亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：时间分辨荧光免疫分析中检测洗涤残留干扰的一种方法
技术领域：
本发明涉及到一种对时间分辨荧光免疫分析中洗涤残留干扰进行检测的方 法，具体内容是采用在铕标试剂中添加钐离子为对照物判断是否有洗涤残留干扰的方法，属于时间分辨荧光免疫分析技术领域。
技术背景时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)是医学领域超微量检测中一项新兴的检测 技术，是利用免疫反应的高度特异性和标记示踪物的高度灵敏性相结合而建立 的一类微量物质检测技术。TRFIA法的原理为用三价稀土离子(最常用的是铕 离子)标记蛋白质、多肽、抗体、激素等，当体系反应发生后，用时间分辨荧 光仪，测定最后产物的荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断 反应体系被分析物的浓度，达到定量分析之目的。在DELFIA的免疫分析中， 增强液具有非常重要的作用，结合于免疫复合物上的稀土离子荧光信号非常微 弱，增强液可使免疫复合物上的稀土离子解离下来，荧光信号可放大100万倍 以上，起到放大荧光效果的作用。在TRFIA免疫分析中，由于增强液的强烈增强效果， 一方面提高了检测的 灵敏度，同时也容易放大误差，所以在洗涤时，有可能会残留未结合的稀土离 子，如果大于0.1%，就会明显造成结果出现假阳性或假阴性。由于铕离子和钐 离子在溶液中是同时均匀分布的，铕离子的残留比例与钐离子相同，由于铕离 子和钐离子的发射光的波长不同，铕离子最大激发波长340nm，最大发射波长 613nm，钐离子的最大激发波长340nm,最大发射波长600nm，因此钐离子对铕 离子没有干扰，用时间分辨荧光仪(DELFIA1235、 DELFIA1420等)进行铕离 子和钐离子的双波长检测，所以钐离子可作为在铕标记的TRFIA试剂反应中洗 涤残留的示踪剂。 发明内容本发明的目的，旨在找到一种灵敏度高，操作简便，对分析过程不造成影 响的方法，对铕标记的TRFIA中的洗涤残留干扰进行检测，从而避免一些由于 操作误差造成的分析结果的假阳性或假阴性。为达到上述目的，本发明的技术方案 一种在常用的铕离子标记的时间分 辨荧光免疫分析法TRFIA中检测洗涤残留的方法，它采用如下工作步骤(1)在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加2-6万cps/pL的钐离 子，添加无生物活性的钐离子仅用于示踪洗涤残留的量；当用反应缓冲液稀释铕离子标记物时，同时稀释钐离子，钐离子的最终荧光强度计数控制在100000-200000 cps /孔；(2) 在微孔板上进行的TRFIA分析过程中当含有钐离子的铕标试剂与微孔 板上的物质反应完毕之后，用洗液洗板6次，通过洗涤去除未结合的铕标记物， 同时也洗涤去除钐离子；(3) 洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用进行双波长测量的时间分辨 荧光仪分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，计算钐离子的残留量， 判断残留中铕离子是否超标；计算钐离子的残留比例实测值/理论值x100。/。， 如果大于0.1%，则判定有洗涤残留的干扰，该孔结果不可信。本发明的有益效果本发明方法是一种灵敏度高，操作简便，对分析过程 不造成影响的方法，对铕标记的TRFIA中的洗涤残留干扰进行检测，从而避免 一些由于操作误差造成的分析结果的假阳性或假阴性。
具体实施方式
实施例l:肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)测定时的洗涤残留干扰的检测，该方法包括如下工作步骤1、钐离子的添加在铕标CEA单抗的溶液中，加入一定量的钐离子，使 钐离子浓度达到5万cps/VL。2、铕标抗体的反应取CEA单抗包被板12孔，每孔加入25pL的标准或样品， 再加入20(HiL缓冲液(含8mmol/LNaCl、 0.1%BSA、 5Onmol/L DTPA、 O.lml/L Tween-80和0.1。/。NaN3的50mmol/LTris-HClpH7.8) ， 25。C振荡孵育3小时， 洗涤2次(洗涤液为14.5mmol/L NaCl、 0.2mL/L Tween-80和0.2% NaN3的 50mmol/LpH7.8的Tris-HCl缓冲液，下同)，再加入用缓冲液1 : IOO稀释的含 有钐离子的铕标CEA单抗溶液200pL， 25"C振荡孵育1小时，洗涤6次，去除 孔内多余的液体。每孔加入增强液(1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15pmo1 卩-萘甲酰三氟丙酮(P-NTA) ， 50nmo1三正辛基氧化膦(TOPO)和lmL曲拉通 X-100) 200nL， 25'C振荡孵育5分钟后进行荧光检测用DELFIA1235时间分 辨荧光仪测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，铕离子的荧光强度cps 用于CEA含量的检测，钐离子的荧光强度cps用于计算钐离子的残留比例实 测值/理论值xlOOQ/。(表l)，如果大于0.1%，则判定有洗涤残留的干扰，该孔结 果不可信。表1:CEA测定时钐离子的残留判定钐离子实测值cps50827432618147203921256572钐离子理论值cps100000/孔钐离子残留比例％0. 050.080. 070. 030. 060. 080. 050. 200.090. 130. 070. 07是否有洗涤残留的干扰无无无无无无无有无有无无4实施例2:甲胎蛋白(AFP)测定时的洗涤残留干扰的检测，该方法包括如下工作步骤1、 钐离子的添加在铕标AFP单抗的溶液中，加入一定量的钐离子，使钐 离子浓度达到3.75万cps/pL。2、 铕标抗体的反应取AFP单抗包被板12孔，每孔加入25nL的标准或 样品，再加入用缓冲液(缓冲液组成同实施例1) 1 : 75稀释的含有钐离子的铕 标AFP单抗溶液200^L， 25'C振荡孵育1小时，洗漆6次，去除孔内多余的液 体。每孔加入增强液(增强液组成同实施例l) 20(HiL， 25t:振荡孵育5分钟后 进行荧光检测用DELFIA1420时间分辨荧光仪测定每一孔的铕离子和钐离子 的荧光强度cps，铕离子的荧光强度cps用于CEA含量的检测，钐离子的荧光强 度cps用于计算钐离子的残留比例实测值/理论值><100%(表2)，如果大于0.1%, 则判定有洗涤残留的干扰，该孔结果不可信。表2:AFP测定时钐离子的残留判定钐离子实测值cps80272645251614753926355172钐离子理论值cps100000/孔钐离子残留比例％0.80.080. 060. 050. 050. 060. 050. 050. 090. 060. 060. 17是否有洗涤残留的干扰有无无无无无无无无无无有权利要求
1、一种在常用的铕离子标记的时间分辨荧光免疫分析法TRFIA中检测洗涤残留的方法，其特征在于，它采用如下工作步骤(1)在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加2-6万cps/μL的钐离子，添加无生物活性的钐离子仅用于示踪洗涤残留的量；当用反应缓冲液稀释铕离子标记物时，同时稀释钐离子，钐离子的最终荧光强度计数控制在100000-200000cps/孔；(2)在微孔板上进行的TRFIA分析过程中当含有钐离子的铕标试剂与微孔板上的物质反应完毕之后，用洗液洗板6次，通过洗涤去除未结合的铕标记物，同时也洗涤去除钐离子；(3)洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用进行双波长测量的时间分辨荧光仪分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，计算钐离子的残留量，判断残留中铕离子是否超标；计算钐离子的残留比例实测值/理论值×100％，如果大于0.1％，则判定有洗涤残留的干扰。
全文摘要
时间分辨荧光免疫分析中检测洗涤残留干扰的一种方法，属于时间分辨荧光免疫分析技术领域。本发明方法采用如下工作步骤1.在铕离子标记的TRFIA试剂中的标记物中添加一定量的钐离子；2.在微孔板上进行的TRFIA分析过程中通过洗涤去除未结合的铕标记物，同时也清洗钐离子；3.洗涤结束后加增强液，5分钟后检测，用可进行双波长测量的时间分辨荧光仪(DELFIA1235、DELFIA1420等型号仪器)分别测定每一孔的铕离子和钐离子的荧光强度cps，计算钐离子的残留量，如果大于设定的残留比例，则判定有洗涤残留的干扰。本方法可有效的发现TRFIA中由于洗涤残留造成的干扰，避免一些由于操作失误造成的假阳性或假阴性。
文档编号G01N21/64GK101324574SQ200810022619
公开日2008年12月17日 申请日期2008年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者彬 周, 珏 张, 艺 张, 岚 朱, 柯 王, 马智鸿, 飚 黄 申请人:江苏省原子医学研究所