶的特异性因此是酶对竞争性底物或竞争性酶对单一底物的特异性的度量。蛋白酶被分类为内肽酶，条件是它们的切割序列在靶底物内部，或外肽酶，条件是它们需要氨基末端或羧基末端基团来进行切割。外肽酶因此被分类为氨基肽酶和羧基肽酶。数种造血细胞的颗粒天然存储蛋白酶如粒酶、肥大细胞蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白酶3、金属蛋白酶如MMP-8和MMP-9、丝氨酸蛋白酶组织蛋白酶如组织蛋白酶(cathepsin)A和G和半胱氨酸组织蛋白酶。粒酶和肥大细胞蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶超家族，这是由于它们与详尽记载的丝氨酸蛋白酶的高度氨基酸序列同一性；它们切割合成丝氨酸蛋白酶底物的能力和它们受到典型丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制，(见例如Smith MJ等J.Leukoc.Biol.(白细胞生物学杂志)1996，60 =555-562)。粒酶和肥大细胞蛋白酶的酶活性已经被分类为类胰蛋白酶-样(tryptase-like，在精·氨酸或赖氨酸后切割)，天冬裂酶-样(Asp-ase-like,在天冬氨酸后切割)，胃促胰酶-样(chymase_like,苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸后切割)和弹性蛋白酶-样(elastase-like，在缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸后切割)。组织蛋白酶是一类球状蛋白酶，最初描述为胞内肽水解酶，尽管一些组织蛋白酶也具有胞外功能。组织蛋白酶B，C，F，H，L，K，O, S，V，W，和X是木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶，且代表最大且最著名的组织蛋白酶类型。它们主要起胞内蛋白酶的作用，在溶酶体的酸性环境中介导末端非特异性大规模蛋白质水解(见例如Turk V，Turk B和TurkD.EMBO J(EMB0杂志)2001 ；20:4629-33)。组织蛋白酶A和G均是丝氨酸蛋白酶，但是组织蛋白酶G是内肽酶而组织蛋白酶A是羧肽酶。组织蛋白酶D和E是天冬氨酸蛋白酶。组织蛋白酶作为无活性酶原来合成并加工成为成熟的活性酶。粒酶:粒酶是结构相关的丝氨酸蛋白酶，其区别在于它们的底物特异性。它们天然表达在细胞毒性淋巴细胞诸如CD8阳性T淋巴细胞和天然杀伤细胞以及睾丸中。迄今为止，记述了人中的5种不同粒酶:粒酶A, B, H, K和M(见例如Grossman, WJ.等.Curr.0pinImmunol.(当前免疫学观点)(2003) 15，544-552)。在小鼠中，可以发现这些粒酶中的四种(A，B, K和M)的确定的直向同源物，且粒酶C似乎是最有可能的粒酶H的鼠直向同源物。鼠基因组编码数种另外的粒酶(D，E，F，G，L和N)，其中D，E，F和G由细胞毒性淋巴细胞表达山似乎是假基因且N在睾丸中表达。受控胞吐作用调节剂，指能够改变下游参与受控胞吐作用过程的一种或多种信号转导途径的化合物、分子或组合物。该活性改变包括抑制(即，所述化合物、分子或组合物是胞吐作用“抑制剂”)以及刺激、诱导或增强(即，所述化合物、分子或组合物是胞吐作用“刺激剂”、“诱导剂”或“增强剂”)。这些调节剂利用体外和/或体内测定来鉴定。在这些测定中，使用对照，从而允许样品之间的比较。药物发现，一种过程，通过该过程发现和/或设计药物。用于本文中时，药物发现包括药物鉴定和针对亲和性、副作用、生物利用率的改进，还包括在投放市场前测试药物在新的治疗适应证中的作用，即也称为重新分析(reprofiling)的过程。基因，是遗传性的基本物理和功能单元。在生物化学术语中，基因是位于编码特定功能性产物(即，蛋白或RNA分子)的特定染色体上特定位置中的核苷酸有序序列。用于本文中时，基因不仅由编码序列组成，而且可以包括参与控制编码序列转录的相邻DNA区(例如，启动子、增强子)和内含子。位于编码区5’处并存在于mRNA上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区3’处或下游并存在于mRNA上的序列称为3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含编码区，所述编码区中插入有非编码序列，称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”。内含子是转录为核内异质RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可以包含调节元件诸如增强子。内含子从细胞核或初级转录物中去除或“切除”;因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。mRNA在翻译过程中起作用，以指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序。“稳定引入的”或“稳定转化的”或“稳定转导的”或“稳定转染的”或“稳定电穿孔的”，指结合到其基因组中的具有所需外源DNA的部分细胞。根据使用的表达载体和转染技术，仅部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，编码可选择标记物(例如，针对抗生素的抗性)的基因通常与目的基因一起引入至宿主细胞中。优选的可选择标记物包括赋予药物抗性的那些，诸如G418、潮霉素和嘌呤霉素。编码可选择标记物的核酸可以在与表达可检测的翻译产物的同一载体上引入至宿主细胞，或可以在单独的载体上引入。使用引入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择鉴定(例如，已经结合了可选择标记物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。表面受体，指这样的分子，其存在于细胞表面上，与胞外环境相互作用和以最终调节特定启动子转录的方式胞内传送或转导关于该环境的信息，由此导致特定基因的转录。表面受体的实例是酪氨酸激酶受体、离子通道受体、细胞因子受体、趋化因子受体或G-蛋白偶联受体(GPCRs)、诸如化学引诱物肽受体、神经肽受体、光受体、神经递质受体、或多肽激素受体。G蛋白-偶联受体(GPCRs)，也称为七跨膜受体，7TM受体、七螺旋受体和G蛋白连接受体(GPLR)，是跨膜受体的大蛋白家族，其特征在于具有胞外N末端和胞质C末端的7个跨膜结构域。与GPCR结合的配体促进构象改变，从而导致小G-蛋白偶联，信号转导途径的开始，和最终导致细胞响应。结合和激活这些受体的配体包括光敏化合物、气味、信息素、激素和神经递质，且尺寸在由小分子到肽到大蛋白的范围内变化。G蛋白-偶联受体仅存在于高等真核细胞，包括酵母、植物，和尤其，动物中。G蛋白-偶联受体参与许多疾�。一故窃家话氲乃邢执揭┑陌斜辍PCR通过类似的分子机制起作用。由胞外刺激物活化GPCR引起受体构象改变，这导致GTP-结合蛋白(G蛋白)的中间偶联和活化。G蛋白在自然界中是异源三聚体，且由由不同基因编码的α、β和Y亚基组成。α亚基负责⑶P和GTP的结合。配体与GPCR的结合导致α亚基由⑶P-结合形式转变为GTP-结合形式并通过a-GTP与β Y 二聚体的解离引起异源三聚体的活化。a-GTP和β Y 二聚体均控制许多效应子的活性，所述效应子通过产生第二信使分子(例如，钙、cAMP等)将信号传送至细胞内部。存在至少17种Ga基因，且G蛋白可以分组为四个主要类型,称为Ga丨人、G a q/11、G a s和Ga 12/13(见例如Preininger AM 和 Hamm HE.Sc1.STKE 2004 年，re3 和 Cabrera-Vera TM 等.Endocr Rev.(内分泌学综述)2003年12月；24(6):765-81)。用于本文中时，GPCR包括与任意G a i/Q、G a q/11、G a s和G α 12/13偶联的受体。具有固有的酶促酪氨酸激酶活性(RTKs)的受体，是关于许多多肽生长因子，细胞因子和激素的高亲和性细胞表面受体。在人基因组中鉴定的90个独特酪氨酸激酶基因中，58个编码受体酪氨酸激酶蛋白。大多数RTKs是单一亚基受体，但是一些例如胰岛素受体以多聚体复合物的形式存在。各单体具有单一跨膜结构域、胞外N-末端区和胞内C-末端区。胞外N-末端区由非常大的蛋白结构域组成，所述蛋白结构域与胞外配体(例如，特定生长因子)结合。胞内C-末端区包含控制结构域和负责这些受体激酶活性的结构域，其特异性磷酸化酪氨酸氨基酸。嵌合受体，基于这样的人工受体，所述人工受体组合一个受体的部分与另一受体的部分，蛋白片段，标签及其任意组合，包括这两个完整结构域或其部分。通常，嵌合蛋白或"融合蛋白"是这样的多肽，所述多肽包含所需蛋白产物的至少一部分，所述蛋白产物与至少另一肽序列或另一多肽融合。ITAM携带受体:基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)是免疫系统的某些细胞表面蛋白的胞质尾区中的四个氨基酸的保守序列，所述四个氨基酸重复两次。所述基序包含与亮氨酸或异亮氨酸通过任意两个其他氨基酸分隔开的酪氨酸，指定特征为YxxL。这些特征中的两个典型地通过该分子尾区中的7-12个氨基酸分隔开(YxxLx(7_12)YxxL)。ITAM对于某些造血细胞如免疫细胞中的信号转导很重要。因此，它们存在于重要的细胞信号传导分子诸如T细胞受体复合物的⑶3和ζ -链、B细胞受体复合物的⑶79- α和-β链和某些Fe受体的尾区中。这些基序中的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后被磷酸化，并形成与参与由胞内存储释放钙的其他蛋白的相互作用的位点。可以开发某些嵌合受体，其包括一个受体的胞外配体结合结构域和ITAM携带受体的至少跨膜和胞内区。这样的嵌合受体在交联时，诱导由胞内存储释放钙。拮抗剂或受体抑制剂，指下调蛋白的至少一种生物活性的试剂。最广义使用的拮抗剂包括部分或完全阻断、抑制、或中和特定标签的生物学活性的任意分子。拮抗剂还可以是下调基因表达或减少表达蛋白存在量的化合物。它们可以竞争地、非竞争地、和/或变构地抑制蛋白的一种生物活性。激动剂或受体活化剂，指模拟、诱导或上调(例如加强或补充或提高)蛋白生物活性的试剂。激动剂可以是野生型蛋白或其具有该野生型蛋白的至少一种生物活性的衍生物。激动剂还可以是上调基因表达或增加蛋白的至少一种生物活性的化合物。激动剂还可以是增加多肽与另一分子，例如靶肽或靶核酸相互作用的化合物。胞外信号，包括通过与该信号直接或间接相互作用的细胞表面蛋白胞内转导的分子和环境变化。胞外信号或效应分子包括以某些方式特异性改变细胞表面蛋白活性的任意化合物或物质。所述信号的实例，但不仅限于，结合细胞表面和/或胞内受体和离子通道并调节所述受体和通道活性的分子诸如乙酰胆碱，生长因子和激素。该术语还包括调节细胞受体活性并由此影响胞内功能的尚未确定物质。所述胞外信号是潜在的药理学试剂，其可以用于通过调节特定细胞表面受体的活性来治疗具体疾病。孤独受体，是对未描述其特异性天然配体的受体的命名。信号转导，是化学信号由细胞环境通过细胞膜的过程，且可以通过数种机制中的一种或多种，诸如磷酸化、离子通道的活化、通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白中间产物的效应酶活化、磷酸肌醇形成、腺嘌呤环化酶的活化、和/或转录因子的直接活化(或抑制)等发生。载体或质粒载体或质粒:术语"载体"用于指载体核酸分子，向其中可以插入核酸序列，从而引入细胞，在所述细胞中复制。核酸序列可以是“外源性的”，这意味着它对于向其中引入载体的细胞是外来的且该序列与细胞中的序列同源但处于其中通常不存在该序列的宿主细胞核酸内的适当位置处。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YACs)。本领域技术人员良好具备通过标准重组技术构建载体的能力(见例如，Maniatis,等,Molecular Cloning, A LaboratoryManual (分子克�。笛槭植�)(Cold Spring Harbor (冷泉港)，1990)和 Ausubel,等，1994, Current ProtocolsIn Molecular Biology (当前分子生物学流程)(John Wiley&Sons, 1996), 二者均通过引用结合在本文中)。表达载体:术语"表达载体"指任何类型的遗传构建体，其包括编码能够被转录的RNA的核酸。在一些情形中，RNA分子然后翻译为蛋白、多肽或肽。在其他情形中，这些序列不翻译，例如，在生成反义分子或核酶中。表达载体可以包含多种“控制序列”，其指特定宿主细胞中的可操作连接的编码序列的转录和可能地，翻译所需的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可以包含起其他作用的核苷酸序列并记述如下。启动子:"启动子"是控制序列，即核酸序列的一个区域，在该区域处控制转录起始和速度。它可以包含遗传元件，调节蛋白和分子可以在所述遗传元件处结合，诸如RNA聚合酶和其他转录因子，从而起始特异性转录核酸序列。短语“可操作定位”、“可操作连接”、“受控于”和“受转录控制”意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能性位置和/或方向，从而控制该序列的转录起始和/或表达。启动子通常包括具有定位RNA合成起始位点作用的序列。其最著名的实例是TATA盒，但是在一些缺乏TATA盒的启动子，诸如，例如用于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和用于SV40晚期基因的启动子中，覆盖起始位点本身的离散元件有助于固定起始位置。另外的启动子元件控制转录起始的频率。典型地，这些位于起始位点上游30IlObp区内，尽管许多启动子已显示出也包含起始位点下游的功能性元件。为了使编码序列“受控于启动子”，人们定位了所选启动子“下游”(即3’)的转录阅读框的转录起始位点的5’末端。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码RNA的表达。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，因此当元件反转或相对于彼此运动时，启动子功能保持。在tk启动子中，在活性开始下降前，启动子元件之间的间隔可以增加至相隔50bp。根据启动子，似乎各元件可以合作地或独立地起激活转录的作用。启动子可以与或可以不与“增强子”联合使用，所述“增强子”指参与核酸序列转录活化的顺式作用调节序列。启动子可以与核酸分子天然相关联，同样可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列来获得。这样的启动子可以称为“内源性的”。类似地，增强子可以与核酸分子天然相关联，位于该序列的下游或上游。备选地，通过在重组或异源启动子控制下定位编码核酸区段可以获得某些优势，所述异源启动子指在其天然环境中通常不与核酸分子相关联的启动子。重组或异源启动子也指在其天然环境中通常不与核酸分子相关联的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子、由任何其他表达、或原核细胞或真核细胞分离的启动子或增强子、不“天然存在的”，即包含不同转录调节区的不同元件的启动子或增强子、和/或改变表达的突变体。启动子可以是异源或内源的。聚腺苷酸信号或终止信号:本发明的`载体或构建体通常包括至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包括参与特异性终止由RNA聚合酶引起的RNA转录的DNA序列。因此，在某些实施方案中，预期结束RNA转录物生成的终止信号。终止子可以是在体内对获得所需 目息水平所必需的。在真核细胞系统中，终止子区还可以包括允许新转录物位点特异性切割从而暴露聚腺苷酸化位点的特异性DNA序列。这向特化内源性聚合酶发出信号，使约200个腺苷残基(聚腺苷酸)一段序列添加至转录物的3’末端。使用该聚腺苷酸尾部修饰的RNA分子似乎更稳定并更有效地翻译。因此，在涉及真核细胞的其他实施方案中，优选地，终止子包括用于切割RNA的信号，且更优选地，终止子信号促进信息的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可以起提高信息水平和最小化由盒通读为其他序列的作用。信号肽或信号序列:信号肽是短(3-60个氨基酸长的)肽链，其指导蛋白的翻译后运输。信号肽也可以称为靶向信号、信号序列、转运肽或定位信号。信号肽的氨基酸序列指导蛋白(其在细胞溶胶中合成)达到某些细胞器诸如细胞核，线粒体基质，内质网，叶绿体，非原质体和过氧物酶体。一些信号肽在运输蛋白后，通过信号肽酶与蛋白切割开。酶原(zymogen)或酶原(proenzyme):酶原(zymogen)(或酶原(proenzyme))是无活性的酶前体。酶原需要生物化学变化(诸如暴露活性位点的水解反应，或改变构象以暴露活性位点)，以使其成为有活性的酶。所述生物活性变化通常发生在溶酶体中，其中前体酶的特定部分切割，从而使其活化。在活化时释放的氨基酸链被称为活化肽。
酶原性(zymogenicity):酶原性或酶原性指数(zymogenicity index)是针对任意给定底物，被处理的酶(例如通过蛋白酶)的活性与该酶原的活性的比率。它是如何有效限制酶原的测量值，其对应于酶原的无意义活性是一个很大的数字。例如，胱天蛋白酶-3具有酶原性指数约10.000而胱天蛋白酶-8具有100，胱天蛋白酶-9具有10且组织纤溶酶原激活物具有2-10(见例如Stennicke HR和Salvesen GS.Cell DeathandDifferentiation (死亡和分化)(1999) 6，1054-1059)。环状排列变换(circularly permuted)蛋白:如果蛋白的N和C末端已经例如通过分子生物学技术人工移动至蛋白结构的另一位置，则该蛋白已经被环状排列变换。如果蛋白序列由N末端向C末端阅读并由ABCDEFGH表示，则环状排列变换分子可以是Defghabc0因此，环状排列变换代表大分子异构化形式，其中正常末端共价连接并通过在别处破坏蛋白主链引入新末端。有效用于本发明方法的环状排列变换酶仅是这样的酶，其中环状排列变换形成具有高酶原性指数、缺乏酶活性的酶原(proenzyme)或酶原(zymogen),其可以通过蛋白酶切割转变为有活性的酶。肽标签:肽标签是可以用于当蛋白的特异性抗体不可用时与抗体一起检测蛋白或用于蛋白纯化的短肽。可以用于细胞表面检测和分离的已知肽标签实例是c-myc标签、HA标签和FLAG sup.TM标签。通常，存在特异性结合蛋白的任意肽标签可以用于表面检测和或分离，条件是这样的特异性结合蛋白直接或间接标记有荧光团或例如用于表面分离的珠。放大级联:偶联酶放大级联代表提高待定量初始信号量级的方法。这些级联基于多酶系统的固有乘法性质，即反应之一的产物必然是随后酶促反应的催化剂或辅因子。蛋白酶放大级联的最佳实例是血液凝固级联，其中第一蛋白酶激活酶原从而产生活性蛋白酶并且该第二蛋白酶也激活酶原从而产生第二活性蛋白酶，由此形成级联，其中初始信号放大多至1000倍。酶基础活性或酶原基础活性:酶原基础活性定义为在其中未添加酶原活化剂蛋白酶的确定培养基，例如细胞培养物上清或与无刺激条件下细胞培养相容的培养基中的酶活性与缺乏酶原的相同培养基中的酶活性的比。基础分泌:基础分泌指在缺乏细胞胞吐作用调节剂条件下由细胞分泌的蛋白相对量。在几乎全部分泌细胞类型中，可以检测基础分泌水平。不知道基础分泌是由存储在颗粒中的蛋白释放引起还是由与分泌颗粒分开分选的一部分新合成蛋白引起(见例如Burgoyne RD 和 Morgan A.PhysiolRev (生理学综述)(2003)83:581-632)。例如，在大鼠腮腺泡细胞中，一些分泌蛋白在其生物起源过程中与分泌颗粒分开分�。缘酱镆鸹∈头诺淖槌尚头置谛∨�(见例如，Arvan P和Castle D.Biochem J (生物化学杂志)(1998),332 =593-610)。腮腺泡细胞通过真组成型分泌释放一些淀粉酶，同时它们也将淀粉酶和其他分泌蛋白(诸如腮腺分泌蛋白，PSP)包装到常规分泌颗粒中，所述分泌颗粒响应胞吐作用调节剂进行胞吐。组成型或基础分泌相对胞吐作用受控现象之间关系的另一个实例通过哺乳动物上皮细胞证明(见 Burgoyne RD 和 Duncan JS.J Mamm Gland BiolNeoplasia (哺乳动物腺体生物学和瘤形成杂志)，(1998)3:275-286)。这些细胞主要通过明显的组成型途径分泌大量乳成分，包括乳蛋白、酪蛋白，但是大约1/3的合成酪蛋白保持在存储的胞内库中，并可以在完整细胞中响应Ca2+升高而释放。重组DNA (rDNA)分子，指通过使核酸序列，诸如基因与DNA分子序列操作性连接生成的DNA分子。因此，重组DNA分子是杂合DNA分子，其包括至少两个自然界中通常不共同存在的核苷酸序列。通常，引入至少包括自然界中通常不共同存在的启动子和多肽的DNA编码序列的重组DNA在引入至真核细胞中时被称为“异源的”。通过这样的异源或重组DNA产生的蛋白也称为“异源的”。在表达异源核酸序列的背景中，“宿主细胞”指能够复制载体和/或表达载体编码的异源基因的原核或真核细胞。当宿主细胞使用核酸分子“转染”或“转化”时，它们称为“改造”或“重组”细胞或宿主细胞，例如，已经向其中引入了外源核酸序列，诸如，例如，载体的细胞。因此，重组细胞可以与不包含重组引入的核酸的天然存在细胞相区分。宿主细胞的实例包括，但不仅限于，包含F或F sup./因子的大肠杆菌(E.coli)菌株(例如，DH5 a F或DH5 a F sup.')或缺乏F或F sup.'因子的大肠杆菌菌株(例如DH10B)。宿主如果容许复制载体或表达克隆到载体中的多肽，则被称为是相容的。引物，用于本文中时，指寡核苷酸，不管天然存在于纯化的限制酶切消化中的还是通过合成产生的，其能够在被置于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(即，在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶存在以及处于合适的温度和pH的条件下)时担当核酸合成起始点。PCR,指酶促扩增DNA区的聚合酶链反应方法。该指数扩增程序基于反复的变性循环、寡核苷酸引物退火和由DNA聚合剂诸如热稳定性DNA聚合酶(例如分别由水生栖热菌(Thermus aquaticus)或黄栖热菌(Thermus f Iavus)分离的 Taq 或 Tfl DNA 聚合酶)引起的引物延伸。多聚接头或多克隆位点(MCS)或多克�。负怂峁菇ㄌ迳系囊淮叵拗泼肝坏悖溆糜诤怂嵝蛄械牟迦牒�/或切除。限制性内切核酸酶或限制酶或内切核酸酶，指这样的酶(例如细菌的)，其各自在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA。实例包括，但不仅限于，Avail、BamHI, EcoRI,Hindlll、HincI1、Ncol、SmaI 和 Rsal。选择性生长培养基，指用于生长细胞的生长培养基，其已经增补了一种或多种选择性试剂例如，抗生素。可选择标记物或可选择标记序列或可选择标记基因，指这样的基因或其他DNA片段，其编码或提供赋予在在除此之外的其他情况下为有害环境中生长或存活能力的活性。例如，可选择标记物可以将针对抗生素或药物的抗性赋予其中表达该可选择标记物的细胞。复制源(Ori)也可以用作允许质粒载体繁殖的可选择标记物。可选择标记区，对于载体序列而言，指载体元件的一部分，其包含特定载体元件上存在的全部可选择标记序列。换言之，存在的可选择标记序列的末端定义可选择标记区。例如，如果特定载体元件仅具有一个可选择标记序列，则可选择标记区应该由可选择标记序列的起点和可选择标记序列终点来定义。如果特定载体元件具有，例如，2个可选择标记序列，则可选择标记区是第一个可选择标记序列的起点和第二个可选择标记序列的终点之间的核酸序列。克隆(To clone)或克隆(cloning),在关于插入序列和载体使用时,意指插入序列连接到能够在宿主中复制的载体中。术语“克隆(to clone)”，在关于插入序列、载体和宿主细胞使用时，通常指生成给定插入序列的拷贝。在这点上，为了克隆一段DNA(例如，插入序列)，人们应该将其插入至载体(例如，质粒)中，所述载体(例如，质粒)随后可以被置于宿主(通常细菌)中，由此质�：筒迦胛镉胨拗饕黄鸶粗�。各细菌在营养培养基上生长直至可见单菌落，挑取该菌落并使其在液体培养基中生长，并且将包含“克隆的"DNA的质粒由细菌中重新分离，这时将存在数百万DNA拷贝。术语“克隆”还可以指携带克隆的DNA的细菌，或克隆的DNA本身。转化或转染，用于本文中时，指外源DNA引入至细胞(例如原核或真核细胞)中。转化可以通过多种本领域已知的方式，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、聚凝胺-介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物射弹来实现。特别地，转染进入真核细胞可以是瞬时的，此时细胞培养基中不包括合适的抗生素用于选择携带稳定整合DNA进入染色体的细胞。用于稳定选择的质粒载体必须具有可选择标记物，所述可选择标记物表达到待使用抗生素选择的细胞中。尽管瞬时转染可以用于本发明的方法，但是优选的细胞是通过抗生素选择而变得稳定的那些。
图1.本发明一般概念图，其使用丝氨酸蛋白酶作为颗粒存储的报道分子，IgE受体作为调节颗粒胞吐作用的细胞表面受体和由分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子切割的基于FRET的底物进行检测。使用结合高亲和性受体结合的IgE的多聚体抗原(例如，变应原)处理细胞诱导颗粒存储的蛋白酶的释放，且该蛋白酶切割底物产生荧光终产物。利用分泌报道酶的这种特异性底物，可以确定配体-与-受体-相互作用。图2.本发明一般概念图，其使用丝氨酸蛋白酶作为颗粒存储的报道分子，GPCR作为调节颗粒胞吐作用的细胞表面受体和由分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子切割的基于FRET的底物进行检测。使用GPCR的激动剂处理细胞诱导颗粒存储的蛋白酶的释放，且该蛋白酶切割底物产生荧光终产物，且该蛋白酶切割酶原产生活性酶。利用分泌报道酶的这种特异性底物，可以确定配体-与-受体-相互作用。图3.本发明代表性质粒载体的一般结构。用于在嵌合hCMV-MoMLVS' -LTR强组成型启动子(A)或四环素诱导型启动子(B)控制下稳定表达粒酶B的具有潮霉素抗性的质粒载体图谱。用于表达功能性表面受体，诸如GPCR的具有新霉素抗性的质粒载体图谱，其使用小鼠免疫球蛋白K链的信号肽，用于通过抗-cmyc单克隆抗体表面检测的c-myc标签和用于在MoMLV5' LTR启动子控制下(C)或在四环素诱导型启动子控制下(D)过表达的病毒GPCR糖基化序列。图4.测定实例，其中RBL-2H3细胞系在MoMLV5 ' LTR启动子的控制下使用分泌颗粒中存储的人粒酶B和N-末端c-myc标记的人II型毒蕈碱性受体(CHRM2) 二者稳定转染，并包括信号肽和病毒糖基化序列，以用于有效的表面表达。(I)使用氨甲酰胆碱(CHRM2的激动剂)处理诱导胞内钙浓度增加(2)，其诱导分泌粒酶B的颗粒释放(3)，使用5' FAM-SGIEPDSGV-TAMRA,基于FRET的粒酶B底物(4)，利用485nm处的激发和535nm处的发射来检测。535nm处的荧光增加与释放的粒酶B量成比例。分泌报道分子可以直接检测，或通过酶原如人胱天蛋白酶原_3进行信号放大，以便甚至更灵敏地检测分泌的报道分子。图5.使用本发明中所述方法进行的双重测定图。两个不同的细胞系(A)和(B)在同一反应器中混合。细胞系A表达GPCRl (胞吐作用调节剂)-颗粒存储的蛋白酶报道分子I的组合。GPCRl具有配体I作为激动剂而蛋白酶报道分子I切割在波长I处读数的底物I (例如基于FRET的底物)。细胞系B表达GPCR2 (胞吐作用调节剂)-颗粒存储的蛋白酶报道分子2的组合。GPCR2具有配体2作为激动剂而蛋白酶报道分子2切割在波长2处读数的底物2 (例如基于FRET的底物)。使用GPCRl和GPCR2的配体I和配体2的混合物处理细胞A和B的混合物诱导颗粒存储的蛋白酶I和2的释放，并且可以确定波长I和2处的荧光增加。发明详述A.发明简述本发明涉及新的基于细胞的传感器，其有效用于药物发现，诊断和测定分析物，所述基于细胞的传感器包括具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的细胞系，所述细胞系用作为报道分子多肽的存储在具有专职受控胞吐作用的细胞系的受控分泌颗粒中的蛋白酶转染，并具有作为受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的内源或异源分子，所述颗粒存储的蛋白酶报道分子至少具有:针对颗粒内已经存在的条件诸如低PH和其他蛋白酶引起的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特异性切割序列；在无刺激或基础条件下非常低的分泌水平；和在与细胞培养物生存力和颗粒胞吐作用相容的培养基中高信号与背景活性t匕，以获得高通量的可靠且灵敏的检测。当基于细胞的传感器使用胞吐作用调节剂的特异性配体温育时，报道分子多肽由颗粒释放至胞外培养基中并且这些释放的报道分子多肽的酶活性使用特异性底物来检测。本发明还容许开发多重测定，其通过在同一反应器中混合至少两种细胞系(各细胞系具有不同的成对的胞吐作用调节剂-颗粒存储的蛋白酶报道分子)和使用各颗粒存储的蛋白酶报道分子的高特异性底物来检测胞吐作用来进行。本发明的基于细胞的传感器因此包括:具有专职受控胞吐作用的造血细胞系；转染至所述造血细胞系中的颗粒存储的蛋白酶报道分子且所述颗粒存储的报道分子受控于合适启动子；受控于合适启动子的胞吐作用调节剂例如表面受体如GPCR和用于检测分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的特定底物。这些灵敏的基于细胞的传感器有效用于测试至少两个分子之间的相互作用，一个分子担当胞吐作用调节剂且另一个担当胞吐作用调节剂的特异性配体。所述传感器的应用的实例是:为了测试药物发现中分子间相互作用，为了定量分子诸如蛋白，用于诊断和检测例如食品工业中、环境样板中和制药工业中数种样品中的药物或分子。本发明的传感器是灵敏的且由此使用比目前可用的传感器更低量的细胞，响应比基于诱导型启动子的传感器更快，不需要溶胞作用来释放报道分子，信号可以以终点模式或以动态模式测量，所有试剂可以混合然后读数，不需要洗涤或终止步骤由此增加通量，获得高信号背景比以用于可靠测定，和甚至，可能的信号放大步骤以用于甚至更灵敏检测。本发明的传感器还容许开发多重测定，其通过在同一反应器中混合至少两种细胞系(各自具有不同的成对的胞吐作用调节剂-颗粒存储的蛋白酶报道分子)和使用各颗粒存储的蛋白酶报道分子的高度特异性底物检测胞吐作用来实现。这样的多重测定减小每次测定的成本并提高信号质量，这是因为各测定具有作为内部对照的在同一孔中进行的另一个测定。B.发明详述本发明通过描述所述传感器的各元件，即具有专职受控胞吐作用的细胞，颗粒存储的蛋白酶报道分子、胞吐作用调节剂、用于表达颗粒存储的蛋白酶报道分子和胞吐作用调节剂二者的启动子和条件和检测系统的相关性质来最好地理解。B.1.有效用于本发明方法的细胞本发明涉及新的基于细胞的传感器，其有效用于药物发现，诊断和测定分析物，所述基于细胞的传感器包括具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的细胞系，所述细胞系用作为报道分子多肽的存储在具有专职受控胞吐作用的细胞系的受控分泌颗粒中的蛋白酶转染，并具有作为受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的内源或异源分子，所述颗粒存储的蛋白酶报道分子至少具有:针对颗粒内已经存在的条件诸如低PH和其他蛋白酶引起的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特异性切割序列；在无刺激或基础条件下非常低的分泌水平；和在与细胞培养物生存力和颗粒胞吐作用相容的培养基中高信号与背景活性t匕，以获得高通量的可靠且灵敏的检测。分泌颗粒及其受控胞吐作用是现有技术充分已知的，并已经在由于某些实验优势或由于其关键生理学或病理生理学目的被选作模型系统的一些细胞类型中进行了最广泛地研究(见例如，Burgoyne, RD 和 Morgan, A.Physiological Reviews (生理学综述),第 83卷，第2期，2003年4月，第581-632页)。可能地，大多数研究的细胞类型是肾上腺嗜铬细胞(及其肿瘤对应物PC12细胞系)，胰腺β -细胞和造血细胞如肥大细胞，血小板和嗜中性粒细胞，但是分泌颗粒胞吐作用也发生在用于分泌肽和其他激素的许多不同的神经内分泌和内分泌细胞类型中和在用于分泌消化酶的外分泌细胞中。而且，已经证明甚至在非专职分泌细胞系诸如成纤维细胞样(fibroblastoid)细胞系(CH0细胞)中，存在胞吐作用的Ca2+受控途径，且可能所有细胞类型具有受控胞吐途径，即常规溶酶体可以由Ca2+触发进行胞吐作用。但是分泌溶酶体是不同类型的受控分泌细胞器且该胞吐能力清楚地将它们与常规溶酶体区分开。尽管常规溶酶体也可以与质膜融合并在刺激后释放其可溶性内容物(1)，但是Ca2+_触发的由细胞诸如成纤维细胞和上皮细胞分泌溶酶体酶的程度仅趋于10-20%(2)。相对照地，至多80 %溶酶体标记物在生理学触发时，由具有分泌溶酶体的细胞，本文中称为具有专职受控胞吐作用的细胞释放。因此，用于本发明方法的优选细胞选自包括具有专职受控胞吐作用的细胞的组。具有专职受控胞吐作用的细胞最多样化的组之一是包括造血细胞如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞；T-细胞诸如细胞毒性T淋巴细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)的组。全部以上细胞的主要至正常功能是大量存储的成分如蛋白酶诸如粒酶、肥大细胞蛋白酶、组织蛋白酶和其他水解酶如糖苷酶的受控胞吐作用。因此，具有专职受控胞吐作用的造血细胞是用于本发明方法的高度相关细胞。在本发明的一个实施方案中，所述细胞选自具有专职受控胞吐作用的造血细胞系的组，所述具有专职受控胞吐作用的造血细胞系选自细胞诸如使用其分泌溶酶体存储特化成分诸如丝氨酸蛋白酶如粒酶、组织蛋白酶、肥大细胞蛋白酶、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3以及其通常的溶酶体成分(包括数种水解酶如糖苷酶和黑色素、组胺和5-羟色胺)的细胞毒性T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。在本发明的另一个实施方案中，优选的细胞选自RBL-2H3、大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞系、小鼠32D细胞系、小鼠骨髓造血细胞、人ΝΚ92细胞系、天然杀伤细胞系和人YT细胞系、天然杀伤细胞系和小鼠MC/9细胞系、小鼠肥大细胞。用于本发明方法的特别优选细胞系是RBL-2H3，因为该细胞系具有非常低的组成型分泌水平和本发明优选报道分子如粒酶的高度诱导分泌，所述粒酶赋予传感器高信号背景比率。
B.2.胞吐作用调节剂本发明还包括胞吐作用调节剂。在本发明的一个实施方案中，胞吐作用调节剂选自诱导胞内钙水平变化的化合物或多肽。在本发明的另一个实施方案中，胞吐作用调节剂选自诱导cAMP、二酰甘油DAG)、磷脂或ATP水平变化的化合物或多肽，其转而控制或调节钙触发的胞吐作用。—个重要的胞吐作用调节剂类型是表面受体，其包括G-蛋白偶联受体(GPCR)、具有固有酪氨酸激酶活性的受体，具有相关酪氨酸激酶活性的受体和携带ITAM基序的受体如内源或异源Fcy和ε受体或携带正常参与许多造血细胞受体中的抗原识别和呈递的ITIM基序的受体。因此，在本发明的一个实施方案中，胞吐作用调节剂可以是表面受体，所述表面受体在配体结合时激起存储在具有受控胞吐作用的细胞颗粒内的报道分子的胞吐作用。这样的胞吐作用调节剂可以是内源胞吐作用调节剂如高度亲和性IgE受体，也称为Fe受体ε I或转染的同源或异源胞吐作用调节剂如GPCRs或Fe Y受体或Fce I受体。在本发明的另一个实施方案中，胞吐作用调节剂可以是表面受体，所述表面受体在配体结合时抑制由与另一受体结合的配体诱导的报道分子胞吐作用。在再一个实施方案中，胞吐作用调节剂可以包括具有用于配体结合的胞外区和用于信号转导的跨膜和胞内区的嵌合受体，例如，包括IL-2结合区的白介素_2受体胞外区和包括ITAM序列和信号转导所需的其他序列的至少大鼠Fce受体I跨膜和胞内区的嵌合受体。在一个实施方案中，细胞表面受体选自G-蛋白偶联受体(GPCRs)、具有固有或相关酪氨酸激酶活性的受体和包含在特异性配体结合时激起颗粒存储的报道分子胞吐作用的受体的I ΤΑΜ。GPCR根据它们转导的信号分成四个主要类型:G a -1/Q、G a -q/n、G α -s和G α -12/13偶联受体。a-S偶联GPCR增加细胞内部的环-AMP而α-1/o偶联GPCR阻断细胞内部的环-AMP的增加。a -q偶联GPCR增加胞内钙且α -12/13产生细胞溶胶小GTP酶Rho的活化。但是本领域中公知地是，造血细胞具有混杂的α-15/16链，所述链与a-s、a-12/13和a-1/o偶联GPCR偶联从而增加胞内钙，且本发明受益于此。在本发明的一个实施方案中，可以用于使报道分子由颗粒胞吐的GPCR可以选自α-q/ll、或a-12/13或a-1/o或a -s偶联的GPCR。选作本发明方法中的胞吐作用调节剂的GPCR可以是全长受体或其中已经部分或完全缺失C-末端尾部的受体。已知在配体结合时，一些GPCR诱导β -氨基己糖苷酶释放，但是根据技术发展水平，这似乎仅是某些GPCR的性质。例如，腺苷3受体已经被报道自身不诱导脱粒，但是加强由未达最佳标准剂量的IgE和抗原诱导的脱粒。脱粒已经主要在趋化因子受体和内源性表达在肥大细胞和嗜碱性粒细胞诸如RBL-2H3细胞中的某些a -1偶联GPCR中证明。而且，颗粒胞吐作用已经在I型和III型毒蕈碱性乙酰胆碱受体中证明，其二者均是a_q偶联GPCR，在RBL-2H3细胞中过表达。但是关于导致脱粒的途径存在争议。例如，Barlic等报告缺乏C-末端的IL8RA(CXClR) a -1偶联GPCR不能在RBL-2H3中脱粒且甚至将这种脱粒的失去归因于丝氨酸残基，所述丝氨酸残基在白介素_8相互作用时磷酸化并结合抑制蛋白。其他研究者质疑该结果，他们提供这样的证据:C-末端截断的IL8RA(CXClR)比天然受体甚至更有效地脱粒，这可能是因为配体结合后更低的内在化速度。全部以上结果使用作为报道分子的β -氨基己糖苷酶和CMV启动子，即用于细胞如RBL-2H3中对大多数GPCR极弱并在造血细胞如RBL-2H3中部分沉默的启动子。在实验过程中，我们已经发现人腺苷3受体(AD0RA3)在克隆到合适载体诸如本发明达到中描述那些载体中时，是非常有效的胞吐作用调节剂。质疑以前的技术发展水平主要基于在hCMV启动子控制下表达的GPCR，所述hCMV启动子关于大多数GPCR在细胞如RBL2H3中非常低且关于在hCMV启动子控制下表达的某些GPCR在那些细胞中随时间而沉默。而且，以前的载体不使用任何序列来帮助GPCR表面表达。所有以上区别使我们的传感器高度灵敏并因此有效用于药物发现。关于有效的基于细胞的传感器的另一个重要考虑是受配体调节的靶标的表达水平。靶标如表面受体，例如，以小于1000分子/细胞至大于500.000分子/细胞的量表达在细胞表面上，并因此存在多至1000倍的靶分子表达水平变化。GPCR，即主要表面受体类型，通常以低水平表达且仅约10% GPCR在N末端具有信号肽，而大部分使用第一跨膜结构域作为信号来易位至膜，这可能受到某些用于表面表达的分子伴侣的帮助。通常，靶标的较高表达水平将导致传感器的较高灵敏度并因此，需要研究过表达蛋白靶标，特别是表面受体的条件。本发明还包括有效用于对本发明方法有效的细胞表面上的G-蛋白偶联受体表达的启动子和序列。在一个实施方案中，关于组成型GPCR表达的合适启动子可以选自包括人或小鼠延伸因子l-α启动子(SEQ ID NO:1)，人磷酸甘油酸激酶(SEQ ID Ν0:6)，劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子(SEQID NO:2)和来自莫洛尼鼠白血病病毒启动子的5' LTR即MoMLV-5/ LTR(SEQ ID NO:3)的组。这样的启动子在用于本发明方法的造血细胞中不随时间沉默。在本发明的一个实施方案中，关于GPCR表面表达的合适启动子是诱导型启动子。在另一个实施方案中，用于细胞表面GPCR表达的诱导型启动子可以选自包括四环素诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子的组。在另一个实施方案中，GPCR可以包括用于表面过表达的信号肽和用于例如通过流式细胞计数或通过磁珠的阳性细胞表面检测和/或分离的标签。例如，Andersson, H等(见 Andersson 等 Mol Pharmacol (分子药理学)(2003) 64:570_577)已经证明了在 CBl 的N末端添加信号肽或缩短长N-尾部在不影响与大麻素配体的受体结合的条件下，很大地提高受体的稳定性和细胞表面表达。在另一个实施方案中，有效用于GPCR表达的载体可以包括用于表面过表达的糖基化序列。这样的糖基化序列应该插入标签和天然GPCR序列的第一个氨基酸之间。在进一步优选的实施方案中，糖基化序列是选自包含序列SEQ ID NO:4的病毒GPCR的天然糖基化序列。关于组成型GPCR表达的有效载体的一个实例是P-MoMLV-5' LTR-SP-cmyc-标签-VGS-MCS-聚腺苷酸(SEQ ID NO:5)，其包含在造血细胞中不沉默的启动子、用于帮助跨膜易位的信号肽、用于使用表面上的GPCR选择细胞的标签、用于提高膜表达的糖基化信号和用于稳定信使RNA的聚腺苷酸序列。如果序列SEQ ID NO:5的载体中的P_MoMLV5' LTR启动子序列被四环素诱导型启动子替换，则获得适合于诱导型GPCR表达的载体。本发明首次证明了在GPCR的N末端添加糖基化信号，特别是源自病毒GPCR的糖基化信号提高细胞表面受体表达。B.3.颗粒存储的报道分子
关于颗粒分泌最广泛使用的报道分子是内源性β_氨基己糖苷酶，但是该蛋白传统上已经被认为是具有低信号背景比的低灵敏度报道分子。另外，该糖苷酶不能如例如蛋白酶一样与信号放大级联偶联，蛋白酶可以偶联到用于初始信号放大的蛋白水解级联中，类似于导致血液凝固的血液凝固级联，其中信号由使用酶原作为底物的酶级联放大数倍。而且，由于β_氨基己糖苷酶正常存在于大多数具有专职受控胞吐作用的造血细胞的颗粒，该蛋白不容许开发多重测定。因此需要用于开发脱粒的灵敏测量法的其他颗粒存储的报道分子的探索。在组成型和受控途径之间分选可溶性蛋白明显很复杂，且存在关于可溶性蛋白到达存储颗粒与表达水平无关途径中的细胞类型特异性的重要证据。例如，淀粉酶是外分泌胰腺细胞中的正�？帕３煞郑以谧局镣夥置谝认傧赴抵惺北辉耸涞娇帕＃谧镜哪诜置谙赴抵凶槌尚头置�(见例如，EI Meskini, R等.Endocrinology (内分泌学)(2001)第142卷，第2期864-873)。细胞类型特异性可以解释使用POMC分子的氨基端蛋白研究不同内分泌和神经细胞系途径的一些矛盾结果(见例如，TarnffffH等.Eur J CellBiol (欧洲细胞生物学杂志)(1993)，62:294-306 ;RoyP 等.Mol Cell Endocrinol (分子细胞内分泌学)(1991)，82:237-250 和 CoolDR 等.J Biol Chem(生物化学杂志)(1995)270:8723-8729)。蛋白分选的细胞特异性超越细胞系扩展到原始培养物，因为相同的构建体在原代内分泌和神经细胞中可以以非常不同方式处理。因此，对于本领域中技术人员而言，不同于具有受控胞吐作用的造血细胞的其他细胞可以用于本发明的方法中，但是其他细胞类型的选择需要与以高浓度存储在所选细胞系的分泌颗粒中的特定报道分子以及与低水平基础分泌平行进行。有效用于本发明方法的、存储在分泌颗粒，尤其在造血源细胞分泌颗粒中的报道分子的一个重要性质是针对该报道分子在颗粒内部主要抵抗的严苛环境的抗性。造血细胞的分泌颗粒与溶酶体，即内部在极酸pH条件下存储水解酶诸如组织蛋白酶、类胰蛋白酶和胃促胰酶的大型库的细胞器相关，且该环境对于天然不存储在该细胞器中的蛋白不理想，因此蛋白酶或PH不稳定性报道分子将可能在分泌颗粒内部降解，由此降低该不稳定性报道分子蛋白的灵敏度。例如，蛋白酶是由活化肥大细胞胞吐的主要蛋白成分(见例如Huang等，J Clin Immunol.(临床免疫学杂志)18:169_183，1998)。类胰蛋白酶、胃促胰酶和羧肽酶是存储在肥大细胞的分泌颗粒中的蛋白酶的三个主要家族。因此，本发明的优选报道分子是针对本发明造血细胞的颗粒内部的蛋白水解和低PH具有高度抗性的多肽。尽管分泌溶酶体内溶酶体酶和造血丝氨酸蛋白酶与数种抗生素蛋白的共存显示在不降解条件下的共存储是可能的，但是并非人工引导至分泌颗粒的每一个多肽都将抵抗该严苛环境。例如，Kaur J 和 Cutler DF (见 Kaur, J 和 Cutler DF.J.Biol.Chem.(生物化学杂志)，(2002)第277卷，第12刊，10498-10505)发现了嵌合HRP-Pselectin可以靶向分泌和常规溶酶体，但是多至70%的靶向蛋白通过蛋白水解降解。用于本发明方法的造血细胞的分泌颗粒与溶酶体共享性质，所述溶酶体是内部在极酸PH环境下存储水解酶诸如组织蛋白酶、类胰蛋白酶和胃促胰酶的大型库的细胞器，并且对于本发明方法的有效报道分子必须是针对合适造血细胞的颗粒内部环境具有抗性的多肽。在本发明的一个实施方案中，有效报道分子选自针对造血细胞的颗粒内部环境，诸如蛋白水解和低pH具有抗性的多肽。在本发明的另一个实施方案中，颗粒存储的蛋白酶报道分子选自天然存储在造血细胞的颗粒中的一组丝氨酸蛋白酶，其包括具有天冬裂酶样活性的酶(在天冬氨酸后切割)，具有胃促胰酶-样活性的酶(在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸后切割)，具有类胰蛋白酶-样活性的酶(在赖氨酸或精氨酸后切割)和具有弹性蛋白酶-样活性的酶(在缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸或半胱氨酸后切割)。在又一个实施方案中，优选的丝氨酸蛋白酶具有内肽酶活性的酶，其选自包括粒酶、组织蛋白酶G、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3和肥大细胞蛋白酶如胃促胰酶的组。造血细胞的颗粒还存储属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶家族的组织蛋白酶。组织蛋白酶是一类球状蛋白酶，最初描述为胞内肽水解酶，尽管一些组织蛋白酶也具有胞外功能。组织蛋白酶B，C，F，H，L，K，O, S，V，W，和X是木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸蛋白酶，且代表最大且最著名的组织蛋白酶类型。它们主要起胞内蛋白酶的作用，在溶酶体的酸性环境中介导末端非特异性大规模蛋白质水解(见例如Turk V7Turk B和Turk D.EMBO J(EMB0杂志)2001 ；20:4629-33)。组织蛋白酶A和G均是丝氨酸蛋白酶，但是组织蛋白酶G是内肽酶而组织蛋白酶A是羧肽酶。组织蛋白酶D和E是天冬氨酸蛋白酶。组织蛋白酶作为无活性酶原来合成并加工成为成熟的活性酶。由于在溶酶体的酸性环境中半胱氨酸组织蛋白酶作为胞内蛋白酶的功能，它们的最优PH是约5-5，5且在本发明方法中细胞培养存活性和胞吐作用所需的生理PH下，它们的催化效率不是最优的。由于该原因，丝氨酸蛋白酶在与半胱氨酸组织蛋白酶比较时，通常是对于本发明方法中的颗粒存储优选的报道分子。现有技术发展水平中还已知其他降解蛋白酶包括金属蛋白酶存储在颗粒中，并由造血细胞诸如嗜中性粒细胞，例如MMP-8 (嗜中性粒细胞胶原酶)和MMP-9 (92kDa明胶酶)释放(见例如，Owen CA 和 Campbell EJ.J.Leukoc.Biol.(白细胞学生物学杂志)(1999)65，137-150)，但是造血细胞的丝氨酸蛋白酶对由本发明方法的优选细胞释放的蛋白水解活性具有最大贡献，且因此丝氨酸蛋白酶比金属蛋白酶和半胱氨酸组织蛋白酶更优选。这种对于蛋白水解活性的较大贡献是与也存储在颗粒中的其他蛋白酶相比丝氨酸蛋白酶的更大颗粒浓度和丝氨酸蛋白酶在中性PH的更大催化活性的结果。在本发明的一个实施方案中，编码报道分子的DNA可以被转染以生成酶原蛋白或或生成活性酶。作为酶原合成的颗粒报道分子靶向分泌颗粒，在那里它们被活化，而活性酶靶向分泌颗粒且它们不需要活化。例如，粒酶是通过颗粒内部组织蛋白酶C，通过在N-末端活化二肽处切割生成活性酶而变为具有活性的酶原。即使组成型活性粒酶B被正确靶向并存储在颗粒内部且因此有效用于本发明的方法，这样的组成型活性粒酶B具有比作为酶原合成的粒酶B更高的基础活性，由此降低传感器的信号背景比。其他研究者证明了(见Isaaz等.Eur J Immunol (欧洲免疫学杂志)1995 ；25(4): 1071-9)在活性合成过程中的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆中，大量粒酶是组成型分泌的且多至1/3的粒酶A和B可以通过组成型分泌途径由CTL直接分泌，其如通过粒酶A酶活性和分泌的粒酶B的免疫印迹所示，其中1/3的蛋白未能获得颗粒靶向信号。切割蛋白的组成型分泌可以被CHX和布雷菲德菌素A(BFA) 二者阻断。虽然BFA不影响被识别的靶标的定向杀伤，它消除旁观者杀伤，这说明旁观者杀伤由通过非颗粒途径递送的新合成切割蛋白引起。因此，使用需要在颗粒内部活化的酶原代替组成型活性报道分子减小基础活性，并且产生具有较高信号背景比的细胞系，以用于有效用于本发明方法的更可靠传感器。
在本发明的另一个实施方案中，对于本发明方法的有效报道分子可以是天然存在的序列或密码子优化报道分子以便在有效细胞系中高度表达。例如马粒酶B的密码子优化序列如SEQ ID NO:9所示。B.4.用于报道分子表达的启动子本发明还包括对于表达报道分子的合适启动子。关于表达本发明的颗粒存储的报道分子的有效启动子是适合于造血细胞中蛋白表达的启动子，特别是适合于中度至高度蛋白表达的启动子。当通过特异性ELISA(酶联免疫吸附测定)定量时，具有中度蛋白表达的启动子生成大于IOng颗粒存储的粒酶B/百万RBL-2H3细胞，而强启动子生成大于IOOng颗粒存储的粒酶B/百万RBL-2H3细胞。合适启动子的另一相关特性是蛋白表达在培养过程中必须是稳定的。某些异源启动子在培养过程中，特别是在造血细胞中被下调，且该过程称为“启动子沉默”。对于本发明方法的优选启动子因此是不可沉默启动子。在本发明的一个实施方案中，用于报道分子表达的启动子选自包括以下各项的组:hCMV和MoMLV-5^ -LTR启动子的嵌合启动子(SEQ ID NO:10) ;MoMLV-5, LTR启动子(SEQ ID NO:3);延伸因子 l-α 启动子(SEQ IDNO:1) ;RSV 启动子(SEQ ID NO:2)和胸苷激酶启动子(SEQ ID N0:7)。其他启动子诸如人巨细胞病毒启动子，即一种广泛用于真核细胞转染的最强启动子，也是合适的，但是在本发明的造血细胞中，它与具有在MoMLV的嵌合hCMV-5^ LTR的控制下的粒酶B的载体相比产生至少125倍更少的粒酶B，由此降低传感器灵敏度。因此，使用粒酶B作为报道分子的载体有效用于启动子评估，从而选择对本发明方法的报道分子表达合适的启动子。通常，对本发明方法中报道分子表达的优选启动子是这样的启动子，即由其生成更多的报道分子，较强的启动子比较弱的启动子更优选。在本发明的另一个实施方案中，优选的启动子是在传代培养过程中不被细胞沉默的那些。启动子沉默限制启动子的有效性，且我们发现了人CMV(hCMV)启动子在本发明的至少一个优选细胞系中，即在RBL-2H3中部分沉默。但是也由hCMV与MoMLV的5' -LTR融合组成的嵌合启动子在超过6个月的连续培养中不沉默。启动子沉默必须通过实验确定，且对于本领域技术人 员而言，其中例如人粒酶B在待测启动子控制下表达并具有抗生素抗性以便用于哺乳动物细胞系中的稳定选择的载体有效用于克隆新型启动子并用于选择可以被培养数月的稳定细胞系，从而选择不沉默的强启动子，并由此有效用于本发明的方法。在本发明的一个实施方案中，用于表达颗粒存储的蛋白酶报道分子的启动子是诱导型启动子。在另一个实施方案中，用于表达颗粒存储的蛋白酶报道分子的诱导型启动子可以选自包括四环素诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子的组。B.5.检测技术和底物除有效用于本发明方法的报道分子的针对分泌颗粒内部环境的抗性外、高水平表达、低基础分泌和高诱导分泌以外，用于本发明灵敏检测方法的受控胞吐作用的报道分子的其他重要性质是用于测量分泌的报道分子的检测技术类型和该报道分子对用于检测的特定底物的催化效率。高灵敏度检测技术和对特定底物具有高催化效率的报道分子有益于本发明的方法。关于本发明方法的有效报道分子是具有蛋白水解活性的酶并且因此，蛋白水解活性检测技术对于本发明特别重要。在本发明的一个实施方案中，用于测量分泌颗粒存储的报道分子的酶活性的方法选自比色法、荧光法、FRET法、时间分辨-FRET法或发光法。这些方法是现有技术水平中公知的。例如，人粒酶B活性可以通过使用C-末端与P-硝基苯胺(pNA)偶联的肽IEPD，通过比色法检测，在405nm处检测，C-末端与7-氨基-4-甲基香豆素偶联的相同肽可以通过具有380nm处的激发和460nm的发射波长的荧光来检测，且C-末端与7-氨基-三氟甲基香豆素偶联的相同肽可以通过具有400nm处的激发和505nm处的发射的荧光来检测。与本发明方法特别相关的是高度灵敏的荧光或发光蛋白酶底物，例如，基于FRET的蛋白酶底物、基于发光的蛋白酶底物和基于罗丹明-110的荧光底物。在本发明的另一个实施方案中，用于测量有效报道分子如粒酶A，B,胃促胰酶，蛋白酶3或嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的酶活性的方法选自Forste「共振能量转移(fret)或时间分辨-FRET法。Ffirster共振能量转移或fret是检测能够作为成对的fret两个荧光团之间接近度的技术。例如，如果一个称为“供体”的荧光团的荧光发射谱与另一个称为“接受体”的荧光团重叠，则这两个分子可以起FRET对作用。当彼此接近时，典型地在100埃以下范围内时，供体荧光团的激发导致非辐射的能量转移至接受体荧光团，由此导致来自接受体的荧光发射增加和来自供体的荧光发射减少。当分离FRET配偶体时，除去FRET。EDANS/DABCYL荧光团-猝灭剂对是最常用于FRET应用的一种，这归因于EDANS的发射谱(激发波长341nm，发射波长471nm)和DABCYL的吸收谱(最大吸收波长453nm)之间良好的谱重叠。由DABCYL引起的EDANS荧光的猝灭因此很高效，在DABCYL/EDANS标记肽蛋白水解时观察到多至40-倍的荧光增强。例如，具有序列SGIETOSGV的肽可以在N-末端使用EDANS作为"供体"荧光团和C-末端使用DABCYL作为"接受体"或猝灭剂来标记。当该完整的肽底物用于测量酶活性时，EDANS的荧光被DABCYL猝灭。当FRET肽被例如人粒酶B切割时，EDANS的荧光重新获得，并可以在激发/发射=340nm/470nm处连续监测。EDANS荧光的增加与粒酶B活性相关联。5'-FAM/TAMRA FRET对也广泛用于标记蛋白酶底物，比基于DABCYL/EDANS的肽更灵敏，且基于5-FAM/TAMRA的FRET底物更少地受测试化合物的自发荧光干扰，这归因于其较长的发射波长。还存在许多可以有效用于本发明方法的FRET对。例如，Biosearch Technologies (生物探索技术)已经开发了高效粹灭剂，以商标BHQsup.TM或Blackhole粹灭剂销售，而Anaspec已经开发了 QXLsup.TM粹灭剂和Perkin ElmerQSYsup.⑧猝灭剂。为了使猝灭剂-荧光团对有效，荧光团的发射荧光谱必须与猝灭剂的吸收谱重叠。有效用于本发明方法的FRET对的另一相关特性是用于检测的激发和发射波长。具有长的激发和发射波长的FRET对较少地倾向于来自细胞成分和来自用于药物发现的化合物的干扰，并因此优选用于本发明的方法。有效用于基于FRET的蛋白酶测定的所谓的NIR染料是本领域技术中公知的(见例如，Pham W等.Bioconj.Chem.(生物缀合化学)
(2004);151403-1407)，且本发明受益于为了灵敏且特异性检测蛋白酶活性所开发的新技术，包括新型 NIR 染料(见例如 Peng X等.A nonf luorescent, broad-range quencher dyefor Forsterresonance energy transfer assays(用于共振能量转移测定的非突光广谱粹灭剂).Analytical Biochemistry (分析生物化学)电子公开于2月25日，(2009)),所述新型NIR染料在被特定蛋白酶切割时具有更好的信号与背景荧光比。例如，对于使用FRET的粒酶 B 检测合适的底物是 5' -FAM-Ser-1le-Glu-Pro-Asp-Ser-Gly-Ser-TAMRA。时间分辨FRET或TR-FRET是FRET的变体，其中镧系螯合物诸如铽螯合物用作供体物种。因为铽螯合物具有比标准有机荧光团长许多数量级的荧光寿命，所以TR-FRET可以在该干扰完全衰减后测量。这一点再加上接受体强度与供体强度的比值读数(ratiometric readout),为HTS测定提供有效的读数。在本发明的一个实施方案中，由颗粒分泌的蛋白酶引起的肽切割使用时间分辨荧光计来检测。例如，肽可以在一末端与荧光镧系螯合物且在另一末端与镧系螯合物的猝灭剂偶联。在由蛋白酶引起切割时，镧系螯合物和猝灭剂将随底物切割而被分离。用于本发明方法的时间分辨FRET技术的一个相关特性是荧光发射可以由激发延迟并且因此避免用于药物发现过程的化合物自发荧光。例如，对于检测分泌的粒酶B的有效底物是Lanthan-1EPDSG-Quench,其中Lanthan是镧系螯合物,例如铕螯合物且Quench是镧系突光的合适猝灭剂，例如QSYsup. 7。在一个优选实施方案中，用于灵敏检测分泌的蛋白酶的方法选自具有来自用于药物发现的细胞和化合物二者的最小干扰的高效FRET对，诸如例如，5' -FAM和TAMRA FRET对，近红外FRET对和基于镧系螯合物的时间分辨FRET法。在本发明的再一个实施方案中，颗粒分泌的蛋白酶使用肽-修饰的荧光素底物(见例如，Geiger R和Miska WjUSPTO 5035999)，在包含ATP和荧光素酶二者的合适缓冲液中测量。例如，对于确定泌的粒酶B的合适肽是Ile-Glu-Pro-Asp-氨基荧光素(IEPD-氨基荧光素)，其中天冬氨酸的羧酸与6-氨基荧光素缀合生成不被荧光素酶切割的酰胺荧光素，除非IEPD-氨基荧光素先被分泌的人粒酶B切割。利用该粒酶B底物，颗粒存储的胞吐作用与发光偶联并且因此用于药物发现的细胞和化合物二者的自发荧光不产生与测定读数的干扰。基于罗丹明110的蛋白酶底物是荧光团的双酰胺衍生物，是与罗丹明IlO(RllO)各氨基基团共价连接的肽(见例如，Mangel W等USPT04557862)，由此抑制染料的可视吸收和荧光二者。当酶切割时，非荧光双酰胺底物以两步骤过程转变，首先转变为荧光单酰胺并然后转变为甚至更多荧光R110。RllO切割产物具有与荧光素类似的光谱特性和大消光系数，由此提供在标准荧光素滤器设置下的使用容易度和良好信号背景比。在本发明的一个实施方案中，用于蛋白水解检测的蛋白酶底物是罗丹明110修饰的肽。在另一个实施方案中，用于报道分子检测有效优选底物是处于包含细胞的混合物中的适合用于报道分子检测的细胞不能透过的底物。在本发明的另一个实施方案中，分泌的蛋白酶的优选检测包括用于信号放大的酶促级联。容许信号放大的蛋白酶级联是本领域技术中公知的(见例如，Harris, C.USPTO4，463，090)。蛋白酶放大级联的最佳实例是血液凝固级联，其中第一蛋白酶激活酶原产生活性蛋白酶且该第二蛋白酶还激活酶原产生第二活性蛋白酶，由此形成级联，其中初始信号放大多至1000倍。具有非常低基础活性的酶原需要使用高信号背景比进行信号放大。例如，天然胱天蛋白酶8酶原具有完全加工的酶的1%活性，其是与大多数蛋白酶原相比非常大的活性(见Muzio M.等J.Biol.Chem.(生物化学杂志)(1998) 273 =2926-2930)，并且因此天然胱天蛋白酶-8对于灵敏检测分泌的报道分子如粒酶B具有高背景。相反，人胱天蛋白酶原-3可以被人、大鼠、马或黑猩猩粒酶B高效切割并活化，从而生成成熟胱天蛋白酶_3，其具有比未切割酶原约10.000倍更高的活性并因此高度有效用于颗粒分泌的蛋白酶的检测。高酶原性指数是对本发明方法中有效用于检测分泌的报道分子的蛋白酶特别优选的性质。除高酶原性指数外，对于本发明方法的优选酶原选自在活化后具有高催化效率和具有低的酶基础活性的酶。需要选择具有这些性质的酶原用于本发明中颗粒胞吐作用的灵敏检测。酶原的基础活性与酶原性指数有关，但在此是与本发明方法相关的区别。第一，具有相同酶原性指数的两种酶可以具有不同的基础活性，但是具有较高基础活性的酶也是具有较高催化效率的酶。优选用于本发明方法的是具有最高可能的酶原性指数和最低可能的基础酶活性的酶。第二，基础活性不仅与酶原性有关，因为某些酶如胱天蛋白酶原_3在以高浓度存在时，可以容易地自体活化。例如，胱天蛋白酶原_3的酶原性指数是约10.000且因此非常高，但是如果该酶以高浓度存储，则该酶自体活化并且基础活性可以非常高。第三，与本发明方法有关的基础活性是在缺乏受控胞吐作用调节剂条件下细胞的细胞培养物上清中存在的基础活性，而不仅仅是由转染的颗粒存储的报道分子产生的基础活性。例如，粒酶A是属于蛋白酶的类胰蛋白酶-家族的丝氨酸蛋白酶。该类胰蛋白酶家族的特征在于精氨酸或赖氨酸氨基酸后的切割序列。尽管人粒酶A在P4-P3-P2-P1具有包括IGDR或VANR的最佳切割序列(见例如,Mahrus S和Craik CS.Chemistry&Biology (化学与生物)
(2005)，12,567-577)并由此潜在地有效用于本发明的方法，但是在非转染RBL-2H3细胞的未刺激细胞培养物上清中已经出现的类胰蛋白酶的活性如此高以致于在使用人粒酶A稳定转染、使用分泌调节剂如离子霉素刺激的RBL-2H3细胞和使用或不使用离子霉素刺激的未转染细胞之间不存在差异。但是如果除去细胞培养物上清并使用无血清缓冲液，例如改性的HBSS清洗细胞，则基础类胰蛋白酶活性降低至这样的水平，其中人粒酶A成为对本发明方法有效的报道分子。Verheiien等已经开发了有效用于蛋白酶定量的人工放大级联(见Verheiien JH等.Biochem.J.(生物化学杂志)(1997) 323，603-609 和 Verheiien JH,USPT0,8, 115,252)，其中尿激酶原被修饰为包含可由待定量蛋白酶切割的识别位点。其他人已经使用在不同切割位点修饰的不同蛋白酶如胱天蛋白酶原-3作为蛋白酶活性的测量。例如，Li Y等(见LiY.等 Molecular Biotechnology (分子生物技术)，(2001)第 18 卷,第 I 期，1-10)已经开发了包含β -分泌酶切割位点的修饰的胱天蛋白酶原_3，其诱导293Τ细胞中的凋亡，即活性胱天蛋白酶-3的公知作用，且他们证明了修饰的胱天蛋白酶_3诱导的凋亡与β-分泌酶识别序列对β -分泌酶的易感性相关，并且甚至证明了蛋白酶竞争剂防止修饰的胱天蛋白酶-3诱导的细胞死亡。在另一个实例中，Vocero-Akbani AM等(见Vocero-Akbani AM等Nat Med.(自然医学)(1999)，第5卷，第I期:29_33)改造了胱天蛋白酶原_3，其用人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白水解切割位点替代内源性蛋白水解切割位点。一旦在细胞内部，这种改造的胱天蛋白酶原_3在未感染细胞中保持无活性，但是在HIV-感染的细胞中，该胱天蛋白酶原_3由HIV蛋白酶加工成活性形式，由此导致感染细胞的凋亡。全部以上蛋白酶级联实例都与本发明的方法相关，尽管对本发明方法优选的酶原基于以天然胱天蛋白酶原-3为基础的天然放大级联。数种胱天蛋白酶如胱天蛋白酶_3和胱天蛋白酶-8是粒酶B的天然底物，且我们已经使用胱天蛋白酶-3的这种性质来开发用于定量分泌的粒酶B的快速灵敏方法。在本发明的一个特定实施方案中，用于人、大鼠、黑猩猩或马粒酶B的优选酶原是未修饰的人胱天蛋白酶原-3,其包括根据GenbankNM_032991的由第29位的丝氨酸至第277位的组氨酸的氨基酸。在另一个实施方案中，有效用于检测分泌的人粒酶B、大鼠粒酶B、黑猩猩粒酶B或马粒酶B的人胱天蛋白酶原-3是突变变体，其第174位苏氨酸突变为脯氨酸，以实现人、大鼠、黑猩猩或马粒酶B更有效切割。在另一个实施方案中，人胱天蛋白酶原_3通过至少将第176位丝氨酸改变为缬氨酸或亮氨酸来进一步修饰，以减小白体活化。在一个实施方案中，具有由人粒酶B引起的改进切割的人胱天蛋白酶原-3在第174位具有脯氨酸而非苏氨酸且第176位丝氨酸突变为缬氨酸，第177位甘氨酸突变为亮氨酸，第178位缬氨酸突变为甲硫氨酸和第179位天冬氨酸突变为谷氨酸。具有包括氨基酸Ρ4-Ρ3-Ρ2-Ρ1-ΡΓ -P2, -P3 ^ -Pf的序列IETOVLME的这种胱天蛋白酶原-3对于人粒酶B切割最佳并且在缺乏粒酶B时具有非常低的自体活化，但被人粒酶B切割时具有完整活性。这样的具有高度减小的自体活化的突变人胱天蛋白酶原3如SEQ ID N0:11所示。已知鼠粒酶B的四肽特异性与人粒酶B显著不同。人和小鼠粒酶B比关于各粒酶B的异源胱天蛋白酶原_3更有效地切割物种-特异性胱天蛋白酶原_3。人胱天蛋白酶原-3通过小鼠粒酶B在包含P4-P3-P2-P1序列的IETD处(第175位的异亮氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸)的切割与通过人蛋白酶的切割相比约6倍更低效，即使两种胱天蛋白酶都具有相同的IETD切割序列，因此物种-特异性胱天蛋白酶原-3的使用对于本发明方法中的分泌粒酶B的检测是优选的。在本发明的一个实施方案中，用于测量有效的活化酶原的酶活性的方法选自比色法、荧光法、FRET、时间分辨-FRET或发光法。有效用于检测活性胱天蛋白酶3的底物的实例是:5' -FAM-Ser-Asp-Glu-Val-Asp-Ser-Gly-Ser-TAMRA,其是 FRET 底物；Lanthan-CDEVDK-Quench,其中 Lanthan 是镧系螯合物，例如，铕螯合物且Quench是镧系荧光的合适猝灭剂，例如用于时间分辨荧光计的QSYsup._ 7 ;用于荧光检测的DEVD-AMC和DEVD-AFC，和用于发光检测的DEVD-氨基荧光
素。
在另一个优选实施方案中，活化酶原如胱天蛋白酶_3的底物是细胞不能透过的底物，从而减小由胞内底物水解的背景。在另一个优选实施方案中，活性胱天蛋白酶_3的优选细胞不能透过的底物是序列DEVD的肽，所述序列DEVD在C-末端与7-氨基-4-甲基香豆素或罗丹明110或氨基荧光素偶联，或在一末端与用于FRET或时间分辨-FRET的荧光团偶联且另一末端与特定荧光团的荧光的合适猝灭剂偶联。在本发明的另一个实施方案中，分泌的蛋白酶的活性可以通过被该分泌的蛋白酶活化的酶原来检查，其中所述酶原是环状排列变换酶，其缺乏酶活性，除非被特定蛋白酶活化。环状排列变换是这样的过程，其中酶的氨基和羧基端相连接并且在该分子的任何位置形成新氨基和羧基端。用于本发明方法的有效环状排列变换酶是这样的酶，其通过环状排列变换而转变为具有低基础活性的酶原且活性通过蛋白酶切割恢复。环状排列变换酶原是本领域技术公知的。Plainkum P等(见Plainkum P等Nat Struct Biol.(自然结构生物学)2003年2月；10(2): 115-9.)首次证明通过连接核糖核酸酶A的N和C端，活性位点被痕原虫天冬氨酸蛋白酶II (即来自恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)的高度特异性蛋白酶)识别的氨基酸序列阻断。它们通过环状排列变换产生新N和C端，并且在存在疟原虫天冬氨酸蛋白酶II的条件下，核糖核酸酶原获得约1000倍催化活性并保持高度构象稳定性。其他研究者已经将N和C端的环状排列变换应用于形成可以被蛋白酶活化的新型酶原(见例如，Johnson RJ 等 FEBSJournal (FEBS 杂志)第 273 卷，第 23 刊，第 5457-5465页，2006 和 Jucovic M 等 Protein Engineering Design and Selection (蛋白工程设计和选择)2008 21(10):631-638)。在本发明的另一个实施方案中，用于定量分泌的蛋白酶的合适酶原选自具有对于高信号背景比而言低基础活性并因此获得更可靠测定的酶，和在被分泌的蛋白酶活化后具有高催化效率的酶。例如，修饰的肠激酶原具有非常高的基础活性，即低酶原性指数，这妨碍其用于灵敏检测人粒酶B。在本发明的另一个实施方案中，用于定量分泌的蛋白酶的优选酶原选自这样的酶，其反应缓冲液可以制成与用于胞吐作用的培养基相容。关于基于任何检测技术的灵敏报道分子检测，需要非常高效切割的特定蛋白酶底物。关于任何具体底物切割序列周围的氨基酸残基是蛋白酶报道分子催化效率的主要决定因素。在一个实施方案中，具有类胰蛋白酶-样活性的有效的颗粒存储的报道分子选自包括粒酶A和粒酶K的组。在另一个实施方案中，具有天冬裂酶样活性的有效的颗粒存储的报道分子是粒酶B。在另一个实施方案中，具有胃促胰酶-样活性的有效的颗粒存储的报道分子选自包括粒酶H、胃促胰酶和组织蛋白酶G的组。在再一个实施方案中，具有弹性蛋白酶-样活性的有效的颗粒存储的报道分子选自包括粒酶M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和蛋白酶3的组。在一个实施方案中，有效的颗粒存储的报道分子选自包括人、小鼠，大鼠、马、牛、短尾负鼠、绵羊和山羊组的物种的丝氨酸内肽酶。在本发明的一个特定实施方案中，异源报道分子选自一组丝氨酸蛋白酶，其包括来自人、大鼠、黑猩猩和马物种的粒酶B，因为粒酶B蛋白酶是唯一已知的绝对需要在天冬氨酸后切割的丝氨酸蛋白酶。在本发明的一个实施方案中，用作传感器报道分子的人、大鼠、黑猩猩和马物种粒酶B的优选底物包括P4处的选自异亮氨酸或缬氨酸的氨基酸；P3处的选自谷氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的氨基酸；P2处的选自脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或组氨酸的氨基酸；和在Pl处的天冬氨酸。在本发明的另一个实施方案中，来自人、大鼠、黑猩猩或马物种的那些粒酶B的进一步优选扩展的底物包括Pl'处的选自缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的不带电氨基酸和P2'处的选自丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸的氨基酸。在本发明方法的另一个优选实施方案中，人、大鼠、黑猩猩或马物种的粒酶B的进一步优选底物包括这样的序列:P4处的异亮氨酸，P3处的谷氨酸，P2处的脯氨酸或苏氨酸和Pl处的天冬氨酸。进一步优选的底物还包括Pl'处的丝氨酸和P2'处的甘氨酸或亮氨酸。在本发明的一个实施方案中，用作传感器报道分子的人、大鼠和小鼠物种的粒酶A的底物包括P4处的选自异亮氨酸、缬氨酸，或甘氨酸的氨基酸；P3处的选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的氨基酸；P2处的选自天冬酰胺或苯丙氨酸的氨基酸和Pl处的精氨酸或赖氨酸。在本发明的另一个实施方案中，人、鼠或小鼠粒酶A的进一步优选扩展的底物包括Pl'处的长线性疏水性氨基酸诸如脂肪族侧链的赖氨酸和甲硫氨酸，或无支链疏水性氨基酸如丙氨酸或极性残基如丝氨酸4ΡΡ2^处的选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸。在本发明方法的另一个优选实施方案中，人粒酶A的进一步优选底物包括P4处的缬氨酸或异亮氨酸，P3处的丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，P2处的天冬酰胺或天冬氨酸和Pl处的精氨酸。进一步优选的底物还包括Pl'处的丝氨酸或甲硫氨酸和P2'处的缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。在本发明方法的另一个优选实施方案中，小鼠粒酶A的进一步优选底物包括P4处的甘氨酸或缬氨酸，P3处的酪氨酸或苯丙氨酸，P2处的苯丙氨酸或天冬酰胺和Pl精氨酸。小鼠粒酶A的进一步优选底物还包括Pl'处的丝氨酸或甲硫氨酸和P2处的缬氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸。在本发明的一个实施方案中，用作传感器报道分子的人胃促胰酶的底物包括P4处的选自甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸的氨基酸；P3处的选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或谷氨酸的氨基酸；P2处的选自天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸的氨基酸和Pl处的酪氨酸或苯丙氨酸。在本发明的另一个实施方案中，人胃促胰酶的进一步优选扩展的底物包括Pl'处的丝氨酸或甘氨酸；P2,处的选自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸或甘氨酸的氨基酸和P3'处的选自缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甘氨酸的氨基酸。在本发明方法的 另一个优选实施方案中，人胃促胰酶的进一步优选底物包括P3处的组氨酸、谷氨酸或苏氨酸；P2处的脯氨酸或苏氨酸；和Pl处的苯丙氨酸或酪氨酸。进一步优选底物还包括Pl'处的丝氨酸和P2'处的天冬氨酸、谷氨酸或丙氨酸。在本发明的一个实施方案中，用作传感器报道分子的人、大鼠和小鼠物种蛋白酶3的底物包括P4处的具有小脂肪族残基的氨基酸如缬氨酸和丙氨酸；P3处的具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸和缬氨酸；P2处的选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸的带电氨基酸和Pl处的选自半胱氨酸、正缬氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，人、大鼠或小鼠蛋白酶3的进一步优选扩展的底物包括Pl'处的选自精氨酸和赖氨酸的带正电氨基酸或具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸或缬氨酸4ΡΡ2^处的选自天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺的氨基酸。在本发明方法的另一个优选实施方案中，人蛋白酶3的进一步优选底物包括P4处的缬氨酸或丙氨酸；P3处的缬氨酸或丙氨酸；P2处的天冬氨酸和Pl处的半胱氨酸、缬氨酸或正缬氨酸。进一步优选底物还包括Pl'处的丙氨酸或赖氨酸，P2^处的天冬氨酸和P3'处的精氨酸。在本发明的一个实施方案中，用作传感器报道分子的人、大鼠和小鼠物种嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的底物包括P4处的脯氨酸或具有小脂肪族残基的氨基酸如缬氨酸和丙氨酸；P3处的具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸和缬氨酸或选自天冬氨酸和谷氨酸的带负电氨基酸；P2处的具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸和缬氨酸或选自天冬氨酸和谷氨酸的带负电氨基酸和Pl处的选自异亮氨酸、正缬氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的疏水性或极性氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，人、大鼠或小鼠嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的进一步优选扩展的底物包括Pl'处的疏水性或极性或带负电氨基酸和P2,处的疏水性或带负
电氨基酸。在本发明方法的另一个优选实施方案中，人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的进一步优选底物包括P4处的脯氨酸或缬氨酸或丙氨酸；P3处的谷氨酸或缬氨酸或丙氨酸；P2处的谷氨酸和Pl处的异亮氨酸、缬氨酸或正缬氨酸。进一步优选底物还包括Pl'处的甲硫氨酸，P2;处的精氨酸或天冬氨酸和P3^处的精氨酸。本发明传感器的一个相关特性是不同的基于细胞的传感器可以在同一反应器中组合，从而在各反应器中产生多重测定。为了在同一反应器中组合，各基于细胞的传感器必须产生特定胞吐作用调节剂和特定颗粒存储的报道分子的独特组合。另外，当释放时，这样的颗粒存储的报道分子必须使用特定底物来检测，所述特定底物具有与其他底物或其他释放报道分子的最小或优选无干扰作用。在本发明的一个实施方案中，至少两个基于细胞的传感器，其各产生一种胞吐作用调节剂和一种颗粒存储的报道分子的独特特定组合，可以在同一反应器中混合，产生多
重反应。在另一个实施方案中，2或3或4或5或6个不同的基于细胞的传感器在与细胞存活性、颗粒胞吐作用和所有颗 粒存储的报道分子的酶活性相容的培养基中，在同一反应中混合。在一个特定实施方案中，与细胞存活性、颗粒胞吐作用和酶活性相容的培养基是25mM Hepes pH = 7，4 ；130mM NaCl 5，65mM KCl ；1, 2mM KH2P04 ；0, 6mM MgCl2 ；1, 8mMCaC12 ；0，I %葡萄糖和0，I %牛血清清蛋白。在一个优选的实施方案中，用于检测混合的报道分子的酶活性的方法选自FRET或时间分辨FRET。例如,Biosearch Technologies (生物探索技术)已经开发了高效粹灭剂，以商标BHQsup.TM或Blackhole粹灭剂销售，而Anaspec已经开发了 QXLsup.TM粹灭剂和PerkinElmer QSYsup._粹灭剂。为了使成对的猝灭剂_荧光团有效，荧光团的发射荧光谱必须与猝灭剂的吸收谱重叠。数种成对荧光团-猝灭剂可以混合，以通过组合荧光团形成多重反应，所述荧光团的荧光发射谱不重叠或最小重叠。在另一个实施方案中，不同报道分子酶的活性通过荧光和发光法的组合来检测。C.本发明基于细胞的传感器的应用本发明的基于细胞的传感器通常有效用于测试至少两种分子之间的相互作用，其中一种担当胞吐作用调节剂且另一种作为胞吐作用调节剂的特异性配体。例如，在药物发现中，针对靶标测试数千或甚至数百万小分子，从而发现改变该靶标活性的小分子。在特定实施方案中，筛选化合物，以获得G-蛋白偶联受体(即一种高度可药用受体类型)的激动齐喊拮抗齐U。但是相同传感器在检测和定量调节颗粒胞吐作用的化合物，例如，在例如食品工业、环境样品和用于诊断的数种样品中的药物滥用中具有应用。该传感器的应用不局限于细胞表面受体或表面受体的小调节剂。例如，使用结合待测蛋白的成对的两个分子，通过利用本发明的传感器可以进行快速、特异性且灵敏检测，条件是结合待测蛋白的分子中的一个是特异性免疫球蛋白E且另一个结合待测蛋白的分子诱导待测蛋白的寡聚化。以上传感器的其他应用是用于测试抗变应性化合物和用于检测变应原。D.用于测试化合物是否调节胞吐作用的试剂盒本发明还包括用于测试化合物是否调节胞吐作用的试剂盒。该试剂盒至少包括:具有专职受控胞吐作用的造血细胞系，其使用在合适启动子的控制下的异源蛋白酶报道分子来转染，和用于检测分泌的异源蛋白酶报道分子的特异性底物。另外，具有专职受控胞吐作用的造血细胞系可以使用在合适启动子，如GPCR、异源Fe Y I受体或异源Fe ε I受体的控制下的异源性胞吐作用调节剂来转染，或可以使用内源性胞吐作用调节剂如内源性Fce受体I (IgE受体)。使用IgE受体作为胞吐作用调节剂的试剂盒可以包括特异于待测分析物的IgE和用于诱导与IgE结合的分析物的寡聚化的第二分子。
实施例现在参考下述实施例描述本发明。这些实施例仅是为举例说明的目的提供，并且本发明绝不应该解释为限于这些实施例，相反应该解释为包括因本文提供的教导而变得显而易见的任意的和所有的变化。尽管出于描述的目的已经在本文中描述了具体的实施方案，但是本领域技术人员应该理解可以在不背离如在附上的权利要求中所述的发明的前提下进行各种细节变化。下述表格描述实施例中所用的颗粒存储的蛋白酶报道基因的总结。表1-.用于本发明的方法的颗粒存储的报道分子的实例
权利要求
1.基于细胞的传感器，其包括: a具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的造血细胞系， b蛋白酶报道分子，其转染到(a)所述细胞系中，存储在所述细胞系的分泌颗粒中， c (a)所述细胞系的分泌颗粒的受控胞吐作用的内源性调节剂或转染的异源性调节剂， d用于检测所述分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的特异性底物。
2.权利要求1的基于细胞的传感器，其中所述具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的细胞系是造血细胞系和/或它们的后代，其选自由髓样细胞系组成的组，或选自由淋巴样细胞系组成的组，所述髓样细胞系包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、红细胞、巨核细胞、血小板和树突细胞，所述淋巴样细胞系包括T-细胞、B-细胞和NK-细胞。
3.权利要求1-2的基于细胞的传感器，其中所述细胞选自由以下各项组成的组:大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3、小鼠骨髓造血细胞系32D、天然杀伤细胞系人NK92细胞系、天然杀伤细胞系人YT细胞系和小鼠肥大细胞小鼠MC/9细胞系。
4.权利要求1-3的基于细胞的传感器，其中所述胞吐作用调节剂是多肽，所述多肽在被活化或抑制时诱导胞内钙、cAMP、二酰甘油(DAG)磷脂或ATP水平变化，其转而控制或调节钙触发的胞吐作用。
5.权利要求1-4的基于细胞的传感器，其中所述受控分泌颗粒胞吐作用调节剂是内源性表面受体或转染的异源性表面受体。
6.权利要求5的基于细胞的传感器，其中所述表面受体选自由以下各项组成的组:G-蛋白偶联受体(GPCR)、携带ITAM基序的受体、携带ITIM基序的受体和蛋白酪氨酸激酶受体。
7.权利要求1-6的基于细胞的传感器，其中所述受控分泌颗粒胞吐作用调节剂是嵌合受体，其包括:(a)具有配体结合结构域的胞外区和(b)包含ITAM序列的Fe受体的至少跨膜和胞内区，用于在胞外区配体结合诱导受体寡聚化之后增加胞内钙。
8.权利要求1-7的基于细胞的传感器，其中稳定转染至所述细胞系中并存储在所述分泌颗粒中的蛋白酶报道分子是多肽，所述多肽对造血细胞颗粒内部的蛋白质水解和低pH环境具有抗性。
9.权利要求8的基于细胞的传感器，其中稳定转染至所述细胞系中的、由分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子是丝氨酸蛋白酶。
10.权利要求9的基于细胞的传感器，其中丝氨酸蛋白酶选自由天然存储在造血细胞颗粒中的丝氨酸蛋白酶组成的组，包括具有在天冬氨酸后切割的天冬裂酶样活性的酶；具有在苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸后切割的胃促胰酶-样活性的酶；具有在赖氨酸或精氨酸后切割的类胰蛋白酶-样活性的酶或具有在缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸或半胱氨酸后切割的弹性蛋白酶-样活性的酶。
11.权利要求8-10的基于细胞的传感器，其中所述丝氨酸蛋白酶是选自由以下各项组成的组的粒酶:人粒酶A、B、H、K和M、鼠粒酶A、B、C、D、E、F、G、K、M、L和N ;牛粒酶B、黑猩猩粒酶B、短尾负鼠粒酶B和马粒酶B。
12.权利要求8-10的基于细胞的传感器，其中所述丝氨酸蛋白酶选自人胃促胰酶、人组织蛋白酶G、人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和人蛋白酶3。
13.权利要求1-12的基于细胞的传感器，其中所述颗粒存储的蛋白酶报道分子是来自人、大鼠、黑猩猩和/或马物种的粒酶B，且用于检测报道分子胞吐作用的底物包括处于P4的选自异亮氨酸或缬氨酸的氨基酸；处于P3的选自谷氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的氨基酸；处于P2的选自脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸、甘氨酸或组氨酸的氨基酸，和处于Pl的天冬氨酸。
14.权利要求13的基于细胞的传感器，其中所述底物还包括处于Pl'的选自缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的不带电氨基酸和处于P2'的选自丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸或谷氨酸的氨基酸。
15.权利要求13-14的基于细胞的传感器，其中所述底物包括以下序列:处于P4的异亮氨酸、处于P3的谷氨酸、处于P2的脯氨酸或苏氨酸；处于Pl的天冬氨酸；处于Pl'的丝氨酸和处于P2的甘氨酸或亮氨酸。
16.权利要求1-12的基于细胞的传感器，其中所述颗粒存储的蛋白酶报道分子是人、大鼠和/或小鼠物种的粒酶A，且用于检测报道分子胞吐作用的底物包括处于P4的选自异亮氨酸、缬氨酸或甘氨酸的氨基酸；处于P3的选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的氨基酸；处于P2的选自天冬酰胺或苯丙氨酸的氨基酸；处于Pl的精氨酸或赖氨酸；处于Pl'的长线性疏水性氨基酸诸如脂肪族侧链的赖氨酸和甲硫氨酸，或无支链疏水性氨基酸如丙氨酸或极性残基如丝氨 酸；和处于P2的选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的氨基酸。
17.权利要求1-12的基于细胞的传感器，其中所述颗粒存储的蛋白酶报道分子是人胃促胰酶，且用于检测报道分子胞吐作用的底物包括处于P4的选自甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸的氨基酸；处于P3的选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或谷氨酸的氨基酸；处于P2的选自天冬酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸的氨基酸；处于Pl的酪氨酸或苯丙氨酸；处于Pl'的丝氨酸或甘氨酸；处于P2的选自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸或甘氨酸的氨基酸和处于P3的选自缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甘氨酸的氨基酸。
18.权利要求1-12的基于细胞的传感器，其中所述颗粒存储的蛋白酶报道分子是人、大鼠和小鼠物种的蛋白酶3，且用于检测报道分子胞吐作用的底物包括处于P4的具有小脂肪族残基的氨基酸如缬氨酸和丙氨酸；处于P3的具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸和缬氨酸；处于P2的选自天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和赖氨酸的带电氨基酸；处于Pl的选自半胱氨酸、正缬氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的氨基酸；处于Pl'的选自精氨酸和赖氨酸的带正电氨基酸或具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸或缬氨酸；和处于P2'的选自天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺的氨基酸。
19.权利要求1-12的基于细胞的传感器，其中所述颗粒存储的蛋白酶报道分子是人、大鼠和小鼠物种的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，且用于检测报道分子胞吐作用的底物包括处于P4的脯氨酸或具有小脂肪族残基的氨基酸如缬氨酸和丙氨酸；处于P3的具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸和缬氨酸或选自天冬氨酸和谷氨酸的带负电氨基酸；处于P2的具有小脂肪族残基的氨基酸如丙氨酸和缬氨酸或选自天冬氨酸和谷氨酸的带负电氨基酸；处于Pl的选自异亮氨酸、正缬氨酸、缬氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸的疏水性或极性氨基酸；处于Pl'的疏水性或极性或带负电氨基酸和处于Ρ2的疏水性或带负电氨基酸。
20.获得权利要求1-19的生物传感器的方法，其包括使用载体转化权利要求2-3中的造血细胞系，所述造血细胞系携带权利要求4-6中的受控分泌颗粒胞吐作用的内源性调节齐U，所述载体在合适启动子控制下编码权利要求8-19中的分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子。
21.获得权利要求1-19的生物传感器的方法，其包括使用在合适启动子控制下表达权利要求4-7中的受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的载体和在合适启动子控制下编码权利要求8-19中的分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的载体转化权利要求2-3中的造血细胞系。
22.权利要求21的方法，其中编码权利要求4-7中的受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的载体也包含用于细胞表面受体表达的信号肽，和/或用于阳性细胞的表面检测和/或分离的标签。
23.权利要求21的方法，其中用于受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的组成型表达的启动子选自由以下各项组成的组:人或小鼠延伸因子l-α启动子(hEFla)(SEQ ID ΝΟ:1)、来自人(hPGK)、小鼠和大鼠物种的磷酸甘油酸激酶启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子(SEQID NO:2)和来自莫洛尼鼠白血病病毒启动子的5^ LTR即MoMLV-5' LTR(SEQ ID NO:3)。
24.权利要求21的方法，其中用于表达受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的启动子是诱导型启动子。
25.权利要求24的方法，其中所述诱导型启动子选自由以下各项组成的组:四环素诱导型启动子、蜕皮素诱导型启动子、cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子。
26.权利要求21-25的方法，其中用于表达受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的载体包含用于表面过表达的糖基化序列。
27.权利要求26的方法，其中所述糖基化序列包含SEQID NO:4。
28.权利要求21-27的方法，其中用于受控分泌颗粒胞吐作用调节剂组成型表达的载体是 P-MoMLV-5' LTR-SP-cmyc-标签-VGS-MCS-polyA (SEQ ID NO:5)。
29.权利要求20-21的方法，其中编码分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的载体包含天然存在的序列或密码子优化序列以用于在造血细胞系中高表达。
30.权利要求20-29的方法，其中表达颗粒存储的蛋白酶报道分子的启动子选自由中等至强蛋白表达启动子组成的组。
31.权利要求30的方 法，其中所述启动子选自由以下各项组成的组:hCMV和MoMLV-5' -LTR启动子的嵌合启动子(SEQ ID NO:10) ；MoMLV-5; LTR启动子(SEQ ID NO:3);延伸因子l-α启动子(SEQ ID NO: I) ;RSV启动子(SEQ ID NO:2);人巨细胞病毒启动子和胸苷激酶启动子。
32.权利要求20-29的方法，其中所述颗粒存储的报道分子在诱导型启动子控制下表达。
33.权利要求32的方法，其中所述诱导型启动子选自由以下各项组成的组:四环素诱导型启动子、蜕皮素诱导型启动子、cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子。
34.测试至少两个分子之间相互作用的方法，一个分子担当胞吐作用调节剂且另一个分子担当所述胞吐作用调节剂的特异性配体，所述方法包括以下步骤: a)在与细胞存活、胞吐作用和分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的酶活性相容的培养基中温育权利要求1-19的基于细胞的传感器， b)添加胞吐作用调节剂的特异性配体， c)添加颗粒存储的蛋白酶报道分子的特异性底物，和 d)使用被释放报道分子的特异性底物检测被释放报道分子多肽(由颗粒释放至胞外培养基中)的酶活性。
35.权利要求34的方法，其中测试所述相互作用在单重或多重测定中进行。
36.权利要求34-35的方法，其中分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的酶活性利用细胞不能透过的底物来测量，所述细胞不能透过的底物选自由以下各项组成的组:比色底物、荧光底物、FRET底物、时间分辨-FRET底物或发光底物。
37.权利要求36的方法，其中检测颗粒分泌的蛋白酶通过发光测量法，使用肽-修饰的荧光素底物来进行。
38.权利要求37的方法，其中荧光底物是基于罗丹明110的蛋白酶底物，其由与罗丹明IlO(RllO)的各氨基共价连接的特定肽组成，在酶切割时，非荧光双酰胺底物以两步过程进行转化，首先转化成荧光单酰胺和然后转化成甚至更多的荧光Rl 10。
39.权利要求38的方法，其中检测颗粒分泌的蛋白酶通过405nm处的比色法检测，利用C-末端偶联P-硝基苯胺(pNA)的蛋白酶特异性肽底物进行；或通过具有380nm处激发和460nm发射波长的荧光，利用C-末端偶联7-氨基-4-甲基香豆素的蛋白酶特异性肽底物进行；或通过具有400nm处激发和505nm处发射的荧光，利用C-末端偶联7-氨基-三氟甲基香豆素的蛋白酶特异性肽底物进行。
40.权利要求34-35的方法，其中检测分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子的活性包括产生用于信号放大的酶促级 联，其中报道分子分泌的蛋白酶的活性通过由所述分泌的蛋白酶激活的酶原来检测。
41.权利要求40的方法，其中用于人、大鼠、黑猩猩或马粒酶B检测的酶原是突变的人胱天蛋白酶原3 JBSEQ ID ΝΟ:11所示。
42.权利要求40-41的方法，其中由分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子激活的酶原的酶活性利用细胞不能透过的底物来测量，所述细胞不能透过的底物选自由以下各项组成的组:比色底物、荧光底物、FRET底物、时间分辨-FRET底物或发光底物。
43.权利要求40的方法，其中所述酶原是环状排列变换的酶，其缺乏酶活性，除非被分泌颗粒存储的蛋白酶报道分子激活。
44.权利要求1-19的基于细胞的传感器用于确定与成对的两个分子结合的蛋白的应用，其中与待确定的蛋白结合的分子中的一个是特异性免疫球蛋白G、或特异性免疫球蛋白E、或特异性免疫球蛋白A，且与待确定的蛋白结合的第二个分子在结合时诱导待确定蛋白的寡聚化。
45.权利要求1-1944的基于细胞的传感器的应用，其用于测试药物发现中分子间相互作用或用于定量分子诸如蛋白以用于诊断或检测食品工业样品中、环境样品中和制药工业中的药物或分子或用于测试IgE-变应原相互作用，用于测试抗变应性化合物和/或用于检测变应原。
46.权利要求1-19的基于细胞的传感器在单重测定中的应用，其中仅一个基于细胞的传感器包含在单一反应器中，并且其中在特异性配体与胞吐作用调节剂反应后仅检测一种颗粒存储的蛋白酶报道分子。
47.权利要求1-19的基于细胞的传感器在多重测定中的应用，其中至少两个不同的基于细胞的传感器包含在单一反应器中，每个具有不同的成对的胞吐作用调节剂-颗粒存储蛋白酶报道分子，并且其中在至少两种不同的特异性配体分别与不同的胞吐作用调节剂反应后检测至少两种不同的颗粒存储的蛋白酶报道分子。
48.用于测试化合物是否调节胞吐作用的试剂盒，其包括权利要求1-19的基于细胞的传感器。
49.根据权利要求48的试剂盒，其包括至少一种用于检测分泌的异源性蛋白酶报道分子的特异性底物。
50.根据权利要求48-49的试剂盒，其中所述基于细胞的传感器包括IgE、IgG或IgA受体，作为待确定的分析物的胞吐作用调节剂，和第二分子，其用于诱导与IgE、IgG或IgA结合的分析物的寡聚化 。
全文摘要
本发明涉及在药物发现中有用的新的基于细胞的传感器，所述基于细胞的传感器包括具有分泌颗粒的专职受控胞吐作用的细胞系，所述细胞系用作为报道分子多肽的存储在具有专职受控胞吐作用的细胞系的受控分泌颗粒中的蛋白酶转染，并具有作为受控分泌颗粒胞吐作用调节剂的内源或异源分子，所述颗粒存储的蛋白酶报道分子至少具有针对颗粒内已经存在的条件诸如低pH和其他蛋白酶的蛋白水解作用的高度抗性；胞吐作用后的酶活性；高度特异性切割序列；在无刺激或基础条件下非常低的分泌水平；和在与细胞培养物生存力和颗粒胞吐作用相容的培养基中高信号与背景活性比，以获得高通量的可靠且灵敏的检测。
文档编号G01N33/50GK103154731SQ201080068285
公开日2013年6月12日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者埃利耶·帕斯-罗哈斯, 玛丽亚·德·格拉西亚·蒙特罗-佩尼亚尔沃, 韦罗妮卡·马库拉达·卢纳-格雷罗, 费·伊莎贝尔·加西亚·马塞拉, 何塞·安德列斯·莫拉莱斯-马丁内斯, 塔尼亚·加西亚·马塞拉, 安娜·贝伦·阿拉贡-戈麦斯, 安娜·克萨达-莫利纳, 奥罗拉·玛丽亚·马克斯-莫拉莱斯 申请人:坎瓦克斯生物技术公司
专业数控铣床产品供应商
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