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专利名称：25羟基维生素d检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测试剂盒，特别是涉及25羟基维生素D检测试剂盒。
背景技术：
人体和动物每天必需从食物中摄取适量的维生素D，才能維持正常的发育和健康。成人的建议每日摄取量是5 y g，妊娠期和哺乳期女性应当增加I倍左右的摄入量，每天手脚露30厘米，在阳光下晒30分钟，有效的防止维生素D的缺乏。但维生素D摄食过量会弓I起中毒，ー些学者认为长期每日摄入25 u g维生素D可引起中毒，这其中可能包括一些对维生素D敏感的人，但长期每天摄入125 u g维生素D则肯定引起中毒。我国制定维生素D可
耐受:最闻摄入量为20 u go25 (OH) VD是最主要的血清VD的存在形式，其血清浓度反应了机体中可利用的VD的状态，其结果的可靠性要优于检测血清1，25 (OH)VD水平。血清25 (OH)VD浓度随年龄而降低。老年人日照相对减少，老化皮肤产生VD数量下降，及不充分的饮食摄入，造成老年人普遍缺乏VD，增加了患骨质疏松症的风险。因此，检测25 (OH)VD血清浓度可以辅助临床对VD缺乏状态的评估，也可用于检测患者非正常血清钙水平的原因。目前25羟基维生素D检测试剂盒主要是以进ロ产品为主，稳定性较好的产品主要是酶联免疫法和放射性免疫法类产品。放射性免疫法检测25羟基维生素D试剂盒存在需操作经验丰富的检验员，存在放射性污染的问题，使用范围受到限制。目前通常使用的利用酶联免疫法检测25羟基维生素D的试剂盒的血清样本需要稀释才可加样，操作时间比较长，操作方法步骤比较繁琐。

实用新型内容基于此，有必要提供ー种敏感度高、特异性强、操作简便、稳定性好，无污染、重复性好的25羟基维生素D检测试剂盒。ー种25羟基维生素D检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及置于塑料框架中的微孔板，所述微孔板的微孔内包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体层，所述高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的量为0. I 0. 5 ii g ;所述试剂瓶包括装有浓度为0. I u g/ml的生物素标记的25轻基维生素D的试剂瓶和装有工作浓度为0. 5 2. 0 ii g/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的试剂瓶。在其中一个实施例中，所述试剂瓶还包括有6瓶分别装有25羟基维生素D标准品的试剂瓶，2瓶分别装有25羟基维生素D质控品的试剂瓶，I瓶装有底物溶液的试剂瓶，I瓶装有终止液的试剂瓶和I瓶装有冲洗液的试剂瓶。在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有检测时用于密封微孔板的封ロ膜。本实用新型的25羟基维生素D检测试剂盒是采用竞争法原理定量測定人血清或血浆中的25羟基维生素D和其他羟基化代谢产物。将标准品、质控品和样本加入至预包被高特异性鼠25 (OH)D单克隆抗体的微孔板的微孔中，再加入生物素标记的25 (OH)D抗原室温下孵育30分钟，之后冲洗。加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白，选择地与生物素结合，接着冲洗，再利用底物显色。终止反应后，在酶标仪下45011111处读取吸光度，25(011)0浓度与颜色强度成反比。上述25羟基纤维素D检测试剂盒与目前通常使用的同类检测试剂盒相比，可提高工作效率，并大幅节约成本。本发明采用单克隆抗体包被板条，灵敏度约为5nmol/L，线性范围大于同类试剂盒，精密度和准确度均在试剂盒要求范围内，并且血清样本不需要稀释即可直接加样，操作方法比同类试剂盒简单，一般技术人员即可操作，操作时间比同类试剂盒減少一半。且无污染，可以作为同类放射性免疫分析试剂盒的替代产品。

图I是本实用新型实施例I所述盒体与下凹瓶位的的结构示意图； 图2是本实用新型实施例I所述微孔板的结构示意图；附图标记1、盒体；2、下凹瓶位；3、框架；4、微孔板；5、微孔。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本实用新型。实施例I请參考图1-3，所述25羟基维生素D检测试剂盒的盒体I内具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有14个下凹瓶位)，下凹瓶位2用于放置装有溶液的试剂瓶；位于塑料框架3中的微孔板4，微孔板4中的微孔5内包被有包被量为0. g的高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体层。试剂瓶包括装有浓度为0. I u g/ml的生物素标记的25羟基维生素D的试剂瓶和装有工作浓度为I. Oii g/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的试剂瓶。本实施例所述的25羟基维生素D检测试剂盒的主要组成成份如下I、包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的微孔板所述微孔板的每个微孔内高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的包被量为0. 2 u g ;条形微孔板(12条X8孔)，置于框架中。2、25羟基维生素D标准品0. I. 2. 3. 4. 5可直接使用，共6瓶，每瓶300ul，标准品溶液的线性浓度分别为A 0 ；B :6. 5 ；C 26 ；D 60 ；E 180 ；F :360ng/ml，分别对应标准品 0. I. 2. 3. 4. 5。3、25羟基维生素D质控品I. 2可直接使用，共2瓶，每瓶300ul，浓度分别为30ng/ml和100ng/ml。4、生物素标记的25羟基维生素D可直接使用，浓度为0. Iii g/ml，I瓶，每瓶3ml。5、酶结合物可直接使用的辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白(溶于含去污剂、防腐剂和BSA缓冲溶液中)，工作浓度为I. Oii g/ml，I瓶，6. OmL。6、底物溶液[0029]可直接使用的四甲基联苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中)，I瓶，12. OmL。7、终止液可直接使用的盐酸溶液(HCl、100ml/L ;エ艺用水、900ml/L)。I瓶，12. OmL。8、浓缩洗液(20 X)含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液。I瓶，50. OmL。9、封 ロ 膜孵育时密封微孔板的粘性薄膜。所述试剂盒的制备如下(一)标准品与质控品(I)标准品的配制是由浓度为lmg/ml的25轻基VD母液及人工血清、proclin300配制而成。配制1000人份标准品，具体配制过程如下(从高浓度配起):F :取 25 羟基 VD lmg/ml 的母液 252 U 1+699. 048ml 人工血清 +0. 7mlproclin300 ；分装；E :取配制好的标准品溶液F150ml+149. 7ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分装；D :取配制好的标准品溶液F50ml+249. 7ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分装；C :取配制好的标准品溶液F21. 65ml+278. 05m人工血清+0. 3mlproclin300 ;分装;B :取配制好的标准品溶液F5. 4ml+294. 3ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分装；A :加入300ml人工血清，分装。(2)质控品的配制质控品I (100ng/ml) :25 羟基 VD 标准品 F (360ng/ml) 83. 35ml+216. 35ml 人工血清+0.3ml proclin300,分装;质控品2 (30ng/ml) :25 羟基 VD 标准品 F (360ng/ml) 25ml+274. 7ml 人工血清+0.3ml proclin300,分装。( ニ)包被高特异性鼠25 (OH) D单克隆抗体的微孔板外购高特异性鼠25 (OH) D单克隆抗体。按100 u L/孔将包被液(包被液抗体2. 5mg+包被缓冲液IOOOml ;包被缓冲液为Na2CO3O. 423g/L, NaHCO3L 344g/L)加入酶标板的微孔内，4°C过夜(> 17h);采用稀释后的25 (OH) VD 浓缩洗液(X20 =Na2HPO4 12H20116g/L、NaH2PO4 2H2011. 84g/L、NaCl 180g/L、Tween-2010ml/L、proclin3001ml/L)进行洗涤，200 y L/孔，洗两次；按 200 yl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO4 12H20 5. 8g/L、NaH2PO4 2H20 0. 592g/L、NaCl 9. Og/L、蔗糖 50g/L、乳糖 50g/L、BSA 10g/L、proclin3001ml/L,过滤)，室温放置(18 26°C )，4°C过夜进行封闭；在干燥房(18-26°C )抽干后，真空密封(2-8°C )，得到包被高特异性鼠25(0H)D单克隆抗体的微孔板，干燥保存。(三)酶结合物配方如下=Na2HPO4 12H20、2. 9g/L ;KH2P04、0. 4g/L ;NaCL、8g/L ;KCL、0. 4g/L ;BSA、10g/L ;proclin300、lml/L ;辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白(外购原料)、lg/L ;过滤。[0055](四)其他生物素标记的25羟基维生素D、底物溶液、终止液、浓缩洗液(20X)、封ロ膜均由其他商业公司提供。实施例2运用实施例I的试剂盒对样本中的25羟基维生素D进行检测被测样本的要求采用血清或血浆(EDTA、枸櫞酸钠或肝素)样本。样本采集后应尽快分离，样本在15-25°C放置不超过4小时；2-8°C放置时不超过12小时；-20°C或以下放置时可保存2个月，_80°C下可长期保存，应避免样品的反复冻融，最多只能冻融一次。溶血样本、微生物污染样本不能用于測定。 实施例I的试剂盒的操作步骤如下I)按照所需测定的样本数量及布局在板条上放好微孔板条。2)加入生物素标记的25羟基维生素D 25 ill。3)加入25羟基维生素D标准品、25羟基维生素D质控品和样本各25 U I至待测孔中。4)用封ロ膜将微孔板板孔封好，置于室温下30分钟。5)用稀释好的浓缩洗液洗板五次。a.自动洗板设置洗板机分配每孔至少300 ill冲洗液。重复洗5次。b.手动洗板迅速颠倒倒出孔内物。每孔加入250 U I冲洗液。重复洗板5次。在进入下ー步之前，于吸水纸上用カ拍打倒置的板以去除多余的洗液。6)每孔加入酶结合物50 U 1，置于室温30分钟。7)重复步骤5。8)每孔加入TMB底物溶液100 U I，封上封ロ膜，避光温育15分钟。注TMB底物溶液易受到污染。移取所需要的量，用后的液体请勿再倒回瓶内。9)每孔加入终止液100 ill。10)加入终止液30分钟内在450nm波长(參考波长是650nm)处读取吸光度。表1-3为运用实施例I的试剂盒随即抽取大人和小孩血清样本中的25羟基维生素D的检测結果。大人和小孩的正常值为50-150nmol/L。表I
权利要求1.一种25羟基维生素D检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及置于塑料框架中的微孔板，其特征在于，所述微孔板的微孔内包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体层，所述高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的量为O. I O. 5 μ g ;所述试剂瓶包括装有浓度为O. I μ g/ml的生物素标记的25羟基维生素D的试剂瓶和装有工作浓度为O. 5 2. O μ g/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的试剂瓶。
2.根据权利要求I所述的25羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，所述试剂瓶还包括有6瓶分别装有25羟基维生素D标准品的试剂瓶，2瓶分别装有25羟基维生素D质控品的试剂瓶，I瓶装有底物溶液的试剂瓶，I瓶装有终止液的试剂瓶和I瓶装有冲洗液的试剂瓶。
3.根据权利要求I或2所述的25羟基维生素D检测试剂盒，其特征在于，还包括有检测时用于密封微孔板的封口膜。
专利摘要本实用新型公开了一种25羟基维生素D检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及置于塑料框架中的微孔板，所述微孔板的微孔内包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体层，所述高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的量为0.1～0.5μg；所述试剂瓶包括装有浓度为0.1μg/ml的生物素标记的25羟基维生素D的试剂瓶和装有工作浓度为0.5～2.0μg/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的试剂瓶本实用新型25羟基纤维素D检测试剂盒灵敏度约为5nmol/L，线性范围大于同类试剂盒，精密度和准确度均在试剂盒要求范围内，操作方法比同类试剂盒简单，操作时间短。
文档编号G01N33/82GK202522564SQ20122013407
公开日2012年11月7日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者郭志程 申请人:广州菲康生物技术有限公司