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专利名称：层层自组装制备壳聚糖-碳纳米管-染料-酶多层膜的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物传感器中电极的制备方法，尤其涉及一种层层自 组装制备壳聚糖-碳纳米管-染料-酶多层膜修饰电极的方法
背景技术：
功能性多层膜在生物传感器、生物微反应器和生物医用材料等方面有 重要应用，是近年来十分受关注的研究领域。层层自组装方法
(Layer-by-layer assembly, LBL)是一种重要的功能性多层膜构筑方法，具 有操作简单，组装条件温和，可以在分子层面控制组装量、膜结构和膜厚 度等特点。通过层层自组装方法交替组装构筑具有特殊功能的多层膜具有 重要的研究意义。
修饰电极作为生物传感器中的重要部件，其制备方法对生物传感器的 性能有很大影响。过氧化物酶修饰电极被广泛用于食品生产、环境监测等 领域。发展无试剂的过氧化物酶生物传感器是生物传感器研究的重要方 向。这主要是由于过氧化物酶的氧化还原中心较难与电极发生直接电子传 递，人们通常需引入电子传递媒介体促进过氧化物酶与电极间的电子传 递。因此，电子传递i某介体在溶液中的过氧化物酶电极在原位分析或在线 检测时存在诸多不便。
发展无试剂过氧化物酶生物传感器的关键是实现酶和电子传递媒介 体的共固定化。小分子有机染料是性能优良的电子传递々某介体，可有效促 进过氧化物酶与电极间的电子传递。碳纳米管由于具有独特的理化性质而
受到人们的广泛关注。较大的比表面积、导体和半导体性质使其广泛应用 与生物传感器的构筑中。羧基化的碳纳米管表面带负电荷，可与带正电的 阳离子聚电解质通过静电等作用有效复合。
利用层层自组装方法制备壳聚糖-碳纳米管-染料-酶多层膜修饰电 极，构筑新型无试剂传感器具有潜在应用价值。

发明内容
本发明提供一种条件温和的功能性多层膜修饰电极制备方法。 一种层层自组装制备壳聚糖-碳纳米管-染料-酶多层膜修饰电极的方
法，将带有负电荷的电极依次分别置入溶液A、溶液B、溶液C和溶液B 中进行组装操作使带有负电荷的电极表面附着修饰膜，循环所述的组装操 作直至带有负电荷的电极表面的修饰膜为预定厚度的多层膜，得到修饰电 极。
所述的组装才喿作为将电极在溶液中浸泡，浸泡的时间为5-60min，每 次更换溶液时可先用去离子水冲洗电极。
负电荷的电极可以通过现有技术中多种方法得到。例如金电极，可以 利用吸附、自组装等多种方法在电极表面负栽一层带负电荷的单分子膜或 带负电的纳米物质等，这样电极就带负电了。例如氧化铟锡电极，在氢氧 化钠/乙醇溶液中浸泡就可以使电极表面带负电。例如玻碳电极，在硫酸中 进行循环伏安扫描使其表面产生氧化层，就可以使电极表面带负电。
所述的溶液A为壳聚糖-碳纳米管溶液，壳聚糖-碳纳米管溶液的配置 方法力口下
(l)将壳聚糖溶于质量百分比浓度为0.5-2.0%的乙酸或质量百分比浓 度为0.5-2.0%盐酸溶液中，用M溶液调壳聚糖溶液的pH值为4.0-5.8, 得到溶液M;
浓碱溶液一般可以采用质量百分比浓度10 ~ 30%的氢氧化钠或氢氧
化钾水溶液。
得到的溶液M中壳聚糖的质量百分比浓度为0.5-4.0%;
(2)向溶液M中加入羧基化的碳纳米管，超声10-30分钟，得到溶液 A(壳聚糖-碳纳米管溶液)；
得到的溶液A中^&化的碳纳米管浓度为0.1mg/mL-3mg/mL。
所述的溶液B为聚电解质-染料溶液，聚电解质-染料溶液的配置方法 如下
(1) 将聚电解质溶于浓度为0.02-1.0mol/L、 pH值为4.0-5.8的乙酸-乙 酸钠緩冲溶液中，得到溶液N;
所述聚电解质为聚阴离子电解质，具体可采用聚对苯乙烯磺酸钠、硫 酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧曱基纤维素钠、聚丙烯酸或海藻酸钠； 得到的溶液N中聚电解质的浓度为0.1-5mg/mL。
(2) 向溶液N中加入染料电子々某介体，得到溶液B(聚电解质-染料溶
液)；
所述染料电子媒介体为阳离子染料电子媒介体，具体可以釆用亚曱基 兰、耐尔兰或中性红；
得到的溶液B中，染料电子媒介体的物质的量低于(与权利要求书统 一吧)聚电解质的物质的量，利用静电作用将阳离子染料预先吸附在聚阴 离子电解质上后，并使得到的聚电解质-染料复合物带静负电荷；若染料 电子媒介体的物质的量高于聚电解质的物质的量将无法保证聚电解质-染 料复合物带静负电荷。
此步骤组装过程作用力以静电作用为主，壳聚糖"友纳米管带正电， 聚电解质-染料带负电，酶带正电，聚电解质-染料带负电，这样正负相间 组装，这也是组装顺序需固定的原因。
作为优�。�在得到的溶液B中，染料电子媒介体的物质的量与聚电解 质的物质的量的比为0.05 ~ 0.5: 1。
所述的溶液C为酶溶液，酶溶液的配置方法如下 将过氧化物酶溶于浓度为0.02-1.0mol/L、pH值为4.0-5.8的乙酸-乙酸 钠緩冲溶液中，得到溶液C(酶溶液)；
得到的溶液C中，酶的浓度为0.1-5mg/mL;
所述的过氧化物酶，具体可采用辣根过氧化物酶、芦,过氧化物酶或 马铃薯过氧化物酶。
操作时，将带有负电荷的电极按次序分别置入溶液A、溶液B、溶液 C和溶液B中完成一次循环组装操作，使带有负电荷的电极表面附着修饰 膜，为了得到一定厚度的多层膜，按照溶液A、溶液B、溶液C和溶液B 的顺序再进行若干次循环组装操作， 一般循环3-10次左右，得到(壳聚 糖-碳纳米管-染料-酶)n修饰电极，n表示循环的次数。
本发明方法一般均可在常温下操作。
壳聚糖是来源丰富的天然聚合物，壳聚糖分子中大量的活性氛基可在 酸性溶液中质子化，使壳聚糖具有聚阳离子的性质。壳聚糖可有效地* 羧基化的碳纳米管，形成稳定的壳聚糖-碳纳米管复合物。
作为一种天然聚合物，壳聚糖具有良好的生物相容性，被广泛用作酶 固定化载体。碳纳米管近年来已被广泛用于生物传感器的构筑中，可促进 电子传递，有效提高传感器检测灵敏度。与壳聚糖-碳纳米管基质复合的 酶具有高的活性和良好的稳定性。同时，染料电子传递媒介体可有效促进 过氧化氢酶与电极间的电子传递。小分子有机染料是性能优良的电子媒介 体，但这类分子所带的电荷较少，直接采用自组装方法构筑多层膜，组装 上的染料分子在组装下一层时容易从膜中脱落。因此本发明将有机阳离子 有机染料与聚阴离子聚电解质在溶液中预混合，利用静电作用将染料预先 吸附在聚阴离子上，再与带正电荷的物质静电组装。本发明中，壳聚糖聚 阳离子的作用，使得壳聚糖-碳纳米管复合物带正电，能够与带静负电荷 的聚电解质-染料静电自组装。过氧化物酶在所述pH条件下，带正电，也 可与表面带负电的聚电解质-染料发生静电自组装。
因此，将带有负电荷的电极分别置入壳聚糖-碳纳米管溶液、聚电解质 -染料溶液、酶、聚电解质-染料溶液中进行组装操作，能使带有负电荷的 电极表面通过静电作用附着1奮饰膜，循环所述的组装才喿作直至带有负电荷 的电极表面的修饰膜达到预定厚度，可得到(壳聚糖^友纳米管/聚电解质-染料/酶/聚电解质-染料)n多层膜修饰电极。基于壳聚糖-碳纳米管复合材 料、电子传递媒介体共固定化的层层自组装方法，可使构筑的无试剂传感 器具有良好的电化学性能和稳定性。
本发明方法，制备条件温和，多层膜厚度、染料电子传递媒介体固定 量、酶固定量可控。
具体实施方式
实施例1
将壳聚糖溶于质量百分比浓度为0.5%的乙酸溶液中，调溶液pH值为 5.0，得到溶液M,溶液M中壳聚糖的质量百分比浓度为0.5%;向所得壳 聚糖溶液中加入g化的碳纳米管，超声IO分钟，得到壳聚糖-碳纳米管 溶液，壳聚糖-碳纳米管溶液中羧基化的碳纳米管浓度为0.5mg/mL。
将聚对苯乙烯磺酸钠溶于浓度为0.1mol/L、 pH值为5.0的乙酸-乙酸 钠緩冲溶液中，得到溶液N，溶液N中聚对苯乙烯磺酸钠的浓度为 2mg/mL，向所得溶液中加入染料电子媒介体亚曱基兰，得到聚电解质-染 料溶液。聚电解质-染料溶液中亚曱基兰的浓度为0.5mg/mL。
将辣根过氧化物酶溶于浓度为0.1mol/L、 pH值为5.0的乙酸-乙酸钠 緩冲溶液中，得到酶溶液，酶溶液中辣根过氧化物酶的浓度为lmg/mL。
将带有负电荷的电极先后置入壳聚糖-碳纳米管溶液、聚电解质-染料 溶液、酶溶液、聚电解质-染料溶液中交替自组装，每种溶液中的组装时 间为20min,完成一次循环组装操作，使带有负电荷的电极表面附着修饰 膜，按照上述组装顺序再进行6次循环组装操作，得到(壳聚糖-碳纳米管
_染料-酶)6多层膜修饰电极。
实施例2
将壳聚糖溶于质量百分比浓度为1%的乙酸溶液中，调溶液pH值为 4.5，得到溶液M，溶液M中壳聚糖的质量百分比浓度为1%;向所得壳 聚糖溶液中加入羧基化的碳纳米管，超声20分钟，得到壳聚糖-碳纳米管 溶液。壳聚糖-碳纳米管溶液中羧基化的碳纳米管浓度为lmg/mL。
将海藻酸钠溶于浓度为0.2mol/L、 pH值为5.0的乙酸-乙酸钠緩冲溶 液中，得到溶液N，溶液N中海藻酸钠的浓度为2mg/mL，向所得溶液中 加入染料电子媒介体耐尔兰，得到聚电解质-染料溶液。聚电解质-染料溶 液中耐尔兰浓度为0.25mg/mL。
将,勞过氧化物酶溶于浓度为0.1mol/L、 pH值为4.8的乙酸-乙酸钠 緩沖溶液中，得到酶溶液；酶溶液中芦笋过氧化物酶的浓度为0.5mg/mL。
将带有负电荷的电极先后置入壳聚糖-碳纳米管溶液、聚电解质-染料 溶液、酶溶液、聚电解质-染料溶液中交替自组装，每种溶液中的组装时 间为15min，完成一次循环组装操作，使带有负电荷的电极表面附着修饰 膜，按照上述组装顺序再进行8次循环组装操作，得到(壳聚糖-碳纳米管 -染料-酶)s多层膜修饰电极。
权利要求
1、一种层层自组装制备壳聚糖-碳纳米管-染料-酶多层膜修饰电极的方法，将带有负电荷的电极依次分别置入溶液A、溶液B、溶液C和溶液B中进行组装操作使带有负电荷的电极表面附着修饰膜，循环所述的组装操作直至带有负电荷的电极表面的修饰膜为预定厚度的多层膜，得到修饰电极；所述的溶液A为壳聚糖-碳纳米管溶液；所述的溶液B为聚电解质-染料溶液，所述的溶液C为过氧化物酶溶液。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的溶液A的配置方法 如下将壳聚糖溶于质量百分比浓度为0.5-2.0%的乙酸或质量百分比浓度 为0.5-2.0%盐酸溶液中，用碱液调pH值至4.0-5.8,得到壳聚糖的质量百 分比浓度为0.5-4.0%的溶液；再加入羧基化的碳纳米管，M均匀，得到 氛基化的石灰纳米管浓度为0.1mg/mL-3mg/mL的溶液A。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的溶液B的配置方法 如下将聚电解质溶于浓度为0.02-1.0mol/L、pH值为4.0-5.8的乙酸-乙酸钠 緩冲溶液中，得到聚电解质的浓度为0.1-5mg/mL的溶液，向溶液中加入 染料电子媒介体，得到溶液B;所述染料电子媒介体为亚曱基兰、耐尔兰或中性红；溶液B中，染料 电子々某介体的物质的量^f氐于聚电解质的物质的量。
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的溶液C的配置方 法i口下将过氧化物酶溶于浓度为0.02-1.0mol/L、 pH值为4.0-5.8的乙酸-乙酸 钠緩冲溶液中，得到过氧化物酶的浓度为0.1-5mg/mL的溶液C。
5、 如权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述的聚电解质为聚 对苯乙烯磺酸钠、硫酸酯化多糖、多糖硫酸酯、羧曱基纤维素钠、聚丙烯 酸或海藻酸钠。
6、 如权利要求1或4所述的方法，其特征在于所述的过氧化物酶 为辣根过氧化物酶、声,过氧化物酶或马铃薯过氧化物酶。
7、 如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的组装操作为将电极 在溶液中浸泡，浸泡的时间为5-60min。
8、 如权利要求1所述的方法，其特征在于循环所述的组装操作3~ 10次。
全文摘要
本发明公开了一种层层自组装制备壳聚糖-碳纳米管-染料-酶多层膜修饰电极的方法，将带有负电荷的电极分别置入壳聚糖-碳纳米管溶液、聚电解质-染料溶液、酶、聚电解质-染料溶液中进行组装操作使带有负电荷的电极表面附着修饰膜，循环所述的组装操作直至带有负电荷的电极表面的修饰膜达到预定厚度，得到(壳聚糖-碳纳米管/聚电解质-染料/酶/聚电解质-染料)n多层膜修饰电极。本发明利用层层自组装制备壳聚糖-碳纳米管-染料-酶多层膜修饰电极的方法，制备条件温和，多层膜厚度、染料电子传递媒介体固定量、酶固定量可控。制备出的无试剂电极灵敏度高，稳定性好。
文档编号G01N27/327GK101354374SQ200810063030
公开日2009年1月28日 申请日期2008年7月7日 优先权日2008年7月7日
发明者奚凤娜, 林贤福 申请人:浙江大学