专利名称：光学显微镜及光学计测的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够应用于使用受激拉曼散射的分子振动成像方法等的光学显微镜、 以及光学计测。
背景技术：
利用拉曼散射原理的显微镜作为反映分子的振动信息的分子振动成像方法，期待将其应用于生物体的细胞观察等。以往，作为使用拉曼散射的显微镜，已知有自发拉曼散射显微镜和相干反斯托克斯拉曼散身寸(coherent anti-Stokes Raman scattering，CARS)显微镜。前者利用激励光发生试件的分子振动频率的量的频率变化来取得试件的光谱信息，但是得到的信号光非常微弱，所以提高信噪(S/N)比是一个比较大的课题。另一方面， 后者使用2色(ωκ、ω5)的光脉冲，在与激励光不同的频率产生CARS光。在 CARS中使分子强制地振动，所以有能够得到高S/N比的信号这一特长。但是，由于存在试件的电子的非线性响应引起的所谓非共鸣信号，并且其成为背景噪声(background)，所以存在得到的分子振动影像的对比度降低这一课题。作为解决这样的相反的以往的拉曼散射显微镜的课题的方法，发明者们(参照非专利文献1)和哈佛大学的Surmy Xie(参照非专利文献幻独立提出了受激拉曼散射 (stimulated Raman scattering、SRS)显微镜。受激拉曼散射显微镜的原理如下。S卩，在对2色(coAS、ω5)的光脉冲中的一方实施了强度调制的状态下对试件聚光照射时，如果2色的频率差与聚光点的试件的分子振动频率一致，则在聚光点发生受激拉曼散射的现象。这时，在未实施强度调制的一方的激励光脉冲中产生强度调制，通过对从试件射出的激励光进行光检测，能够检测出由受激拉曼散射产生的强度调制部分。因此，根据由该受激拉曼散射产生的强度调制部分，能够对试件的分子振动进行成像。图12表示以往的受激拉曼散射显微镜的、进行原理确认时的结构框图。如图12所示，以往的受激拉曼散射显微镜500使用分色镜(dichroic) 505将从钛蓝宝石激光器501照射的反斯托克斯光(《AS)和从光参量振荡器502照射并在声光元件 (AOM) 503中进行了强度调制的斯托克斯光(ω》合波为同轴，经由物镜506对试件507聚光照射。经由物镜508、窄带滤光片(short pass filter) 509、聚光透镜510使用光电二极管(PD)511和锁定放大器(lock-in amplifier) 512检测这时的散射光。另外，504是反射镜，反斯托克斯光(ωκ)的重复频率为76MHz、中心波长为765nm、脉冲宽度为lOOfs，斯托克斯光(《s)的重复频率为76MHz、中心波长为985 1005nm、脉冲宽度为200fs。此外，高频信号源513的频率为2MHz。在先技术文献非专利文献非专利文献1 受激拉曼散射显微镜的原理确认；嶽文宏、小関泰之、伊東一良、Optics &Photonics Japan 2008，5pC12，2008 年 11 月 5 日非专利文献2 :Chiristian W. Freudiger, Wei Min, Brian G. Saar, Sijia Lu, Gary R. Holtorn, Chengwei He, Jason C. Tsai, Jing X. Kang, X. Sunney Xie, "Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy (通过使用受激拉曼散射的显微镜进行的非标识的高感度生物医学的图像解析)，，SCIENCE V0L322 19DECEMBER 2008pp. 1857-1861发明的概要发明要解决的问题但是，在上述以往的受激拉曼散射显微镜中，由于作为光源的激光器的强度噪音的影响，存在S/N比降低的问题。此外，需要用于对斯托克斯光进行强度调制的声光元件， 存在系统复杂化的问题。由于越是高频则激光器的强度噪音越少，所以为了降低激光器的强度噪音，提高调制频率是有效的。但是，如果调制频率变高，则对于进行强度调制的声光元件的要求变严格，系统的复杂化的问题更加显著。此外，由于进行强度调制方面的制约，提高调制频率存在限制，因此难以得到高品质的运动图像的成像图像。
发明内容
在此，本发明的目的在于，得到一种光学显微镜，该光学显微镜所具备的光学系统统，即使在为了解决上述以往的课题、抑制光源系统的复杂化、降低激光器的强度噪音的影响等而提高了调制频率的情况下，也能够容易地对应。解决问题所使用的技术手段为解决上述课题，本发明的光学显微镜的特征在于，对试件照射第一光脉冲串和第二光脉冲串，所述第一光脉冲串由第一光源生成，具有第一光频率，所述第二光脉冲串与所述第一光脉冲串在时间上同步，由第二光源生成，具有第二光频率，所述光学显微镜检测来自所述试件的散射光，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率是所述第二光源生成的光脉冲串的重复频率的整数分之一。发明的效果根据本发明的光学显微镜，由于不需要以往的光学显微镜所使用的用于强度调制的元件，能够使光学显微镜的系统简易化，此外，较高地设定光脉冲串的调制频率，能够得到S/N比较高的影像图像。
图1是表示本发明的第一实施方式的光学显微镜的概略结构的结构框图。图2是表示由受激拉曼散射显微镜得到的受激拉曼散射信号的例的图。图3是表示由受激拉曼散射显微镜得到的分子振动影像的例。图3 (a) (b)是表示水中的聚苯乙烯液滴(beads)的分子振动影像的图，图3(c) (d)表示植物细胞的分子振动影像的图。图4是表示本发明的第二实施方式的光学显微镜的概略结构的结构框图。图5是表示本发明的第二实施方式的光学显微镜中使用的光纤维激光器的概略结构的框图。图6是表示本发明的第二实施方式的光学显微镜中的、时差检测光学系统中使用的来自光电二极管的输出信号的状态的图。图7是表示本发明的第二实施方式的光学显微镜中的、2色的超短光脉冲激光束的同步状态的图。图8是表示在锁定(lock-in)频率不同的情况下，由受激拉曼散射显微镜得到的分子振动影像的区别的图。图8(a)是锁定频率为2MHz的情况的聚苯乙烯液滴的分子振动影像，图8(b)是锁定频率为IOMHz的情况的聚苯乙烯液滴的分子振动影像。图9是表示在锁定频率不同的情况下，由受激拉曼散射显微镜得到的分子振动影像的区别的图。图9(a)是锁定频率为2MHz的情况的植物细胞的分子振动影像，图9 (b)是锁定频率为IOMHz的情况的植物细胞的分子振动影像。图10是表示由本发明的第二实施方式的光学显微镜得到的分子振动影像中的锁定频率和噪音的大小的关系的图。图11是表示本发明的第二实施方式的光学显微镜中的光电二极管驱动电路的电路结构的框图。图12是表示以往的受激拉曼散射显微镜的概略结构的结构框图。
具体实施例方式本发明的光学显微镜对试件照射第一光脉冲串和第二光脉冲串，所述第一光脉冲串由第一光源生成，具有第一光频率，所述第二脉冲串与所述第一光脉冲串在时间上同步， 由第二光源生成，具有第二光频率，所述光学显微镜检测来自所述试件的散射光，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率是所述第二光源生成的光脉冲串的重复频率的整数分之
ο这样，在使用例如受激拉曼散射显微镜的情况下，当第一光频率和第二光频率的频率差与试件的分子振动频率一致时，产生受激拉曼散射，从而来自试件的散射光被强度调制，并检测该强度调制成分，从而能够对试件的分子振动进行成像。因此，不使用以往那样的用于强度调制的元件，能够得到具有简易的光学显微镜的系统、并且使用容易将光脉冲串的调制频率设定得较高的受激拉曼散射的光学显微镜。此外，在本发明的光学显微镜中，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率优选为所述第二光源生成的光脉冲串的重复频率的二分之一。这样，由第一光脉冲串和第二光脉冲串能够最有效地生成受激拉曼散射，能够得到能够更良好地制作试件的分子振动影像的光学显微镜。进而，优选为，具备所述第一光源；所述第二光源；照射光学系统，将所述第一光脉冲串和所述第二光脉冲串同时地对所述试件照射；聚光光学系统，将来自所述试件的散射光中的所述第一光脉冲串除去，并将其他光脉冲串聚光；受光元件，将由所述聚光光学系统聚光后的散射光变换为电信号并输出；以及对所述受光元件的输出信号进行同步检波的电路。这样，能够容易地实现简易的系统的光学显微镜。进而，此外，优选为，所述第一光源及所述第二光源的至少某一方为光纤维激光器，具备时差(日文夕4 $ 差)检测光学系统，该时差检测光学系统检测所述第一光脉冲串和所述第二光脉冲串的时差，基于来自所述时差检测光学系统的输出信号，对配置于所述光纤维激光器的谐振器内的光路长度调制机构进行驱动，使所述第一光脉冲串的定时和所述第二光脉冲串的定时整合。这样，能够高精度地使第一光脉冲串的定时和第二光脉冲串的定时整合，能够实现能够得到S/N比较高的清晰的分子振动影像的光学显微镜。此外，在所述时差检测光学系统中，优选为，检测将所述第一光脉冲串的激光和所述第二光脉冲串的激光聚光照射而生成的双光子吸收电流。这样，能够以较高的精度检测 2色的超短光脉冲激光束的定时偏移。进而，优选为，所述光路长度调制机构为可变延迟线及相位调制器。这样，使用能够在长距离上机械地调节光路长度的可变延迟线、以及能够通过施加的电压使结晶的折射率变化从而高速地调节光路长度的相位调制器，能够实现更高精度且长时间稳定的定时同
止
少ο进而，此外，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率优选为IOMHz以上，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率进一步优选为38MHz以上。此外，作为本发明的光学显微镜，其特征在于，对试件照射具有第一光频率的第一光脉冲串和与所述第一光脉冲串在时间上同步的具有第二光频率的第二光脉冲串，通过光电二极管检测来自所述试件的散射光，取得来自所述光电二极管的输出信号的光电二极管驱动电路具有与所述光电二极管并联连接的电感，以及与所述电感并联连接的电阻值为 100 Ω以上的负载电阻。通过做成这样的结构，在较高的锁定频率下的影像图像的检测中，能够有效防止光电二极管的寄生电容引起的频率特性的下降。进而，本发明能够作为具有如下特征的光学计测来掌握，即，使用从第一光源生成的第一光脉冲串和从第二光源生成的第二光脉冲串，进行锁定检测，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率是所述第二光源的生成的光脉冲串的重复频率的整数分之一。这样，进行锁定检测的重复频率不同的第一光脉冲串及第二光脉冲串是从生成不同的重复频率的光的光源生成的，从而能够简易地构成以能够提高S/N比的、以较高的频率进行锁定检测的光学计测。以下参照
本发明的实施方式。(第一实施方式)图1是表示本发明的第一实施方式的使用了受激拉曼散射(SRQ效应的光学显微镜的概略结构的框图。如图1所示，本实施方式的受激拉曼散射显微镜100具有第一光源1，生成第一光脉冲串；第二光源2，生成第二光脉冲串；照射光学系统21，由反射镜3、半反射镜4和第一物镜5构成；聚光光学系统22，由第二物镜7、滤光片8及聚光透镜9构成；以及作为受光元件的光电二极管10，作为对光电二极管10的输出信号进行同步检波的电路的锁定放大器Ilo此外，如图1所示，在第一物镜5和第二物镜7之间配置有测定对象的试件6。在本实施方式的受激拉曼散射显微镜100中，作为生成斯托克斯光(ω》的第一光脉冲串的第一光源1，使用钛蓝宝石激光源。将激光的光频率设定为中心频率lOOOnm，将脉冲宽度设定为200fs (飞母托秒)，将重复频率设定为38MHz。
此外，生成作为反斯托克斯光(ωκ)的第二光脉冲串的第二光源2与第一光源同样，使用钛蓝宝石激光源，光频率为770nm左右的适当的值，脉冲宽度为lOOfs，重复频率为 76MHz。结合测定对象试件进行适当调整，以使该第二光脉冲串的光频率与第一光脉冲串的光频率的频率差和测定对象试件的分子振动频率一致。另外，在本实施方式的受激拉曼散射显微镜100中，第一光源和第二光源分别使用不同的脉冲激光源，为了取得这些激光脉冲光源的同步，将两者电连接。但是，本发明的第一光源及第二光源不限于此，例如也可以一个光源使用脉冲激光源，另一个使用参量振荡器。此外，在本实施方式的受激拉曼散射显微镜100中，如上所述，使由第一光源生成的第一光脉冲串的重复频率为由第二光源生成的第二光脉冲串的重复频率的二分之一。以下，在本实施方式中，设该第一光脉冲串的重复频率为f，此外，设第二光脉冲串的重复频率为2f。这是因为，通过这样设置，由第一光源生成的第一光脉冲串在与由第二光源生成的第二光脉冲串的二个中的一个同步的定时生成，所以与例如将由第一光源生成的第一光脉冲串的重复频率设为由第二光源生成的第二光脉冲串重复频率的三分之一或四分之一的情况相比，能够使引起受激拉曼散射效应的次数最多，能够以更高的精度取得试件的分子振动影像。但是，在本发明的受激拉曼散射显微镜中，使第一光脉冲串的重复频率为第二光脉冲串的重复频率的二分之一并不是必须的，通过设为三分之一或四分之一等，将第一光脉冲串的重复频率设为第二光脉冲串的重复频率的整数分之一，能够通过受激拉曼散射效应取得试件的分子振动影像。此外，在上述本实施方式中，说明了将2个光脉冲串中的重复频率较低的第一光脉冲串作为斯托克斯光使用的情况，但是本发明不限于此，也可以将重复频率较低的第一光脉冲串作为反斯托克斯光使用。被照射光学系统21的反射镜3改变了朝向的、由第二光源2生成的重复频率2f 的第二光脉冲串，通过照射光学系统21的半反射镜4，与由第一光源1生成的重复频率f的第一光脉冲串合波为同轴。合波后的光脉冲串通过照射光学系统21的第一物镜5，对试件 6聚光照射。另外，在本实施方式中，作为第一物镜5使用了倍率X40、开口数(NA)O. 6的物镜。这样，设具有第一光频率(第1种颜色)的第一光脉冲串的重复频率为f，设具有第二光频率(第2种颜色)的第二光脉冲串的重复频率为2f时，每l/2f时间，2色的脉冲的两者和2种颜色的脉冲的仅一方交替地出现。这时，第一光频率和第二光频率的频率差与测定试件6的被测定分子的分子振动数一致时，产生受激拉曼散射，仅在照射2色的光脉冲的两者时，在第二光脉冲串的激励光脉冲中产生频率f的强度调制。来自该试件6的散射光被聚光光学系统22的第二物镜7聚光。作为该第二物镜 7，在本实施方式中与第一物镜5同样，使用了倍率X40、开口数(NA)O. 6的物镜。由第二物镜7聚光的散射光中，通过聚光光学系统22的窄带滤光片8，仅使第二光脉冲串透过，由聚光光学系统22的聚光透镜9聚光。由聚光透镜9聚光的光被作为受光元件的光电二极管10进行光电转换并作为电信号输出。通过作为电路的锁定放大器11以锁定频率f对该光电二极管10的输出信号进行同步检波，从而能够仅检测通过受激拉曼散射产生的光。图2表示受激拉曼散射显微镜中的、锁定放大器的输出信号的例。在图2中，横轴表示第一光脉冲串和第二光脉冲串合波后的光的聚光焦点的位置，纵轴表示在该焦点位置处得到的、来自锁定放大器的输出信号的强度。另外，将从第二光脉冲串的第二光频率的值减去第一光脉冲串的第一光频率的值的频率差(Oas-COs)即拉曼位移(Raman shift)量设为:^470^1。在图2中的左侧，示出了作为试件仅放置了玻璃的情况的输出信号的推移，从图2 显然可知，焦点位于空气中的情况和焦点位于玻璃内的情况的输出信号不产生差。对此，图 2的右侧表示作为试件用玻璃夹着水的情况的输出信号，可知与焦点位于玻璃部分的情况相比，焦点位于存在水的部分时的输出信号电压变大。这表示，在玻璃内虽然不产生非共鸣信号，但是能够检测到水的OH振动模式引起的受激拉曼散射效应。在此，在图3中表示受激拉曼散射显微镜的通过受激拉曼散射效应得到的分子振动影像的例。图3(a)是将频率差(Qas-COs)即拉曼位移(Raman shift)量设为3023CHT1时的分子振动影像，仅聚苯乙烯白色发光，能够得到抑制了来自周围的水的信号的高对比度的像。 这时的扫描尺寸为纵 ο μ m、横10 μ m。图3(b)是用与图3(a)相同的试件，将频率差(《as_cos)即拉曼位移(Raman shift)量设为32^(3!^1时的分子振动影像，这种情况下，聚苯乙烯液滴的信号电平降低，同时OH振动引起的来自水的信号稍微出现，整体的对比度下降。图3(c)是将植物细胞(BY2)的CH振动模式可视化的图像。图3 (c)是对纵 40 μ m、横40 μ m的范围进行扫描后的二维的分子振动影像，拉曼位移(Raman shift)量为 3023cm-1.可以理解出，来自细胞的周围的水的信号被抑制，核和细胞壁明确地可视化。图3(d)是根据将图3(c)中示出的二维的分子振动影像在光轴方向上以4μπι间隔遍及40 μ m取得的结果得到的三维分子振动影像。根据本实施方式的受激拉曼散射显微镜，通过这样使照射的光束的焦点的位置向光轴方向位移而得到多个二维的分子振动影像，能够得到测定试件的分子结构的三维的分子振动影像。此外，在本实施方式的受激拉曼散射显微镜中，能够实时地将分子状态作为分子振动影像来检测，所以能够将生物体的细胞的变化状况作为运动图像来掌握。(第二实施方式)接着，说明作为本发明的第二实施方式的使用了受激拉曼散射(SRS)效应的光学显微镜，使2个光脉冲串的定时高精度地整合，能够以较高的S/N比取得分子振动影像的光学显微镜的结构例。图4是表示本发明的第二实施方式的光学显微镜200的概略结构的框图。如图4所示，本实施方式的使用了受激拉曼散射效应的光学显微镜200具备作为生成第一光脉冲串的第一光源的光纤维激光器101，以及作为生成第二光脉冲串的第二光源的钛蓝宝石激光器102。此外，本实施方式的光学显微镜200具有时差检测光学系统，检测第一光脉冲串的激光和第二光脉冲串的激光的时差，这一点与使用上述图1说明的第一实施方式的光学显微镜100不同。从作为第二光源的钛蓝宝石激光器102射出的第二光脉冲串即超短光脉冲激光束，通过半反射镜104分离为用于得到测定对象的试件123的分子振动影像的测定光131、 和用于检测与从第一光源射出的第一光脉冲串即超短光脉冲激光束的时差的时差检测光 132。另外，检测时差时，为了调整导入时差检测光学系统的时差检测光132和为了得到试件123的分子振动影像而对试件照射的测定光131的时间差，反射镜105和反射镜106的位置能够在图中箭头P所示的方向上调整，以能够调整测定光131的光路长度。从作为第一光源的光纤维激光器101射出的作为第一光脉冲串的超短光脉冲激光束也与第二光脉冲串同样，通过半反射镜111分离为用于得到试件123的分子振动影像的测定光141和用于检测与从第二光源射出的第二光脉冲串的时差的时差检测光142。从光纤维激光器101射出的第一光脉冲串的时差检测光142和从钛蓝宝石激光器 102射出的第二光脉冲串的时差检测光132由分色镜115合波为同轴，经由透镜117聚光照射在光电二极管118上。作为该光电二极管118，为了检测合波后的激光束的双光子吸收， 优选使用例如无近红外区域中的光吸收、仅有可视域的吸收、此外高频特性优越的GaAsP 光电二极管。另外，在本实施方式中，透镜117和光电二极管118构成时差检测光学系统， 所述透镜117将第一光脉冲串的时差检测光142和第二光脉冲串的时差检测光132聚光照射，所述光电二极管118检测通过照射的2个激光产生的双光子吸收电流。另一方面，从光纤维激光器101射出的第一光脉冲串的测定光141和从钛蓝宝石激光器102射出的第二光脉冲串的测定光131也由半反射镜115合波为同轴，由束扩张器 121扩大了束径后，入射到第一物镜122的光瞳整体，并由该物镜聚光并对测定对象的试件 123照射。来自试件123的散射光经由第二物镜IM和窄带滤光片125，被作为受光元件的光电二极管126转换为电信号，由锁定放大器127对光电二极管126的输出信号进行同步检波。在本实施方式的光学显微镜200中，由光纤维激光器101生成的第一光脉冲串的激光是斯托克斯光(《s)，将中心波长设定为1030nm左右的合适的值，将脉冲宽度设定为 300fs，将重复频率设定为38MHz。此外，由钛蓝宝石激光器102生成的第二光脉冲串的激光是反斯托克斯光(《AS)，中心波长为780nm左右的合适的值，脉冲宽度为300fs，重复频率为 76MHz。与第一实施方式的光学显微镜同样，结合测定对象试件对第一光脉冲串及第二光脉冲串的波长进行合适的调整，以使其光频率差与测定对象试件的分子振动频率一致。在本实施方式的光学显微镜200中，将钛蓝宝石激光器设为生成重复频率较高的第二光脉冲串的激光的第二光源的理由是，将钛蓝宝石激光器的重复频率较低地设定比光纤维激光器困难。因此，这不是本发明的必须的要件，可以根据设定的重复频率来适当地作为第一光源使用钛蓝宝石激光器，作为第二光源使用光纤维激光器。此外，也可以将第一光源、第二光源的双方作为光纤维激光器。另外，由第一光源生成的第一光脉冲串的重复频率不必须是由第二光源生成的第二光脉冲串的重复频率的二分之一，只要是整数分之一即可，2个光脉冲串中，任何一个作为斯托克斯光及反斯托克斯光使用都可以，这与上述第一实施方式的受激拉曼散射显微镜 100的情况是同样的。进而，光学部件的规格等也可以与第一实施方式的受激拉曼散射显微镜100同样，例如作为第一物镜122及第二物镜124，可以使用倍率X40、开口数(NA)O. 6的物镜。此夕卜，如果使用倍率X 100、NAl. 4的物镜，可以得到更高的空间分辨率。
在图4 中，103，105，106，107，108，109，110，112，113，114，116，120 都表示反射镜。
使用了这些反射镜的第一及第二超短光脉冲激光束光的具体的路径当然可以进行适当变更。图5是表示本实施方式的光学显微镜200中使用的光纤维激光器101的具体的结构例的框图。如图5所示，在本实施方式的光学显微镜200中作为第一光源使用的光纤维激光器101由掺镱纤维151，多个波长板152、偏振束分离器(splitter) 153、分散补偿器154、可变延迟线155、相位调制器156、隔离器(isolator) 157构成。该光纤维激光器101的结构是在一般的模式同步光纤维激光器的谐振器内插入了作为光路长度转换机构的可变延迟线巧5及相位调制器156。掺镱纤维151将波长1. 03 μ m的光脉冲放大。多个波长板152调节掺镱纤维151 的入射光及射出光的偏振。偏振束分离器153将光纤维激光器101内部的光脉冲的一部分取出并作为射出光158，同时进行基于掺镱纤维151内的非线性偏振波旋转效应的模式同步动作。分散补偿器1 是为了调节光纤维激光器101内的群速度分散而插入的。可变延迟线155和相位调制器156调节激光器谐振器的光路长度，是为了控制重复频率而插入的。可变延迟线155能够机械地调节光路长度。此外，相位调制器156是使用了电光学结晶的导波路型器件，能够通过施加的电压改变结晶的折射率，从而调节光路长度。相位调制器156能够调节的最大的光路长度为数微米之�。怯捎诓恍枰档亩鳎阅芄灰訫Hz以上的高速性来控制光路长度。隔离器157规定谐振器内的光脉冲的行进方向。在这种结构的光纤维激光器101内，通过模式同步动作生成光脉冲并回转，从而以依存于激光器谐振器内的光路长度的时间间隔输出光脉冲，能够得到控制了重复频率的光脉冲串。图4所示的入射了合波为同轴的第一光脉冲串的时差检测光142和第二光脉冲串的时差检测光132的、作为光电二极管118的双光子吸收电流的光电流，通过例如300 Ω的负载电阻作为电压值来检测，从而能够以IMHz以上的频带来检测。这时，为了控制检测到的信号中包含的热噪音等晃动的影响，需要得到充分大的双光子吸收电流。为此，将2个脉冲串合波为同轴，将开口数较大的透镜、例如开口数0. 55、倍率50倍的透镜加入光电二极管中是有效的。将表示该检测到的时差的电压信号经由环路滤波器(loop filter) 119导入光纤维激光器101的谐振器内的可变延迟线155和相位调制器156。然后，将可变延迟线155的环路频带控制为IHz左右，将相位调制器156的环路(loop)频带控制为140kHz程度，以使上述电压信号成为一定。另外，在图5所示的本实施方式的光学显微镜200中使用的光纤维激光器中，作为光路长度调制机构使用了可变延迟线巧5和相位调制器156这2个，但是在本发明中这不是必须的事项，只要是纤维拉伸器等、能使光纤维激光器谐振器内的光路长度变化的部件， 就不排除将其作为光路长度调制机构使用。但是，为了将环路频带设定为IOOkHz以上，需要使用高速的光路长度控制机构。例如，作为光路长度调制机构仅使用压电元件的情况下， 将环路频带提高到IkHz以上较为困难。由于光纤维激光器输出的光脉冲串本来具有较大的抖动(jitter)，所以使用压电元件这样的低速的元件进行定时控制的情况下，残留2微微(pico)秒左右的大小的抖动。图6表示本实施方式的光学显微镜200中的、用于检测第一及第二激光束脉冲的同步偏移的时差检测光学系统中使用的来自光电二极管118的输出信号的状态。在图6中，纵轴表示基于双光子吸收的光电二极管118的输出电压值，横轴表示2 个激光束脉冲的定时偏移量。2个脉冲的定时一致时能够得到最高的电压，此外，若定时偏移脉冲时间宽度以上，则能够看到电压下降的情况。因此，使用双光子吸收能够进行高精度的定时检测。在本实施方式的光学显微镜200中，不是在峰值位置即图6所示的定时偏移量=0 处检测2色的激光束脉冲的定时的偏移，而是在具有约7V/ps的倾斜的图6中以“A”表示的部分来检测，从而能够根据来自光电二极管118的输出电压值的变化，直接检测由光纤维激光器101生成的第一光脉冲串的激光束和第二光脉冲串的激光束的时差，用于光纤维激光器的重复频率控制。这样，在本实施方式的光学显微镜200中，能够回避超短光脉冲激光束的抖动的影响，以较高的精度使2色的超短光脉冲激光束的定时同步。此外，在本实施方式的光学显微镜中，较宽地取得双光子吸收电流和重复频率控制的频带，并使环路频带变宽，从而使2个光脉冲串的同步及其容易。这可以如下理解。双光子吸收电流变化只在2个光脉冲串的定时接近到脉冲时间ΔΤ左右时才发生。在此，考虑光脉冲串未同步的、即第一光脉冲串的重复频率f的2倍和第二光脉冲串的重复频率2f之间存在Af的差的情况。实际上，未控制时的激光器的重复频率具有IHz的次序(order)的晃动，这可以认为是Af与时间一起在约IHz以内变化。这时，以l/Af的时间间隔使2个脉冲串的定时一致，伴随与此，双光子吸收电流变化。但是，该双光子吸收电流变化产生的时间是2个脉冲的定时重叠的时间，S卩ΔΤ/ TAf0为了实现同步，需要在该时间内进行定时控制。在此，如果设定时控制频率频带为B，则定时同步所需的时间以约1/B来表示，所以需要不等式1/B < ΔΤ/ΤΔ ·、即Af < ΒΔΤ/Τ成立。在此，如果设AT为300fs、T为 12ns、B为140kHz，则得到Af <3. 5Hz。因此，通过这样增大定时控制频率频带B，即使存在IHz次序的晃动，也能够达成基于双光子吸收的同步。另一方面，在B较小的情况下，对于Δ f的要求条件变严格，使未控制时的激光器同步实际上是不可能的。这种情况下，需要并用其他同步方法来进行低精度的同步，在此基础上进行基于双光子吸收的同步，系统变得复杂化。图7是表示本实施方式的光学显微镜200中的2色的超短光脉冲激光束的同步状态的图。如图7所示，在本实施方式的光学显微镜200中，能够使作为2色的超短光脉冲激光束的偏差得到的定时抖动为约6. Ofs0 一般来说，使用SRS显微镜来观察分子振动影像的情况下，认为优选使定时抖动为照射光脉冲的时间宽度的10分之1以下，相对于此，在本实施方式的光学显微镜200中，定时抖动的大小实现了照射光脉冲的时间宽度的100分之 1左右。如以上说明，在本实施方式的光学显微镜200中，不会像用高速光检测器检测时差的情况那样使测定系复杂化，能够通过简单的结构检测2光子吸收，并通过相位调制器对光纤维激光器的重复频率进行高速控制，从而得到抑制了定时抖动的影响的高感度且高 S/N比的分子振动影像。另外，在上述本发明的第二实施方式中，在时差检测光学系统中说明了检测由第一光脉冲串的激光和第二光脉冲串的激光产生的双光子吸收电流的情况，但这并不限定本发明的光学显微镜的时差检测光学系统。例如，作为时差检测光学系统，也可以使用和频发生来检测2色的超短光脉冲激光束的时差。以上，根据本发明的光学显微镜，对试件聚光照射将一方的光脉冲串的重复频率设为另一方的整数分之一的2色(光频率，ω5)的光脉冲串时，通过2色的频率差与聚光点的试件的分子振动频率一致时产生的受激拉曼散射现象，检测重复频率较高的激励光脉冲的强度调制成分。该受激拉曼散射不受到电子的非线性性的影响，所以由本显微镜得到的输出信号中不存在背景噪声信号，能够得到高对比度的分子振动影像。而且，在本显微镜中，通过将2色的光脉冲串的重复频率设为一方为另一方的整数分之一，不需要以往的受激拉曼散射显微镜所使用的对一方的光脉冲串赋予强度调制的声光元件等，能够使光学显微镜的系统简单化，并且能够对激光器的强度噪音降低或运动图像中的影像取得进行更有利的照射束的高频调制。其结果，能够实现系统更简单、信噪的比率即S/N比较高、且能够得到高品质的运动图像的光学显微镜。在此，在受激拉曼散射显微镜中，说明锁定频率和得到的分子振动影像的关系。图8及图9都是由受激拉曼散射显微镜得到的试件的分子振动影像。图8中作为试件使用了水中的聚苯乙烯液滴。图8(a)是锁定频率为2MHz时的分子振动影像，图8(b)是锁定频率为IOMHz时的分子振动影像。另外，得到图8(a)的分子振动影像时的光功率为5mW，为了得到分子振动影像所需要的累计时间为50ms。此外，得到图 8(b)的分子振动影像时的光功率为0. 6mW，为了得到分子振动影像所需的累计时间为ans。锁定频率较低的图8 (a)的分子振动影像明显比锁定频率较高的图8(b)的分子振动影像析像度低，得到的影像图像的周围�：旱蔚闹本督洗蟮乜醇�。此外，如果锁定频率变高，则为了得到分子振动影像所需的光束照射功率变�。怨馐丈湎低车母旱１湫�。 进而，可知为了得到分子振动影像所需的时间也变短，更加适于运动图像的取得。图9中作为试件使用了植物细胞(BY2)。图9(a)是锁定频率为2MHz时的分子振动影像，图9(b)是锁定频率为IOMHz时的分子振动影像。得到图9(a)的分子振动影像时的光功率为4. 5mW，为了得到分子振动影像所需的累计时间为100ms，得到图9(b)的分子振动影像时的光功率为lmW，为了得到分子振动影像所需的累计时间为:3ms。与图8同样，从图9(a)及图9(b)的分子振动影像也可以知道，锁定频率越高，得到的分子振动影像的信噪比越高，此外，图像的对比度也良好，能够掌握植物细胞的详细的状况。此外，根据用于得到图9(a)及图9(b)的数据可知，锁定频率越高，为了得到分子振动影像的光功率和累计时间越少。由以上可知，在作为本实施方式示出的受激拉曼散射显微镜中，为了得到一定以上的析像度的分子振动影像，优选锁定频率为IOMHz以上。为了使锁定频率为10MHz，将重复频率较低的光脉冲串的重复频率设为10MHz、将重复频率较高的光脉冲串的重复频率设为20MHz即可。此外，如果将锁定频率设为IOMHz以上，则为了得到分子振动影像所需的光功率为ImW左右即可，如果是这种程度的光功率，则不会对束照射系统施加较大负担。进而，如果将锁定频率设为IOMHz以上，则为了得到分子振动影像的累计时间为数ms左右，所以在考虑运动图像的取得方面也是优选的条件。接着，使用图10说明由作为本实施方式示出的受激拉曼散射显微镜得到的锁定信号中含有的噪音电平和由作为影像受光部的光电二极管得到的输出电流的大小之间的关系。图10表示对作为上述第二实施方式示出的光学显微镜200中的、锁定信号中的噪音成分进行了测定的结果。图10中的“黑点”是测定结果数据的图示。在图4所示的光学显微镜200中，在使钛蓝宝石激光器102和光纤维激光器101 同步的状态下，仅将钛蓝宝石激光导入光电二极管126。这时，纤维激光被滤光片125除去。 将光电二极管126的输出信号输入锁定放大器127，将从光纤维激光器101得到的重复频率 38MHz的电信号作为锁定放大器127的参照信号使用。然后，一边使输入到光电二极管126中的光的强度变化，一边测定了锁定放大器 127的输出噪音的结果为图10中的图示。另外，锁定放大器127的累计时间为0. Ims0在图10中，横轴表示从光电二极管1 得到的光电流的直流成分。此外，用点划线表示光电二极管126的受光电路的噪音电平，用实线b表示根据光电流计算的光电二极管126的散粒噪音。根据图10可知，在图10中左侧所示的光电流值小于KT1mA的区域中，电路的噪音是支配性的，但是随着光电流变大，噪音增大。在此，已知在钛蓝宝石激光具有散粒噪音以上的过剩噪音的情况下，锁定信号的噪音电压与光电流成正比，此外，钛蓝宝石激光具有散粒噪音界限的低噪音性的情况下，锁定信号的噪音电压与光电流的平方根成正比。在实验中，锁定信号的噪音电压在光电流值大于0.2mA的区域中与光电流的平方根成正比，示出了能够得到散粒噪音界限的低噪音性。另外，在将光电流值大于0.2mA的区域的图示连结的实线c和表示散粒噪音的理论值的实线b之间，存在图中以y表示的约 1. 6dB的差，推测为这是光检测电路中含有的带通滤光片电路的损失引起的。此外，通过钛蓝宝石激光器和光参量振荡器得到重复频率76MHz的光脉冲，对后者使用光调制器进行10. 7MHz的光调制，将进行了锁定检测的系统中的锁定信号的噪音换算为本次实验条件的结果在图中以X (B)表示。根据图10，通过与以往的噪音电平B进行比较，将锁定频率高频化为38MHz，能够将噪音电平如图中X所示抑制为12dB以上。根据该结果也确认了锁定频率的高频化带来的低噪音化的有效性。根据图10的实验数据可知，通过将锁定频率设为38MHz，能够将锁定信号的噪音电平降低到受光元件即光电二极管126的散粒噪音电平为止，所以通过将锁定频率设为38MHz以上，能够取得噪音电平极小的分子振动影像。另外，如根据实际取得的分子振动影像和关于噪音电平的实验数据所确认的，锁定频率越高，则能够在越短的时间内取得更鲜明的分子振动影像。这对运动图像中的分子振动影像即运动图像的取得尤为有利，但是对于由光电二极管取得分子振动影像，存在距离对试样照射的光功率的平均电平的界限，如果锁定频率过高，则可能引起投入的光能带来的试样的损伤。因此，在锁定频率的设定时，在不发生试样的损伤的限度内，优选在考察了受光电路系统的能力基础上，适当设定上限值。
另外，在得到图10的数据时，为了降低受光电路的噪音电平(图10中的点线a)， 作为光电二极管126的受光电路使用了图11所示的电路。如图11所示，作为降低噪音电平的受光电路，为了抑制光电二极管PD的寄生电容引起的频率特性的下降，与光电二极管PD并联连接有电感L，并且将与电感L并联连接的负载电阻R的值设定为比高频电路中通常使用的负载电阻值50 Ω高。作为用于取得图10的数据的具体电路的一例，设光电二极管PD的寄生电容为 20pF，电感L为820nH，负载电阻R的电阻值为500 Ω。如本实施方式的光学显微镜200，受激拉曼散射显微镜中使用的光电二极管PD的受光面积较大，寄生电容容易变大，所以通过对电路施加上述那样的对策，能够降低噪音电平。另外，作为这时的负载电阻R的值，认为优选为100Ω以上。因此，优选为一边考虑光电二极管PD的寄生电容的数值和使用的电感 L的值，一边将负载电阻的值设定为100欧姆以上的合适的值。此外，作为光电二极管PD的受光电路，通过使用图11所示的电路来抑制光电二极管PD的频率特性的下降的效果与对试件照射的光脉冲串的生成过程无关。因此，图11所示的光电二极管PD的受光电路不仅能应用于作为上述本发明的实施方式示出的、由不同的光源生成第一重复频率的光脉冲串和第二重复频率的光脉冲串的光学显微镜，也能够应用于非专利文献1及非专利文献2所示的、对一方的光脉冲串进行调制而生成另一方的光脉冲串的以往的光学显微镜，能够实现良好的效果。如以上讨论可以理解，在本实施方式的光学显微镜中，在得到更高的析像度的分子振动影像的基础上，对提高锁定频率极为有利。根据本发明的光学显微镜，通过一方具有另一方的整数分之一的重复频率的2个光源生成2色的光脉冲串的重复频率，能够容易地对应锁定频率的高频化。因此，本发明的光学显微镜与必需以声光元件为首的调制器的、以往的受激拉曼散射显微镜相比，能够使光学显微镜的系统简单化，且能够降低激光器的强度噪音，能够得到S/N比较高的分子振动影像，进而运动图像的取得更加有利，在实用方面具有优良的特征。以上，在上述实施方式中，作为本发明的光学显微镜说明了检测受激拉曼散射的装置，能够使用本发明的结构进行检测的不限于上述的受激拉曼散射。例如，其他还可以选择光脉冲的波长，从而使2色的光脉冲的和频率即《as+cos与试件的2光子吸收频率一致， 从而得到高对比度的2光子吸收像。此外，在上述实施方式中，将本发明的应用对象限定为光学显微镜进行了说明。但是，在生成具有第二光脉冲串的重复频率的整数分之1的重复频率的第一光脉冲串时，与对相同重复频率的2个光脉冲串中的一方进行调制而使重复频率为整数分之1的方法相比，根据使用一方的生成的光脉冲串的重复频率为另一方的生成的光脉冲串的重复频率的整数分之1的2个光源的本申请发明的方法，能够以简单的机构进行更高的频率下的锁定检测。因此，本发明的技术思想不限于对光学显微镜的应用，通过进行较高的频率下的锁定检测，降低测定结果的噪音成分，从而得到S/N比较高的测定结果这一点，能够应用于各种光学计测而得到良好的结果。另外，作为应用这样本发明的技术思想的光学计测，可以想到例如泵探针计测等。工业实用性
如以上说明，本发明的光学显微镜作为能够将生物体细胞等图像影像化的光学显微镜，可以期待广泛的领域的用途。此外，本发明可以展开应用在各种光学计测中。
权利要求
1.一种光学显微镜，对试件照射第一光脉冲串和第二光脉冲串，所述第一光脉冲串由第一光源生成，具有第一光频率，所述第二光脉冲串与所述第一光脉冲串在时间上同步，由第二光源生成，具有第二光频率，所述光学显微镜检测来自所述试件的散射光，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率是所述第二光源生成的光脉冲串的重复频率的整数分之一。
2.如权利要求1所述的光学显微镜，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率是所述第二光源生成的光脉冲串的重复频率的二分之一。
3.如权利要求1或2所述的光学显微镜，具备 所述第一光源；所述第二光源；照射光学系统，对所述试件同时照射所述第一光脉冲串和所述第二光脉冲串； 聚光光学系统，将来自所述试件的散射光中的所述第一光脉冲串除去，并将其他光脉冲串聚光；受光元件，将由所述聚光光学系统聚光的散射光转换为电信号并输出；以及对所述受光元件的输出信号进行同步检波的电路。
4.如权利要求3所述的光学显微镜，所述第一光源及所述第二光源的至少某一方是光纤维激光器， 所述光学显微镜具备时差检测光学系统，检测所述第一光脉冲串和所述第二光脉冲串的时差，基于来自所述时差检测光学系统的输出信号，对配置于所述光纤维激光器的谐振器内的光路长度调制机构进行驱动，使所述第一光脉冲串的定时和所述第二光脉冲串的定时整合。
5.如权利要求4所述的光学显微镜，在所述时差检测光学系统中，检测将所述第一光脉冲串的激光和所述第二光脉冲串的激光聚光照射而产生的双光子吸收电流。
6.如权利要求4或5所述的光学显微镜，所述光路长度调制机构是可变延迟线及相位调制器。
7.如权利要求1 6中任何一项所述的光学显微镜， 所述第一光脉冲串的重复频率为IOMHz以上。
8.如权利要求7所述的光学显微镜，所述第一光脉冲串的重复频率为38MHz以上。
9.一种光学显微镜，对试件照射第一光脉冲串和第二光脉冲串，所述第一光脉冲串具有第一光频率，所述第二光脉冲串与所述第一光脉冲串在时间上同步，并且具有第二光频率，通过光电二极管检测来自所述试件的散射光，取得来自所述光电二极管的输出信号的光电二极管驱动电路具有与所述光电二极管并联连接的电感，以及与所述电感并联连接的电阻值为100 Ω以上的负载电阻。
10. 一种光学计测，使用从第一光源生成的第一光脉冲串和从第二光源生成的第二光脉冲串进行锁定检测，所述第一光源生成的光脉冲串的重复频率是所述第二光源生成的光脉冲串的重复频率的整数分之一。
全文摘要
得到一种光学显微镜，抑制光源系统的复杂化，即使在为了降低激光的强度噪音的影响而提高了调制频率的情况下，也能够容易地对应。对试件(6)照射第一光脉冲串和第二光脉冲串，所述第一光脉冲串具有第一光频率，所述第二光脉冲串与所述第一光脉冲串在时间上同步，并且具有第二光频率，所述光学显微镜(100)检测来自所述试件(6)的散射光，所述第一光学生成的光脉冲串的重复频率是所述第二光源生成的光脉冲串的重复频率的整数分之一。
文档编号G01N21/65GK102575992SQ201080024399
公开日2012年7月11日 申请日期2010年6月2日 优先权日2009年6月3日
发明者伊东一良, 住村和彦, 北川雄真, 小关泰之, 岳文宏, 梶山慎一郎, 福井希一, 西泽典彦 申请人:佳能株式会社
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