专利名称：一种检测水样中汞离子浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水样中汞离子浓度的方法。
背景技术：
石英晶体微天平OiCM)是一种利用石英晶体谐振器的压电特性制成的传感器。它将石英晶振电极表面质量变化转化为石英晶体振荡电路输出电信号的频率变化，进而通过计算机等其他辅助设备获得高精度的数据。Sauerbrey方程是压电质量效应传感的主要理论依据，其发展使石英晶体微天平作为质量传感器得到广泛应用，检测灵敏度可以达到ng 级。DNA寡核苷酸作为探针特异性识别汞离子的方法在很多领域取得了广泛的应用。 研究表明，胸腺嘧啶(T)在汞离子存在下可以通过与汞离子的配位作用偶联，从而引起含有T-T错配的DNA单链的相互杂交成双链。碱基T与Hg2+的特异性结合作用被广泛用于研究各种新型Hg2+传感检测方法，如颜色变化、荧光、电化学方法等。这些方法均具有很高的选择性，但仍需要进行标记，或者借助荧光仪器、紫外-可见分光光度仪等昂贵笨重的仪器，检测成本仍然较高。纳米金颗粒是尺寸分布在纳米数量级的金颗粒，它由于纳米效应而具有很多特殊性质，常用于检测DNA、蛋白质等。在QCM检测中，纳米金颗粒由于其密度大稳定性高便于修饰等特点，广泛用QCM传感器的信号放大，在QCM上DNA、蛋白质等检测中得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测水样中汞离子浓度的方法。本发明提供的检测水样中汞离子浓度的方法，包括如下步骤(1)将待测水样与溶液B混合后与交联于QCM石英片的金电极上的单链DNA探针 A进行杂交，记录QCM石英片的读数a ；所述溶液B为含有单链DNA探针B的溶液；所述QCM 石英片来自于气相型、采用金电极的石英晶体微天平；(2)将步骤(1)杂交得到的QCM石英片与交联于纳米金颗粒上的单链DNA探针C 进行杂交，记录QCM石英片的读数b ；(3)计算QCM石英片的频率响应；QCM石英片的频率响应=(a-b)，单位为Hz ；(4)根据QCM石英片的频率响应得出待测溶液中的汞离子浓度； 所述单链DNA探针A包括一个功能区段，即功能区段A ；所述功能区段A的长度占单链DNA探针A长度的60%以上；所述功能区段A的长度为6-12bp (如8_10bp，如9bp)； 所述功能区段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；
所述单链DNA探针B包括两个功能区段，即功能区段Bl和功能区段B2 ；所述功能区段Bl的长度和所述功能区段B2的长度之和占单链DNA探针B长度的60%以上；所述功能区Bl中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；所述功能区段A与所述功能区段Bl遵循碱基互补配对原则甲；所述碱基互补配对原则甲中，核苷酸T与核苷酸T互补配对，核苷酸G与核苷酸C互补配对；所述单链DNA探针C包括一个功能区段，即功能区段C ；所述功能区段C的长度占单链DNA探针C长度的60%以上；所述单链DNA探针C的长度为9_20bp (如9_16bp，如 ll-Mbp，如13bp)；所述功能区段C与所述功能区段B2遵循碱基互补配对原则乙；所述碱基互补配对原则乙中，核苷酸A与核苷酸T互补配对，核苷酸G与核苷酸C互补配对。所述单链DNA探针A的核苷酸序列可如序列表的序列1所示，所述单链DNA探针B 的核苷酸序列可如序列表的序列2所示，所述单链DNA探针C的核苷酸序列可如序列表的序列3所示。所述单链DNA探针A的核苷酸序列可如序列表的序列4所示，所述单链DNA探针B 的核苷酸序列可如序列表的序列5所示，所述单链DNA探针C的核苷酸序列可如序列表的序列6所示。所述单链DNA探针A可通过末端的巯基交联于所述QCM石英片的金电极上。所述单链DNA探针C可通过末端的巯基交联于所述纳米金颗粒上。所述单链DNA探针A可采用任何现有常规方法交联于所述QCM石英片的金电极， 具体可通过如下方法交联于所述QCM石英片的金电极在所述QCM石英片表面的金电极上滴加10 μ L溶液�。匠兀磺逑锤稍锖蠹�50 μ L ImM 6-巯基-1-己醇的乙醇溶液，吸附 Ih ；清洗干燥后得到交联有所述单链DNA探针A的QCM石英片；所述溶液A为含有单链DNA 探针A的溶液。所述单链DNA探针C可采用任何现有常规方法交联于所述纳米金颗粒，具体可通过如下方法交联于所述纳米金颗粒上取200 μ L所述纳米金颗粒的溶胶加入50 μ L溶液C，孵育Mh ；然后加入250 μ L PBS缓冲液静置48h，离心并洗涤沉淀；最后沉淀分散到 250 μ L PBS缓冲液，得到交联有单链DNA探针C的纳米金颗粒；所述溶液C为含有所述单链DNA探针C的溶液。所述纳米金颗粒的粒径优选为12-65nm。所述PBS缓冲液优选为如下缓冲液pH7. 4，由Nei2HPO4、NaH2PO4、NaClO4和水组成， Na2HPO4的浓度为10mM，NaH2PO4的浓度为10mM，NaClO4的浓度为0. 1M。 所述溶液A可由所述单链DNA探针A和PBS缓冲液组成，所述单链DNA探针A的浓度优选为20ηΜ-20 μ M (最优选为2 μ Μ)。所述溶液B由可所述单链DNA探针B和PBS缓冲液组成，所述单链DNA探针B的浓度优选为20 μ Μ。所述溶液C可由所述单链DNA探针C 和PBS缓冲液组成，所述单链DNA探针C的浓度优选为20 μ Μ。所述溶液A和/或所述溶液B和/或所述溶液C中，所述PBS缓冲液优选为如下缓冲液ρΗ7· 4，由 Na2HP04、NaH2PO4, NaClO4 和水组成，Na2HPO4 的浓度为 10mM，NaH2PO4 的浓度为IOmM, NaClO4的浓度为0. IM0所述待测溶液中汞离子的浓度可为ΙηΜ-20 μ Μ(线性最好，如果检测后浓度在本浓度以上，可以进行稀释后再次检测)。步骤(1)中，所述杂交的条件可为37°C池。步骤O)中，所述杂交的条件可为 37 0C 2h。本发明还保护一种检测水中汞离子浓度的试剂盒，包括如下组分纳米金颗粒，由单链DNA探针A、单链DNA探针B和单链DNA探针C组成的探针组合物和气相型、采用金电极的石英晶体微天平；所述单链DNA探针A包括一个功能区段，功能区段A ；所述功能区段A的长度占单链DNA探针A长度的60 %以上；所述功能区段A的长度为6-12bp (如8_10bp，如9bp)；所述功能区段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；所述单链DNA探针B包括两个功能区段，功能区段Bl和功能区段B2 ；所述功能区段Bl的长度和所述功能区段B2的长度之和占单链DNA探针B长度的60%以上；所述功能区Bl中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；所述功能区段A与所述功能区段Bl遵循碱基互补配对原则甲；所述碱基互补配对原则甲中，核苷酸T与核苷酸T互补配对，核苷酸G与核苷酸C互补配对；所述单链DNA探针C包括一个功能区段，功能区段C ；所述功能区段C的长度占单链DNA探针C长度的60 %以上；所述单链DNA探针C的长度为9_20bp (如9_16bp，如 ll-Mbp，如l!3bp)；所述功能区段C与所述功能区段B2遵循碱基互补配对原则乙；所述碱基互补配对原则乙中，核苷酸A与核苷酸T互补配对，核苷酸G与核苷酸C互补配对。所述纳米金颗粒的粒径优选为12-65nm。所述单链DNA探针A的核苷酸序列可如序列表的序列1所示，所述单链DNA探针B 的核苷酸序列可如序列表的序列2所示，所述单链DNA探针C的核苷酸序列可如序列表的序列3所示。 所述单链DNA探针A的核苷酸序列可如序列表的序列4所示，所述单链DNA探针B 的核苷酸序列可如序列表的序列5所示，所述单链DNA探针C的核苷酸序列可如序列表的序列6所示。 本发明提供的方法的原理(参见图1) :QCM石英片的金电极修饰单链DNA探针A， 单链DNA探针A和单链DNA探针B之间含有T-T错配，二者不能杂交形成双链DNA ；当待测样品中没有汞离子时，纳米金颗粒不会吸附到QCM石英片表面，故没有明显的响应信号；当待测样品中含有汞离子时，由于汞离子会引起T-T配对(T-Hg2+-T)，单链DNA探针A与单链 DNA探针B杂交形成双链DNA，引起很小的信号响应，此时加入单链DNA探针C修饰的纳米金颗粒时，通过单链DNA探针B与单链DNA探针C的杂交，纳米金颗粒最终固定到QCM石英片表面，利用金颗粒的信号放大作用，引起明显的信号响应，从而特异性的检测汞离子。本发明由于采用三段寡核苷酸探针，故称为夹心法，夹心法相对于两段寡核苷酸探针检测的方法，具有条件调控容易，检测响应灵敏，立体位阻小，检测限低等特点。本发明中，借助DNA 寡核苷酸作为探针，利用三段寡核苷酸序列的夹心法原理将纳米金颗粒吸附在石英晶体微天平OiCM)的QCM石英片上，利用纳米金颗粒的放大作用扩大汞离子在QCM石英片上的响应信号，从而实现高灵敏高选择性的检测汞离子。借助金纳米颗粒的信号放大作用，本检测方法能获得InM的汞离子检测敏感度，符合美国环保署的饮用水检测要求，同时也符合中国国家饮水标准中对饮用水中汞离子检测的要求，其他金属离子(Ni2+，Mg2+，Co2+，Cr3+，Pb2+, Cd2+，Mn2+，Ba2+)对汞离子的检测没有显著的干扰。本发明提供的方法可用于检测饮用水中汞离子的浓度，需要的检测样品量非常少(1微升)，操作简单，仪器便携，成本较低，适合推
图1为本发明提供的方法检测汞离子的流程示意图。图2为实施例1中金颗粒溶胶的扫描电镜照片。图3为实施例1中QCM石英片的频率响应结果(不同探针probe-Ι浓度)。图4为实施例2中QCM石英片的频率响应结果(不同汞离子浓度)。图5为实施例2中完成检测的QCM石英片的扫描电镜照片(汞离子存在下金颗粒在QCM金片石英片表面的吸附)。图6为实施例3中金颗粒溶胶的扫描电镜照片。图7为实施例3中QCM石英片的频率响应结果(不同汞离子浓度)。图8为实施例4中QCM石英片的频率响应结果(不同金属离子)。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。石英晶体微天平购自Chenhua CO.，LTD, Sianghai，为气相型，采用金电极，AT切割， 直径 1. 2cm，厚度为 0. 5mm。QCM 测量仪为 Topward High Frequency Counter 1220 型，购自 Topward Electric Instrument. Co.，LTD, Taiwan0 本发明中的 PBS 缓冲液均为如下缓冲液ρΗ7· 4，由 Na2HP04、NaH2PO4, NaClO4 和水组成，Na2HPO4 的浓度为 10mM，NaH2PO4 的浓度为10mM，NaClO4的浓度为0. 1M。实验中QCM石英片在反应过程中均存放于密闭的容器内并置于恒温干燥箱中恒温。QCM频率响应均为频率的减小。汞离子母液汞离子母液由溶质和溶剂组成；溶剂为水，溶质及其浓度如下 Hg(NO3)2，浓度0. Olmol/L，通过添加稀硝酸保持pH为1 2。溶液A由探针probe-Ι和PBS缓冲液组成；溶液Al中探针probe-I的浓度为20nM， 溶液A2中探针probe-Ι的浓度为200nM，溶液A3中探针probe-Ι的浓度为2 μ M，溶液Α4 中探针probe-Ι的浓度为20 μ Μ。探针Probe-I、探针 Probe-2 和探针 Probe-3 如下探针Probe-I (序列表的序列 1) :5，-HS-TTCTTTCTT-3，(单链 DNA)；探针Probe-2 (序列表的序列 2、:5，-CGACTGGACTTGTTTGTT-3，(单链 DNA)；探针Probe-3 (序列表的序列；3) :5，-GTCCAGTCGTTTT-SH-3，(单链 DNA)。探针Probe-4、探针 Probe-5 和探针 Probe-6 如下探针ftx)be-4(序列表的序列 4) :5，-HS-TTCTTTCTT-3，(单链 DNA)；探针Probe-5 (序列表的序列幻5，-CGTACCGGACTTGTTTGTT-3，(单链 DNA)；探针Probe-6 (序列表的序列 6) :5，-GTCCGGTACGTTTT-SH-3，(单链 DNA)。实施例1、应用本发明的方法检测汞离子浓度(采用不同浓度的探针probe-1)一、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附1、QCM石英片的预处理QCM石英片用新配置的Piranha洗液(由70体积份98 % H2SO4水溶液和30体积份H2O2组成)清洗2分钟，之后用电阻率为18. 2M Q cm—1的纯水充分清洗，之后依次用乙醇、丙酮清洗后再用纯水洗涤，最后氮气吹干。
2、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附在预处理后的QCM石英片表面的金电极上滴加10 μ L溶液A(溶液Al、溶液A2、溶液A3或溶液Α4)，室温吸附池；用纯水洗净并用氮气吹干；滴加50 μ L含ImM 6-巯基-1-己醇的乙醇溶液(6-巯基-1-己醇作为去除非特异吸附的保护剂)，室温吸附Ih ；依次用乙醇和水冲洗，用氮气吹干，得到探针probe-Ι修饰的QCM石英片。二、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附1、金颗粒溶胶的制备(柠檬酸三钠还原氯金酸法)配制IOOmL 1 % (g/mL)的氯金酸水溶液，加热回流，搅拌下迅速加入3. 5mL 1% (g/100mL)的柠檬酸三钠水溶液，继续加热15min放置冷却至室温，得到金颗粒溶胶。金颗粒溶胶的扫描电镜照片见图2，可见金颗粒溶胶中金颗粒的粒径约为12nm。2、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附取200 μ L步骤1制备的金颗粒溶胶加入50 μ L的溶液C (由探针probe-3和PBS 缓冲液组成，探针probe-3的浓度为20 μ M)，室温孵育Mh ；然后加入250 μ L PBS缓冲液静置48h (陈化)，离心并用PBS缓冲液多次洗涤沉淀；最后将洗净的沉淀(金颗粒)分散到 250 μ L PBS缓冲液，得到探针probe-3修饰的纳米金颗粒溶胶。三、样品中汞离子的检测1、将5μ L溶液D(由汞离子母液和PBS缓冲液组成，汞离子的浓度为20μΜ)与 5 μ L溶液B (由探针probe-2和PBS缓冲液组成，探针probe-2的浓度为20 μ Μ)混合后滴加到探针probe-Ι修饰的QCM石英片的金电极上，储存在密闭的样品盒中并置于37°C下的恒温箱内孵育池，用纯水清洗并用氮气吹干，此时记录QCM石英片的读数a (单位为Hz)。2、完成读数后，在步骤1处理后的QCM石英片上的金电极上滴加10 μ L探针 probe-3修饰的纳米金颗粒溶胶，储存在密闭的样品盒中并置于37°C下的恒温箱内孵育池，用纯水清洗并用氮气吹干，此时记录QCM石英片的读数b(单位为Hz)。3、计算QCM石英片的频率响应；QCM石英片的频率响应(-AF) = (a_b)，单位为 Hz。QCM石英片的频率响应在附图的纵坐标中以频率降低-AF表示(注明频率的降低意思是a-b) οQCM石英片的频率响应结果见图3。探针probe-Ι浓度为20nM时，QCM石英片的频率响应为4Hz ；探针probe-1浓度为200nM时，QCM石英片的频率响应为18Hz ；探针probe-1 浓度为2μ M时，QCM石英片的频率响应为77Hz ；探针probe-Ι浓度为20 μ M时，QCM石英片的频率响应为69Hz。随着探针probe-1浓度的增加，响应信号先增大后减小，2 μ M的探针 probe-Ι响应信号最大，这表示探针probe-Ι浓度过高时由于QCM石英片表面探针排列过于紧密，产生了立体位阻效应，阻碍了 QCM石英片表面DNA的杂交，从而引起响应信号的下降。实施例2、应用本发明的方法检测汞离子浓度的灵敏度(金颗粒的粒径约为12nm)一、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附1、QCM石英片的预处理同实施例1的步骤一的1。2、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附在预处理后的QCM石英片表面的金电极上滴加10 μ L溶液A3 (探针probe-Ι的浓度为2 μ M)，室温吸附池；用纯水洗净并用氮气吹干；滴加50 μ L含ImM 6-巯基-1-己醇的乙醇溶液，室温吸附Ih ；依次用乙醇和水冲洗，用氮气吹干，得到探针probe-Ι修饰的QCM 石英片。二、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附1、金颗粒溶胶的制备同实施例1的步骤二的1。2、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附同实施例1的步骤二的2。三、应用本发明的方法检测汞离子浓度的灵敏度1、将5 μ L溶液D (由汞离子母液和PBS缓冲液组成，设置不同汞离子浓度)与5 μ L 溶液B (由探针probe-2和PBS缓冲液组成，探针probe-2的浓度为20 μ Μ)混合后滴加到探针probe-Ι修饰的QCM石英片的金电极上，储存在密闭的样品盒中并置于37°C下的恒温箱内孵育池，用纯水清洗并用氮气吹干，此时记录QCM石英片的读数a (单位为Hz)。步骤2和3同实施例1的步骤三的2和3。QCM石英片的频率响应结果见图4。随着汞离子浓度的增加，频率响应信号逐渐增大，最终达到饱和。当汞离子浓度低于20nM时，QCM石英片频率响应信号随着汞离子浓度的增加逐渐增大，特别是在汞离子浓度为4nM-12nM区段，QCM石英片频率响应信号与浓度增大呈线性相关，可以作为检测汞离子的最佳检测浓度区间。当汞离子浓度大于12nM时，QCM 石英片频率响应信号的增大逐渐减少，这是由于QCM石英片表面吸附的纳米金颗粒量逐渐增多后，由于空间位阻效应，它们之间相互干扰从而影响了其在QCM石英片上的吸附。当汞离子浓度到达40nM以上时，QCM石英片基本达到饱和吸附，QCM石英片频率响应信号不随汞离子的增大而增加。根据信号噪声比为3 1，可以推算出汞离子的检测限为5nM。实际应用时，可用已知汞离子母液的梯度稀释液作为标准品溶液，制备标准曲线。 将待测溶液或待测溶液的梯度稀释液代替溶液D进行步骤三的实验，将待测溶液的QCM石英片的频率响应与标准曲线比对，即可得到待测溶液中的汞离子浓度。完成检测的QCM石英片的扫描电镜照片见图5。从图中可以看出，汞离子引起的纳米金颗粒在QCM石英片上的吸附效果很明显，白色的小圆点就是吸附的纳米金颗粒。实施例3、应用本发明的方法检测汞离子浓度(金颗粒的粒径约为65nm)一、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附1、QCM石英片的预处理同实施例1的步骤一的1。2、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附同实施例2的步骤一的2。二、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附配制30mL 1 % (g/100mL)的氯金酸水溶液，加热回流，搅拌下迅速加入0. 16mL 1% (g/100mL)的柠檬酸三钠水溶液，继续加热15min放置冷却至室温，得到金颗粒溶胶。金颗粒溶胶的扫描电镜照片见图6，可见金颗粒溶胶中金颗粒的粒径约为65nm。2、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附同实施例1的步骤二的2。三、样品中汞离子的检测
同实施例2的步骤三。QCM石英片的频率响应结果见图7。可以看到，65nm金颗粒同样可以用于检测汞离子，而且检测中对低浓度下的信号放大效果明显好于12nm的金颗粒。当汞离子浓度低于 20nM时，QCM石英片频率响应信号随着汞离子浓度的增加逐渐增大，特别是在汞离子浓度为InM-IOhM区段，QCM石英片频率响应信号与浓度增大呈线性相关，可以作为检测汞离子的最佳检测浓度区间。根据信号噪声比为3 1，可以推算出汞离子的检测限为InM。实施例4、应用本发明的方法检测汞离子浓度的特异性一、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附1、QCM石英片的预处理同实施例1的步骤一的1。2、QCM石英片对探针probe-Ι的吸附同实施例2的步骤一的2。二、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附1、金颗粒溶胶的制备同实施例1的步骤二的1。2、纳米金颗粒对探针probe-3的吸附同实施例1的步骤二的2。三、应用本发明的方法检测汞离子浓度的特异性溶液El由硝酸汞和PBS缓冲液组成，汞离子(Hg2+)的浓度为20nM;溶液E2由 NiCl2和PBS缓冲液组成，镍离子(Ni2+)的浓度为20 μ M ；溶液Ε3由Mg (NO3) 2和PBS缓冲液组成，镁离子(Mg2+)的浓度为20 μ M ；溶液Ε4由CrCl3和PBS缓冲液组成，铬离子(Cr3+)的浓度为20 μ M ；溶液Ε5由1 (NO3) 2和PBS缓冲液组成，铅离子0 2+)的浓度为20 μ M ；溶液 Ε6由Cd(NO3)2和PBS缓冲液组成，镉离子(Cd2+)的浓度为20 μ M ；溶液Ε7由MnCl2和PBS 缓冲液组成，锰离子(Mn2+)的浓度为20 μ M ；溶液Ε8由Ba (NO3) 2和PBS缓冲液组成，钡离子 (Ba2+)的浓度为20 μ M ；以PBS缓冲液作为空白对照。1、将5 μ L溶液E (溶液El、溶液Ε2、溶液Ε3、溶液Ε4、溶液Ε5、溶液Ε6、溶液Ε7或溶液Ε8)与5 μ L溶液B (由探针probe-2和PBS缓冲液组成，探针probe-2的浓度为20 μ Μ) 混合后滴加到探针probe-Ι修饰的QCM石英片的金电极上，储存在密闭的样品盒中并置于 37°C下的恒温箱内孵育2h，用纯水清洗并用氮气吹干，此时记录QCM石英片的读数a (单位为 Hz)。步骤2和3同实施例1的步骤三的2和3。QCM石英片的频率响应结果见图8。浓度为汞离子浓度1000倍的其它金属离子引起的频率响应信号并不明显，与空白对照差不多，和汞离子的频率响应信号相差很远。这是由于空白实验条件下，或者是加入其它金属离子条件下，由于探针probe-Ι和探针probe-2 不能发生杂交配对，因此纳米金颗粒最终无法固定在QCM石英片表面，故不能导致明显的质量响应信号。实施例5、应用本发明的方法检测汞离子浓度(不同夹心探针)一、QCM石英片对探针probe-4的吸附1、QCM石英片的预处理
同实施例1的步骤一的1。2、QCM石英片对探针probe-4的吸附在预处理后的QCM石英片表面的金电极上滴加10 μ L探针probe-4溶液(由探针 probe-4和PBS缓冲液组成，探针probe-4的浓度为2 μ M)，室温吸附池；用纯水洗净并用氮气吹干；滴加50 μ L含ImM 6-巯基-1-己醇的乙醇溶液，室温吸附Ih ；依次用乙醇和水冲洗，用氮气吹干，得到探针probe-4修饰的QCM石英片。二、纳米金颗粒对探针probe-6的吸附1、金颗粒溶胶的制备同实施例1的步骤二的1。2、纳米金颗粒对探针probe-6的吸附取200 μ L金颗粒溶胶加入50 μ L的探针probe-6溶液(由探针probe-6和PBS 缓冲液组成，探针probe-6的浓度为20 μ M)，室温孵育Mh ；然后加入250 μ L PBS缓冲液静置48h (陈化)，离心并用PBS缓冲液多次洗涤沉淀；最后将洗净的沉淀(金颗粒)分散到 250 μ L PBS缓冲液，得到探针probe-6修饰的纳米金颗粒溶胶。三、样品中汞离子的检测1、将5yL汞离子溶液(由汞离子母液和PBS缓冲液组成，汞离子的浓度为IOnM) 与5 μ L探针probe-5溶液(由探针probe-5和PBS缓冲液组成，探针probe-5的浓度为 20 μ Μ)混合后滴加到探针probe-4修饰的QCM石英片的金电极上，储存在密闭的样品盒中并置于37°C下的恒温箱内孵育池，用纯水清洗并用氮气吹干，此时记录QCM石英片的读数 a (单位为Hz)。2、完成读数后，在步骤1处理后的QCM石英片上的金电极上滴加10 μ L探针 probe-6修饰的纳米金颗粒溶胶，储存在密闭的样品盒中并置于37°C下的恒温箱内孵育池，用纯水清洗并用氮气吹干，此时记录QCM石英片的读数b (单位为Hz)。3、计算QCM石英片的频率响应；QCM石英片的频率响应(-AF) = (a_b)，单位为 Hz。QCM石英片的频率响应为18Hz，大于三倍的噪声比，说明变换探针中的能自然杂交的那段碱基序列后，仍然能够检测溶液中的汞离子。
权利要求
1.一种检测水样中汞离子浓度的方法，包括如下步骤(1)将待测水样与溶液B混合后与交联于QCM石英片的金电极上的单链DNA探针A进行杂交，记录QCM石英片的读数a ；所述溶液B为含有单链DNA探针B的溶液；所述QCM石英片来自于气相型、采用金电极的石英晶体微天平；(2)将步骤(1)杂交得到的QCM石英片与交联于纳米金颗粒上的单链DNA探针C进行杂交，记录QCM石英片的读数b ；(3)计算QCM石英片的频率响应；QCM石英片的频率响应=(a-b)，单位为Hz；(4)根据QCM石英片的频率响应得出待测溶液中的汞离子浓度；所述单链DNA探针A包括一个功能区段，即功能区段A ；所述功能区段A的长度占单链 DNA探针A长度的60%以上；所述功能区段A的长度为6-12bp ；所述功能区段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；所述单链DNA探针B包括两个功能区段，即功能区段Bl和功能区段B2 ；所述功能区段 Bl的长度和所述功能区段B2的长度之和占单链DNA探针B长度的60%以上；所述功能区 Bl中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；所述功能区段A与所述功能区段 Bl遵循碱基互补配对原则甲；所述碱基互补配对原则甲中，核苷酸T与核苷酸T互补配对， 核苷酸G与核苷酸C互补配对；所述单链DNA探针C包括一个功能区段，即功能区段C ；所述功能区段C的长度占单链 DNA探针C长度的60%以上；所述单链DNA探针C的长度为9_20bp ；所述功能区段C与所述功能区段B2遵循碱基互补配对原则乙；所述碱基互补配对原则乙中，核苷酸A与核苷酸 T互补配对，核苷酸G与核苷酸C互补配对。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述单链DNA探针A的核苷酸序列如序列表的序列1所示，所述单链DNA探针B的核苷酸序列如序列表的序列2所示，所述单链DNA 探针C的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述单链DNA探针A的核苷酸序列如序列表的序列4所示，所述单链DNA探针B的核苷酸序列如序列表的序列5所示，所述单链DNA 探针C的核苷酸序列如序列表的序列6所示。
4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述单链DNA探针A通过末端的巯基交联于所述QCM石英片的金电极上；所述单链DNA探针C通过末端的巯基交联于所述纳米金颗粒上；所述纳米金颗粒的粒径为12-65nm。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述单链DNA探针A通过如下方法交联于所述QCM石英片的金电极在所述QCM石英片表面的金电极上滴加10 μ L溶液�。匠兀� 清洗干燥后加50 μ L ImM 6-巯基-1-己醇的乙醇溶液，吸附Ih ；清洗干燥后得到交联有所述单链DNA探针A的QCM石英片；所述溶液A为含有单链DNA探针A的溶液。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述单链DNA探针C通过如下方法交联于所述纳米金颗粒上取200 μ L所述纳米金颗粒的溶胶加入50 μ L溶液C，孵育 24h ；然后加入250 μ L PBS缓冲液静置48h，离心并洗涤沉淀；最后沉淀分散到250 μ L PBS 缓冲液，得到交联有单链DNA探针C的纳米金颗粒；所述溶液C为含有所述单链DNA探针C 的溶液；所述PBS缓冲液优选为如下缓冲液ρΗ7. 4，由Na2HPCV NaH2PO4, NaClO4和水组成， Na2HPO4的浓度为10mM，NaH2PO4的浓度为10mM，NaClO4的浓度为0. 1M。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述溶液A由所述单链DNA探针A和PBS缓冲液组成，所述单链DNA探针A的浓度优选为20ηΜ-20 μ M ；所述溶液B由所述单链DNA探针B和PBS缓冲液组成，所述单链DNA探针B的浓度优选为20 μ M ；所述溶液C由所述单链 DNA探针C和PBS缓冲液组成，所述单链DNA探针C的浓度优选为20 μ Μ。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述溶液A和/或所述溶液B和/或所述溶液C中，所述PBS缓冲液为如下缓冲液ρΗ7. 4，由Na2HP04、NaH2P04、NaC104和水组成，Na2HPO4 的浓度为10mM，NaH2PO4的浓度为10mM，NaClO4的浓度为0. 1M。
9.如权利要求1至8中所述的方法，其特征在于所述待测溶液中汞离子的浓度为1ηΜ-20μΜ;步骤(1)中，所述杂交的条件为37°C2h;步骤⑵中，所述杂交的条件为 37 0C 2h。
10.一种检测水中汞离子浓度的试剂盒，包括如下组分纳米金颗粒，由单链DNA探针 A、单链DNA探针B和单链DNA探针C组成的探针组合物和气相型、采用金电极的石英晶体微天平；所述单链DNA探针A包括一个功能区段，功能区段A ；所述功能区段A的长度占单链DNA 探针A长度的60%以上；所述功能区段A的长度为6-12bp ；所述功能区段A中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；所述单链DNA探针B包括两个功能区段，功能区段Bl和功能区段B2 ；所述功能区段Bl 的长度和所述功能区段B2的长度之和占单链DNA探针B长度的60%以上；所述功能区Bl 中不含有核苷酸A且核苷酸T占核苷酸总数的75%上；所述功能区段A与所述功能区段Bl 遵循碱基互补配对原则甲；所述碱基互补配对原则甲中，核苷酸T与核苷酸T互补配对，核苷酸G与核苷酸C互补配对；所述单链DNA探针C包括一个功能区段，功能区段C;所述功能区段C的长度占单链DNA 探针C长度的60%以上；所述单链DNA探针C的长度为9-20bp ；所述功能区段C与所述功能区段B2遵循碱基互补配对原则乙；所述碱基互补配对原则乙中，核苷酸A与核苷酸T互补配对，核苷酸G与核苷酸C互补配对。
全文摘要
本发明公开了一种检测水样中汞离子浓度的方法。本发明的方法包括如下步骤(1)将待测水样与溶液B混合后与交联于QCM石英片的金电极上的单链DNA探针A杂交，记录QCM石英片的读数a；溶液B为含有单链DNA探针B的溶液；QCM石英片来自于气相型、采用金电极的石英晶体微天平；(2)将步骤(1)杂交得到的QCM石英片与交联于纳米金颗粒上的单链DNA探针C杂交，记录QCM石英片的读数b；(3)计算QCM石英片的频率响应；QCM石英片的频率响应＝(a-b)，单位为Hz；(4)根据QCM石英片的频率响应得出待测溶液中的汞离子浓度；本发明的方法可用于检测饮用水中汞离子的浓度，需要的检测样品量非常少，操作简单，仪器便携，成本较低，适合推广。
文档编号G01N5/02GK102183433SQ201110046138
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者张建平, 江龙, 盛仲翰, 韩建华 申请人:中国科学院化学研究所
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