专利名称：分枝杆菌抗原组合物的制作方法
分枝杆菌抗原组合物本发明涉及分枝杆菌多核苷酸和多肽，涉及其片段或变体，涉及其抑制剂，涉及与其结合的抗体，涉及载体和微生物载体，涉及治疗性组合物如针对分枝杆菌感染的疫苗，并且涉及用于检测分枝杆菌感染的存在的组合物和方法。微生物如沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)和分枝杆菌属(Mycobacteria)的物种能 够形成胞内感染。这些感染可能是绝对胞内的，或可能包含胞内成分和胞外成分二者。通常，这些微生物不能在体内例如在血流中自由循环，并且因此通常对药物治疗方案没有响应。多药耐药性微生物的发展加剧了与治疗胞内感染相关的困难。由于突变随时间积累以及后续的突变基因向其他生物体的水平和垂直的转移，整个种类的抗生素已经失去活性。由于类似的原因，已不能证明疫苗治疗是对胞内微生物有效的。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) (MTB)和紧密相关的物种组成一小组已知为结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosiscomplex, MTC)的分枝杆菌。该组包括五种不同的物种结核分枝杆菌(M. tuberculosis),田鼠分枝杆菌(M. microti),牛分枝杆菌(M. bovis), M. caneti和非洲分枝杆菌(M. africanum)。其他分枝杆菌在人类和动物中也是致病性的，例如，鸟分枝杆菌副结核亚种(M. avium subsp. paratuberculosis),其在反会动物中引起约尼病(Johne' s disease),牛分枝杆菌，其在牛中引起结核病(tuberculosis),鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(M. intracellulare)，其在免疫受损的患者(例如，AIDS患者、和骨髓移植患者)中引起结核�。约奥榉绶种Ω司�(M. leprae),其在人类中引起麻风病(leprosy)。另一种重要的分枝杆菌物种是母牛分枝杆菌(M. vaccae)。作为结核病感染(TB)的发病原因，结核分枝杆菌(M. tuberculosis)在世界范围内是细菌感染疾病引起的死亡的主要原因一一潜在的感染影响多至世界人口的三分之一。世界卫生组织(WHO)估计每年全世界发生近九百万例TB新病例，近两百万例死亡。2005年，最大数量的TB新病例发生在东南亚(占全球发病病例的34% )，估计在撒哈拉以南非洲地区(sub-Saharan Africa)的发病率为每100，000人口近350例。然而，TB感染不限于发展中国家自二十世纪八十年代末期以来，英国观察到结核病的复现，并且目前每年有超过8000例新病例——比率为每100，000人口 14. O例。这些新病例中有大约40%发生在伦敦地区，在伦敦地区感染率为每100，000人口 44. 8例。最佳的患者管理需要尽可能早地开始药物治疗并且分离感染的个体。不进行治疗的话，每名患有活动期TB病的个体平均每年传染10-15人。TB感染通�？梢酝ü�6个月疗程的抗生素进行治疗；然而，患者对长期药物治疗的依从性是变化的，有的患者经常在他们的症状停止时就停止治疗。不能完成治疗可能促进多药耐药性分枝杆菌的发展。术语“潜伏期”与“持久性”同义，并且描述一种低代谢活性的可逆状态，在这种状态中，分枝杆菌细胞可以以有限的细胞分裂或没有细胞分裂存活延长的时间期间。在潜伏期(即，潜伏的感染)期间，与分枝杆菌感染相关的临床症状没有变得明显。
然而，环境刺激一例如，营养可用性和/或局部溶解的氧浓度的增加，可以诱导潜伏分枝杆菌的再激活。在活动性感染过程中，分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌)表现出高代谢活性并且快速复制，导致带有相关临床症状的活动性分枝杆菌感染的发展。体外研究已经表明分枝杆菌如结核分枝杆菌能够适应并且在营养贫瘠和氧气贫瘠的条件下存活，并且可以在一定范围的营养可用性和氧张力下生长。在体外适应碳饥饿和/或低溶解氧张力促进向可能与体内潜伏类似的非复制持续状态的转换。怀疑分枝杆菌的胞内存活和繁殖是分枝杆菌疾病进展的主要支持因素。存在大量潜伏感染分枝杆菌的无症状的个体是控制分枝杆菌感染的主要问题，尤其是控制结核分枝杆菌感染的主要问题。另外，通过皮肤检测来检测潜伏分枝杆菌感染的常规方法可能受到BCG疫苗接种和暴露于环境分枝杆菌的损害。针对结核分枝杆菌的疫苗预防的有效性已经广泛变化。目前的结核分枝杆菌疫苗，BCG，是牛分枝杆菌的减毒毒株。其针对儿童中严重的TB并发症是有效的，但是其效力在成年人中、特别是在种族之间有很大不同。BCG疫苗接种已经用来预防结核性脑膜炎·(tuberculous meningitis),并且帮助防止结核分枝杆菌向肺外部位的扩散,但是不能预防感染。BCG的有限功效和TB的全球流行性已经引起产生新的更有效的疫苗的国际性的尝试。WO 03/004520(以本申请人的名义，通过引用结合于此)描述了不同亚组的分枝杆菌基因的鉴定，这些基因的表达在分枝杆菌潜伏期过程中被诱导或上调。具体地，与不是营养-不足(nutrient-starving)并且支持所述分枝杆菌的指数生长的培养条件相比较，在营养-不足培养条件下，在分枝杆菌培养过程中，这一确定的亚组的分枝杆菌基因的表达被诱导或上调。WO 03/035681(以本申请人的名义，通过引用结合于此)描述了不同亚组的分枝杆菌基因的鉴定，这些基因的表达在分枝杆菌潜伏期过程中被下调。具体地，与不是营养-不足并且支持所述分枝杆菌的指数生长的培养条件相比较，在营养-不足培养条件下，这一确定的亚组的分枝杆菌基因的表达被下调。WO 03/000721(以本申请人的名义，通过引用结合于此)描述了不同亚组的分枝杆菌基因的鉴定，与在37°C测量至少40%空气饱和的溶解氧张力相比较，这些基因的表达在由低溶解氧张力(在37°C测量至多10%空气饱和)限定的生长条件下连续培养分枝杆菌的过程中被诱导或上调。考虑到分枝杆菌感染的日益增加的威胁和全球流行性，需要新的策略来更有效的预防、治疗和诊断分枝杆菌感染。本发明提供一种抗原组合物，所述抗原组合物包含第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；其中所述第一分枝杆菌抗原包含⑴与选自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs :2,4,6,8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。当用于本文时，术语“分枝杆菌的”或“分枝杆菌”包括下述物种草分枝杆菌(M. phlei),耻垢分枝杆菌(M. smegmatis),非洲分枝杆菌(M. africanum), M. caneti,偶发分枝杆菌(M. fortuitum),瘰疬分枝杆菌(M. marinum),溃瘍分枝杆菌(M. ulcerans),结核分枝杆菌(M. tuberculosis),牛分枝杆菌(M. bovis),田鼠分枝杆菌(M. microti),鸟分枝杆菌(M. avium)，副结核分枝杆菌(M. paratuberculosis)，麻风分枝杆菌(M. leprae)，鼠麻风分枝杆菌(M. Iepraemurium),胞内分枝杆菌(M. intracellulare),瘰疬分枝杆菌(M. scrofulaceum),膽分枝杆菌(M. xenopi),日内瓦分枝杆菌(M. genavense),堪萨斯分枝杆菌(M. kansasii)，猿分枝杆菌(M. simiae),斯氏分枝杆菌(M. szulgai),嗜血分枝杆菌(M. haemophilum),亚洲分枝杆菌(M. asiaticum),玛尔摩分枝杆菌(M. malmoense),母牛分枝杆菌(M. vaccae), M. caneti和石氏分枝杆菌(M. shimoidei)。其中特别感兴趣的是MTC的成员，如结核分枝杆菌。术语抗原意指可以被免疫系统识别和/或刺激免疫应答的任意物质。例如，抗原可以刺激细胞介导的免疫应答和/或可以刺激抗体的产生。 在一个实施方案中，本发明的分枝杆菌抗原提供涉及免疫细胞如T细胞(CD4+和/或CD8+T细胞)的针对感染的细胞介导的应答和/或用Thl-型细胞因子如IFN- Y应答的能力。在一个实施方案中，分枝杆菌抗原诱导IFN-Y-分泌细胞(例如，主要是CD4+T细胞)。在这一点上，最近的研究表明免疫细胞应答(例如，特别是在肺黏膜中的T细胞免疫应答)对于针对肺分枝杆菌疾病的保护可能是关键的。在一个实施方案中，本发明的分枝杆菌抗原提供针对分枝杆菌(如结核分枝杆菌)攻击的保护(如长期的保护)。例如，本发明的分枝杆菌抗原可以诱导“记忆T细胞”，其可以长期(例如，数十年)持续刺激保护性免疫。记忆免疫应答已经归因于长期存在的(long-lived)抗原特异性T淋巴细胞的再激活，所述T淋巴细胞直接由分化的效应T细胞产生并且以静息状态继续存在。记忆T细胞是异质的；已经鉴定了至少两个亚组，它们具有不同的迁移能力和效应子功能。第一亚组的记忆T细胞称为‘效应子记忆T细胞’(TEM)，因为它们与在初次应答中产生的效应T细胞相似，在初次应答中，它们缺少用于迁移到发炎组织中的淋巴结归巢受体(lymph node-homing receptors)。当再遇到抗原时，TEM迅速产生IFN-Y或IL-4,或释放预先存储的穿孔蛋白。第二亚组的记忆T细胞(称为‘中心记忆细胞(central memorycells) ’ (TCM))表达L-选择蛋白和CCR7，并且缺少即时效应子功能。TCM具有低激活阈值并且当在次级淋巴器官中被再次刺激时增殖并且分化成效应子。在一个实施方案中，分枝杆菌抗原提供针对分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)感染的中和抗体应答。在一个实施方案中，本发明的抗原组合物中的每种抗原独立的诱导有效的免疫应答(例如，细胞介导的免疫应答或抗体应答)。因此，按照这一实施方案，在向受试者施用所述抗原组合物后，在所述受试者中诱导针对所述抗原组合物中的每种抗原的免疫应答。在这一点上，本发明人已经鉴定了(在一个实施方案中)与关于已知的多价疫苗组合物可能预见到的竞争效应相比较，本发明的抗原组合物有利地避免“抗原竞争”，或与低水平的“抗原竞争”相关。
“抗原竞争”是这样的一种现象，即，通过这种现象，针对一种抗原的免疫应答抑制针对第二种不相关的抗原的免疫应答(参见，Eidinger，D.等，J Exp Med, 1968. 128(5):第1183-1200页)。例如，响应一种抗原的免疫细胞(例如，T细胞)可能积极地干扰响应另一种抗原的其他免疫细胞(例如，T细胞)(参见，Kerbel, R. S.和Eidinger, D. , Nat NewBiol, 1971. 232 (27):第 26-28 页)。WO 00/47227描述了(在实施例2中)用编码单独的分枝杆菌抗原85A的DNA免疫豚鼠(组A);或用编码分枝杆菌抗原85A和分枝杆菌抗原MPT32 二者的DNA免疫豚鼠(组B)。在用结核分枝杆菌攻击后，通过确定肺和脾中的分枝杆菌负荷评估疫苗功效。图IlA和IlB举例说明抗原85A和MPT32的组合(组B)没有单独的抗原85A(组A)对结核分枝杆菌有效。因此，已知将有效的疫苗候选物汇集成多价疫苗抑制或甚至竞争性消除疫苗的功效。由于抗原竞争的普遍性，所以认为获得高于其最有效成分的提高的功效的多价疫苗是有益的。
因此，令人惊讶的是，本发明的抗原组合物组合单独能够引发免疫应答的抗原并且与针对每种单独的抗原的免疫应答相比较产生提高的/增强的免疫应答。在一个实施方案中，分枝杆菌抗原包含多肽序列。分枝杆菌抗原可以是多肽。备选地，或另外，分枝杆菌抗原包含多核苷酸序列。例如，分枝杆菌抗原可以是多核苷酸，如DNA或 RNA。第一分枝杆菌抗原包含(i)与选自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs :2,4,6,8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含(i)与SEQ ID NO :1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或(ii)编码⑴所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO 2的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。由SEQ ID NOs :1，3，5，7和56所示的特定亚组的分枝杆菌多肽是‘潜伏期_调节多肽’。由SEQ ID NOs :2,4,6,8和57所示的特定亚组的分枝杆菌多核苷酸是‘潜伏期_调节多核苷酸’。在一个实施方案中，‘潜伏期-调节多肽’由‘潜伏期-调节多核苷酸’编码。例如，潜伏期-调节多肽SEQ ID NO: I由潜伏期-调节多核苷酸SEQID NO :2编码；SEQ ID NO:3 由 SEQ ID NO 4 编码；SEQ ID NO 5 由 SEQ ID NO 6 编码；SEQ ID NO 7 由 SEQ ID NO 8编码；并且 SEQ ID NO :56 由 SEQ ID NO 57 编码。潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性响应分枝杆菌的潜伏期进行调节一一例如，响应在诱导或维持分枝杆菌潜伏期的培养条件下的分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌)的培养物进行调节。在一个实施方案中，响应分枝杆菌潜伏期的条件“调节”潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性意指响应潜伏期诱导或上调所述表达或活性。因此，潜伏期-调节多肽或多核苷酸可以是‘潜伏期-诱导的’或‘潜伏期-上调的’多肽或多核苷酸。例如，与非潜伏期条件相比较，在潜伏期条件下，潜伏期-上调的多肽或多核苷酸的表达或活性可以上调至少I. 5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍或50-倍。
在分枝杆菌的天然环境中，在潜伏期过程中，在体内可以诱导或上调潜伏期-诱导和潜伏期-上调的多肽和多核苷酸的表达或活性。因此，潜伏期-诱导的或潜伏期-上调的分枝杆菌多肽和多核苷酸代表用于预防疾病的建立、扩散和再激活的良好的疫苗候选物和良好的治疗靶标和/或产生用于潜伏性感染的良好的诊断工具。在一个实施方案中，响应分枝杆菌潜伏期的条件“调节”潜伏期-调节多肽的表达或活性意指响应潜伏期抑制或下调所述表达或活性。因此，在一个实施方案中，潜伏期-调节多肽或多核苷酸是‘潜伏期-抑制的’或‘潜伏期-下调的’多肽或多核苷酸。与非潜伏期条件相比较，潜伏期-下调的多肽或多核苷酸的表达或活性可以下调至少I. 5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍或50-倍。引用“下调”包括“阻断”，意指基本上没有可检测到的多肽或多核苷酸的活性和/或表达。在活动性分枝杆菌感染过程中，或在分枝杆菌由潜伏状态再激活的过程中/之后，在体内可以诱导或下调潜伏期-抑制的或潜伏期-下调的多肽和多核苷酸的表达或活性。潜伏期-抑制的和潜伏期-下调的分枝杆菌多肽和多核苷酸可能在疾病的活动期过程中发展针对复制的杆菌的有效免疫应答中起早期作用，并且因此代表用于预防疾病的建立、扩散和再激活的良好的疫苗候选物和良好的治疗靶标。与不是营养不足的培养条件相比较，在营养-不足的培养条件下可以调节(如诱导、上调、抑制或下调)潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性。在营养不足的培养条件下，初始能源(primary energy source)(例如碳)的浓度不足以支持分枝杆菌的指数生长，结果分枝杆菌在代谢上受到胁迫并且进入潜伏状态。与不是限氧的培养条件相比较，在限氧(低溶解氧张力)条件下，可以备选地(或另外地)调节(如诱导、上调、抑制或下调)潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性。在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含与选自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84,86,88,90,92,94,96,98,99或100%的氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原由与选自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70 %的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100%的氨基酸序列同一性)的多肽序列组成，或由具有其至少7个连续氨基酸的其片段组成。因此,在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原是如上文定义的‘第一分枝杆菌多肽’(或片段)。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ IDNO 1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。SEQ ID NOs :1，3，5，7 和 56 在下表 I 中定义表I
因此，在本申请的上下文中，“RvOlll多肽抗原”包含SEQ ID N0:1(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID N01(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rvl806多肽抗原”包含SEQ ID NO :3 (或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ IDNO :3(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv0198多肽抗原”包含SEQ ID NO :5(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO :5(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv3812多肽抗原”包含SEQ ID NO :7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO :7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；并且，“RV1807多肽抗原”包含SEQ ID NO :56 (或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO :56(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成。在一个实施方案中，氨基酸序列同一性存在于长度为至少7个连续的氨基酸残基(例如，长度为至少 10，15，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600 或650个连续的氨基酸残基)的多肽序列的区域。 用于确定氨基酸序列同一性的常规方法在本说明书下文中更详细地讨论。在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的至少7个连续的氨基酸残基(例如，所述多肽的至少10，15，25，50，75，100，125，150，175，200，225,250,275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,525,550,575,600,625,650 或 675
个连续的氨基酸残基)。在一个实施方案中，多肽的片段具有的序列长度是全长多肽的序列长度的至少5%，10%，25%，50%，60%，70%，80%，或 90%。多肽的片段可以包含所述多肽的至少一个表位。在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的截短形式。例如，多肽的片段可以具有N-端截短(与所述多肽比较)，或多肽的片段可以具有C-端截短(与所述多肽比较)。在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的成熟形式。例如，多肽可以包含信号序列(即，分泌/靶向序列)(例如，在N-端)，并且多肽的片段可以缺少这一信号序列。在一个实施方案中，片段可以通过从所述多肽切割信号序列而形成。在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO : I的片段是SEQ ID NO : I的N-端截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO: I的氨基酸序列相比较，多肽SEQ ID NO: I的片段具有至少50，100，150，200，250，300，或350个氨基酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，SEQID NO : I的片段至少包含SEQ ID NO :1的C-端50，100，150，200，250或300个氨基酸的序列。在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO :7的片段是SEQ ID NO :7的N-端截短形式。在一个实施方案中，SEQ ID NO :7的片段是成熟的多肽序列，其与SEQ ID NO :7的序列的不同在于去除了 N-端信号序列。在一个实施方案中，与SEQ ID NO :7的氨基酸序列相比较，多肽SEQ ID N0:7的片段具有至少5，10，15，20，25，30，35或40个氨基酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，SEQ ID NO :7的片段至少包含SEQ ID NO :7的C-端50，100，150，200，250，300，350，400或450个氨基酸的序列。·
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含与选自SEQ ID NOs :1，3, 5, 7和56的潜伏期-调节多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性的多肽或其片段。当用于此处时，‘共同的抗原交叉反应性’意指第一分枝杆菌多肽或片段与选自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞(例如，⑶4+，⑶8+，效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的“回忆应答”的能力。在最近的10年间已经建立了用于测量和定量免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的新的免疫学测定法。例如，干扰素-Y (IFN-Y)ELISPOT测定法可用作免疫学读�。蛟谟诳乖�-特异性免疫细胞如T细胞的IFN- Y分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。此外，ELISP0T测定法是一种定量分泌IFN- Y的抗原-特异性免疫细胞如T细胞的数目的非常可重现和灵敏的方法。备选地，或另外，‘共同的抗原交叉反应性’意指能够结合第一分枝杆菌多肽或片段的抗体也能够结合潜伏期-调节多肽。在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含编码如上述定义的第一分枝杆菌多肽的多核苷酸序列，或由编码如上述定义的第一分枝杆菌多肽的多核苷酸序列组成。因此,在一个实施方案中,第一分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)编码这样的多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs :1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100%的氨基酸序列同一性)的氨基酸序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段(例如，如上述定义)。在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含与选自SEQ ID NOs :2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70 %的核苷酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100 %的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原由下述组成与选自SEQ IDNOs :2,4,6,8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100 %的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。因此,在一个实施方案中,第一分枝杆菌抗原是如上述定义的‘第一分枝杆菌多核苷酸’(或片段)。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)如上述定义的编码本发明的第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQID NO 2的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。SEQ ID NOs :2，4，6，8 和 57 在下表 2 中定义表 权利要求
1.抗原组合物，所述抗原组合物包含 (i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或 (ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； 并且还包含 (iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或 (iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的抗原组合物，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含与SEQIDNO 2的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
3.根据权利要求I或2所述的抗原组合物，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含与SEQID NO 6的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列,或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原组合物，所述抗原组合物还包含至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽，所述另外的分枝杆菌抗原多肽不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽和/或所述第二分枝杆菌抗原多肽；或还包含至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸，所述另外的分枝杆菌多核苷酸不同于所述第一分枝杆菌多核苷酸和/或所述第二分枝杆菌多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的抗原组合物，其中所述至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽包含与选自SEQ ID NOs :3，7，9-20，34-44或56的任一种的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
6.根据权利要求4所述的抗原组合物，其中所述至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸包含编码如权利要求5定义的多肽序列的多核苷酸序列；诸如与选自SEQ ID NOs 4,8,21-32,45-55或57的核酸序列具有至少70%的核苷酸序列同一'丨生的多核苷酸序列,或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
7.根据前述权利要求任一项所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物包含至少一种载体；其中所述载体包含至少一种所述分枝杆菌多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的抗原组合物,其中所述载体包含所述第一分枝杆菌多核苷酸和所述第二分枝杆菌多核苷酸。
9.根据权利要求7或8所述的抗原组合物，其中所述载体是表达载体，或病毒载体，如减毒的痘苗病毒(vaccinia virus)载体或腺病毒载体。
10.根据前述权利要求任一项所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物包含至少一种细胞，并且其中所述细胞包含所述分枝杆菌抗原多肽和/或分枝杆菌多核苷酸中的至少一种；如其中所述细胞是减毒的微生物载体，如减毒的沙门氏菌(salmonella)、减毒的牛分枝杆菌(M. bovis)(例如，BCG菌株)或减毒的结核分枝杆菌(M. tuberculosis)。
11.免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽； 其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段； 并且其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
12.用于制备治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)的方法，所述方法包括组合药用载体与 (i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或 (ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； 并且与(iii)或(iv)组合 (iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或 (iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的方法，所述方法包括将所述药用载体与权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物组合。
14.用于制备治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)的方法，所述方法包括将药用载体与第一抗体和第二抗体组合； 其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO :I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且 其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
15.根据权利要求14所述的方法，所述方法包括将所述药用载体与根据权利要求11所述的免疫原性组合物组合。
16.治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)，所述制剂包含药用载体和 (i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID N0:1的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或 (ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； 以及(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或 (iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列； 其中所述制剂用于所述第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸和所述第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸的同时施用或顺次施用。
17.根据权利要求16所述的制剂，所述制剂包含根据权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物。
18.治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)，所述制剂包含药用载体和 (a)第一抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽；其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和 (b)第二抗体，其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；其中所述第二分枝杆菌抗原包含与SEQ ID NO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段； 其中所述制剂用于所述第一和第二抗体的同时施用或顺次施用。
19.根据权利要求18所述的制剂，所述制剂包含权利要求11所述的免疫原性组合物。
20.第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，与第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，其用于在受试者中刺激免疫应答；其中 (i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段； (ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； (iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且 (iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述应用的第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸与第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸与所述第二第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸用于基本上同时或顺次施用给受试者。
22.根据权利要求20或21所述应用的第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸与第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸，其中所述第一和第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸以权利要求16或17所述的制剂的形式存在。
23.第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体用于在受试者中刺激免疫应答； 其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且 其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
24.根据权利要求23所述应用的第一抗体和第二抗体，其中所述第一和第二抗体用于基本上同时或顺次施用给受试者。
25.根据权利要求23或24所述应用的第一抗体和第二抗体，其中所述第一和第二抗体以权利要求18或19所述的制剂的形式存在。
26.根据权利要求20-22中任一项所述应用的第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸和第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸，或根据权利要求23-25中任一项所述应用的第一抗体和第二抗体，其中所述应用是用于治疗或预防所述受试者中的分枝杆菌感染(例如，TB);如其中所述分枝杆菌感染是早期感染。
27.诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者的包含免疫细胞如T-淋巴细胞的测试样品与下述一起温育 (a)权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物；或 (b)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中 (i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段； (ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； (iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且 (iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； 并且检测所述免疫细胞的激活，其中所述免疫细胞的激活指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
28.诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者的测试样品与下述一起温育 (a)权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物；或 (b)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中 (i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段； (ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； (iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQID NO :5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且 (iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列； 其中所述温育在允许所述第一和第二分枝杆菌抗原与所述样品中的抗体结合从而形成抗原-抗体复合物的条件下进行；然后检测所述复合物的形成，其中抗原-抗体复合物的存在指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
29.诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者的测试样品与下述一起温育 (a)权利要求11中所述的免疫原性组合物；或 (b)第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽； 其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO: I的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ IDNO 5的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段； 其中所述温育在允许所述第一和第二抗体与所述样品中的抗原结合从而形成抗原-抗体复合物的条件下进行；然后检测所述复合物的形成，其中抗原-抗体复合物的存在指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
30.如前述和/或如附图
和/或实施例中所示的抗原组合物、免疫原性组合物、细胞、方法或应用。
全文摘要
本发明提供一种抗原组合物，所述抗原组合物包含(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸；和(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
文档编号G01N33/569GK102905724SQ201180025286
公开日2013年1月30日 申请日期2011年5月23日 优先权日2010年5月21日
发明者迈尔斯·卡罗尔, 伊珀·霍尔, 安·威廉斯 申请人:健康保护局
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