专利名称：球腔微电极阵列生物传感器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物传感器及其制备方法，尤其是涉及一种球腔微电极阵列生物传感器的制备方法。
背景技术：
由于电化学生物传感器具有灵敏高、选择性好、测定快速、结构简单、价廉、能耗低且易于微型化和集成化等优点，被认为是在时效、成本等有较高限定要求的场合实现生物检测的首选技术之一。然而，常规电极的检出限受待测物质传质速率和电极表面双电层充放电电流的限制，对痕量物质(低于l(T6m0l/dm3)难以给出电化学响应，限制了其在痕量分析中的应用。而痕量物质的检测对于食品、环保、临床检验以及生命科学领域至关重要，因此发展灵敏度高、检测限低、特异性好、制备方法简单、成本低的电化学生物传感器一直是分析化学界的一类重要问题。目前提高电化学生物传感器灵敏度，降低其检测限的方法主要有以下几类(1) 增加电极表面氧化还原酶的负载量。这类方法有溶胶凝胶法、包埋法等。这些方法尽管可以增加蛋白质在电极表面的负载量，为蛋白质提供亲水性微环境，保持蛋白质的生物/电化学活性，但是通常情况氧化还原蛋白与电极之间的直接电子转移速率较低，因而响应电流达不到痕量分析的要求。(2)减小电极面积，增加物质在电极表面的传质速率，降低电极表面双电层的充放电电流，提高信噪比。随着电极尺寸的减�。镏蚀颖咎迦芤旱降缂砻娴睦┥⒖捎善矫胬┥⒈湮断蚶┥ⅲ纳屏舜馕镏实拇剩缂婊募跣∫灿行У亟档偷缂砻嫠绮愠浞诺绲缌鳎岣吡瞬舛ㄑ逗诺男旁氡�。然而，单支微电极的响应信号很微弱，可通过将多支微电极并联组成的微电极阵列解决该缺点。然而微电极微小的电极面积降低了蛋白质负载量，不利于提高检测灵敏度；常规微电极阵列传感器制备方法繁复，需要昂贵的仪器设备，限制了其实际应用。(3)纳米材料修饰的常规电极固定氧化还原蛋白。纳米材料通常具有生物亲和性， 有利于保持蛋白质的生物/电化学活性；纳米材料提供了较大的比表面，有利于负载更多的蛋白质；纳米材料的小尺寸效应可提高氧化还原蛋白的直接电子转移速率。然而由于常规电极具有较大的面积，使痕量物质微弱的响应电流湮灭在电极表面充放电电流中，难以用于痕量物质测定。因此发展一种蛋白质活性保持好、负载量大，同时蛋白质与电极之间有较快的直接电子转移速率的电化学生物传感器制备方法已成为本领域的迫切要求。本发明因此而来。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种球腔微电极阵列生物传感器，综合解决了氧化还原蛋白负载量、活性、蛋白质与电极之间直接电子转移速率、信噪比等问题。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种球腔微电极阵列生物传感器，其特征在于所述传感器通过以下方法制备(1)通过Langmuir-Blodgett膜方法自组装形成微球Langmuir膜，并将微球 Langmuir膜转移到电极表面形成聚苯乙烯微球阵列电极；所述电极选自金电极、银电极、 钼电极、石墨电极、玻碳电极、氧化铟锡导电玻璃；(2)将氧化物前躯体/溶胶填充到聚苯乙烯微球阵列电极的电极与聚苯乙烯微球 Langmuir膜之间空隙内，干燥电极并去除聚苯乙烯微球形成球腔微电极阵列；所述氧化物选自金属氧化物或非金属氧化物；(3)将氧化还原蛋白溶液直接滴涂在球腔微电极阵列上，于4 30°C挥发至干，得到所需的球腔微电极阵列生物传感器；所述氧化还原蛋白选自氧化酶、脱氢酶或含铁蛋白质。优选的，所述金属氧化物选自氧化锌、二氧化硅、二氧化钛、氧化钨。本发明的另一目的在于提供一种球腔微电极阵列生物传感器的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)通过Langmuir-Blodgett膜方法自组装形成微球Langmuir膜，并将微球 Langmuir膜转移到电极表面形成聚苯乙烯微球阵列电极；所述电极选自金电极、银电极、 钼电极、石墨电极、玻碳电极、氧化铟锡导电玻璃；(2)将氧化物前躯体/溶胶填充到聚苯乙烯微球阵列电极的电极与聚苯乙烯微球 Langmuir膜之间空隙内，干燥电极并去除聚苯乙烯微球形成球腔微电极阵列；所述氧化物选自金属氧化物或非金属氧化物；(3)将氧化还原蛋白溶液直接滴涂在球腔微电极阵列上，于4 30°C挥发至干，得到所需的球腔微电极阵列生物传感器；所述氧化还原蛋白选自氧化酶、脱氢酶或含铁蛋白质。优选的，所述步骤(1)中Langmuir-Blodgett膜方法包括将电极依次用丙酮、乙醇、水超声洗涤后置于水中保存；以体积比1 0.5 2的乙醇水混合液作为溶剂配制质量分数的聚苯乙烯微球乳液；采用体积比1 0. 1 0.25的水与乙醇混合液为亚相，将 500 2000 μ L聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面，静置15 30min后，滑障以10 50cm/min的速度压缩；当膜压达到10 30mN/m时，保持相同膜压5 30min，使气液界面上的微球Langmuir膜稳定；采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到聚苯乙烯微球阵列电极。优选的，所述步骤O)的填充方法采用真空填充方法，所述真空填充方法包括将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的氧化物前躯体/溶胶中，在真空干燥器中抽真空1 lOmin，使小球与电极之间的空隙处于真空状态；然后恢复体系中压力，当体系恢复正常压力时，前躯体/溶胶填注到聚苯乙烯微球与电极之间的空隙内。优选的，所述步骤O)当聚苯乙烯微球与电极间空隙内填充氧化物前驱体/溶胶后，将填充了前躯体/溶胶的聚苯乙烯微球阵列电极于30 100°C下烘干lh，使前躯体/ 溶胶变成凝胶；然后用乙酸乙酯溶解掉聚苯乙烯微球后，30 500°C加热使凝胶转变为氧化物，得到球腔微电极阵列。优选的，所述步骤(3)中氧化还原蛋白溶液以磷酸盐缓冲液为溶剂。
本发明采用将溶解有蛋白质的磷酸盐缓冲液滴涂在球腔微电极阵列表面后挥发至干成膜，即得蛋白质修饰球腔阵列生物传感器。所述蛋白质为各种氧化酶、各种脱氢酶、 以及所有含铁蛋白质。本发明进行生物传感器制备时，包括以下步骤(1)聚苯乙烯微球阵列电极的制备采用Langmuir-Blodgett技术制备聚苯乙烯微球阵列电极。将电极依次用丙酮、 乙醇、水超声洗涤后置于水中保存。以体积比1 0.5 2的乙醇水混合液作为溶剂配制质量分数的聚苯乙烯微球乳液。采用体积比1 0.1 0.25的水与乙醇混合液为亚相，将聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面，静置15 30min后，滑障以10 50cm/ min的速度压缩。当膜压达到10 30mN/m时，保持相同膜压30min，使气液界面上的微球 Langmuir膜稳定。采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到聚苯乙烯微球阵列电极。(2)球腔微电极阵列的制备将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的氧化物前躯体/溶胶中，在真空干燥器中抽真空lOmin，使小球与电极之间的空隙处于真空状态，当体系恢复正常压力时，前躯体/溶胶填注到聚苯乙烯微球与电极之间的空隙内。将填充了前躯体/溶胶的聚苯乙烯微球阵列电极于30 100°C下烘干lh，前躯体/溶胶变成凝胶。用乙酸乙酯溶解掉聚苯乙烯微球后，30 500°C加热使凝胶转变为氧化物，得到球腔微电极阵列。(3)球腔阵列生物传感器制备将氧化还原蛋白溶液直接滴涂在球腔微电极阵列上，于4 30°C挥发至干成膜， 得到氧化还原蛋白修饰球腔微电极阵列生物传感器。氧化物包括氧化锌、二氧化硅、二氧化钛、氧化钨及其它金属或非金属氧化物；氧化还原蛋白质包括各种氧化酶、各种脱氢酶、以及所有含铁蛋白质。所采用的电极可以是 金电极、银电极、钼电极、石墨电极、玻碳电极、氧化铟锡导电玻璃等。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是本发明所采用的设备均为常规设备，可通过调节微球直径调控球腔大小和微电极间距。采用真空组装在聚苯乙烯微球与电极空隙间填充前躯体/溶胶，适用于可形成凝胶的所有体系。所制备的球腔微电极阵列生物传感器具有成本低、制备工艺简单、稳定性好、 灵敏度高、准确度高等特点，可在常规电化学设备上实现对痕量待测物质的快速准确、实时在线电化学检测。其原因在于球腔微电极阵列生物传感器具有微电极阵列电化学特征，可有效提高检测讯号的信噪比；球腔内部提供更大的比表面，有利于提高蛋白质的负载量; 氧化物球腔亲水性的微环境可很好保持蛋白质的生物和电化学活性；球腔内的微反应区域促进了蛋白质与电极之间的直接电子转移。综合解决了氧化还原蛋白负载量、活性、蛋白质与电极之间直接电子转移速率、信噪比等问题。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。实施例1
如将钼金电极依次用丙酮、乙醇、水超声洗涤30min后置于水中保存。以体积比1 0.5的乙醇水混合液为溶剂配制质量分数的聚苯乙烯微球乳液，微球尺寸为 1500nm。采用体积比8. 5 0. 85的水与乙醇混合液为亚相，将聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面，静置15min后，滑障以lOcm/min的速度压缩。当膜压达到10mN/m时，保持相同膜压30min，使气液界面上的微球Langmuir膜稳定。采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到聚苯乙烯微球阵列电极。将5mL正硅酸乙酯与60mL乙醇混合，放入恒温磁力搅拌器中剧烈搅拌，将6mL水和lmL5X 10_2mOl/L NaOH的混合溶液用滴管慢慢加入，搅拌IOmin后转移至容量瓶超声lh， 得到二氧化硅溶胶。将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的二氧化硅溶胶液中，在真空干燥器中抽真空6min(真空度< 1.33 )。关闭真空系统使体系恢复常压。取出电极于室温干燥。用乙酸乙酯除去聚苯乙烯微球，即得二氧化硅球腔微电极阵列。称取3mg血红蛋白溶于ImL PBS (0. lmol/L，pH7. 0)，得到浓度为3g/L的血红蛋白储备液。取IOyL血红蛋白储备液涂于二氧化硅球腔微电极阵列表面，置于4°C下至干成膜，得到用于测定H2O2的血红蛋白修饰二氧化硅球腔微电极阵列生物传感器A。实施例2将氧化铟锡电极依次用丙酮、乙醇、水超声洗涤30min后置于水中保存。以体积比1 1的乙醇水混合液作为溶剂配制质量分数的聚苯乙烯微球乳液，微球尺寸为 1500nm。采用体积比8. 5 1的水与乙醇混合液为亚相，将聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面，静置20min后，滑障以20cm/min的速度压缩。当膜压达到14mN/m时，保持相同膜压30min，使气液界面上的微球Langmuir膜稳定。采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到二维聚苯乙烯微球阵列电极。配制0. 3mol/L硝酸锌和0. lmol/L柠檬酸的混合液，将混合液加热至80°C保温 lh，得到透明均勻的氧化锌前躯体。将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的前躯体中，在真空干燥器中抽真空6min，(真空度< 1.33 )。关闭真空系统使体系恢复常压。将填充了前躯体的聚苯乙烯微球阵列电极于100°C下烘lh，前躯体变成凝胶。用乙酸乙酯溶解掉聚苯乙烯微球后，将电极于马弗炉中以5°C/min的升温速率升至450°C下恒温池，降至室温，得到氧化锌球腔微电极阵列。将3mg辣根过氧化酶溶于ImL PBS (0. lmol/L, pH7. 0)溶液中，配成3g/L辣根过氧化酶储备液，取50 μ L辣根过氧化酶储备液直接滴加在氧化锌球腔微电极阵列表面，置于 10°C下至干成膜，得到用于测定H2A的辣根过氧化酶修饰氧化锌球腔微电极阵列生物传感器B。实施例3将玻碳电极依次用丙酮、乙醇、水超声洗涤30min后置于水中保存。以体积比 1 1.5的乙醇水混合液作为溶剂配制质量分数的聚苯乙烯微球乳液，微球尺寸为 1500nm。采用体积比8. 5 1. 5的水与乙醇混合液为亚相，将聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面，静置25min后，滑障以30cm/min的速度压缩。当膜压达到18mN/m时，保持相同膜压30min，使气液界面上的微球Langmuir膜稳定。采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到二维聚苯乙烯微球阵列电极。取20mL的钛酸四正丁酯于剧烈搅拌下滴加到80ml无水乙醇中，搅拌lOmin，得到均勻淡黄色透明液A ；将5mL去离子水和20mL无水乙醇配成的溶液于在搅拌下缓慢滴加一定量浓HC1，并调节pH为2 3，得到溶液B ；在剧烈搅拌下将溶液B以约1 2滴/秒的速率缓慢滴加到溶液A中，得到均勻透明的二氧化钛溶胶。将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的二氧化钛溶胶液中，在真空干燥器中抽真空6min (真空度< 1. 33Pa)。关闭真空系统使体系恢复常压。将填充了二氧化钛溶胶的聚苯乙烯微球阵列电极于100°C下烘 lh，前躯体溶胶变成凝胶。用乙酸乙酯溶解掉PS微球后，将电极于马弗炉中以5°C /min的升温速率升至400°C下恒温2h，降至室温，得到二氧化钛球腔微电极阵列。将3mg肌红蛋白溶于ImL PBS (0. lmol/L，pH7. 0)溶液中，配成3g/L肌红蛋白储备液，取 ομ L肌红蛋白储备液直接滴加在二氧化钛2球腔微电极阵列表面，置于15°C下至干成膜，得到用于测定H2A肌红蛋白修饰二氧化钛球腔微电极阵列生物传感器C。实施例4将银电极依次用丙酮、乙醇、水超声洗涤30min后置于水中保存。以体积比1 2 的乙醇水混合液为溶剂配制质量分数的聚苯乙烯微球乳液，微球尺寸为1500nm。采用体积比8. 5 1.7的水与乙醇混合液为亚相，将聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面， 静置30min后，滑障以40cm/min的速度压缩。当膜压达到20mN/m时，保持相同膜压30min， 使气液界面上的微球Langmuir膜稳定。采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到聚苯乙烯微球阵列电极。将5mL正硅酸乙酯与60mL乙醇混合，放入恒温磁力搅拌器中剧烈搅拌，将6mL水和lmL5X 10_2mOl/L NaOH的混合溶液用滴管慢慢加入，搅拌IOmin后转移至容量瓶超声lh， 得到二氧化硅溶胶。将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的二氧化硅溶胶液中，在真空干燥器中抽真空6min(真空度< 1.33 )。关闭真空系统使体系恢复常压。取出电极于室温干燥。用乙酸乙酯除去聚苯乙烯微球，即得二氧化硅球腔微电极阵列。称取3mg肌红蛋白溶于ImL PBS (0. lmol/L，pH7. 0)，得到浓度为3g/L的肌红蛋白储备液。取 ο μ L血红蛋白储备液涂于二氧化硅球腔微电极阵列表面，置于20°C下至干成膜，得到用于测定H2A的肌红蛋白修饰二氧化硅球腔微电极阵列生物传感器D。实施例5将氧化铟锡电极依次用丙酮、乙醇、水超声洗涤30min后置于水中保存。以体积比1 1的乙醇水混合液作为溶剂配制质量分数的聚苯乙烯微球乳液，微球尺寸为 1500nm。采用体积比8. 5 2. 12的水与乙醇混合液为亚相，将聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面，静置30min后，滑障以50cm/min的速度压缩。当膜压达到30mN/m时，保持相同膜压30min，使气液界面上的微球Langmuir膜稳定。采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到二维聚苯乙烯微球阵列电极。配制0. 3mol/L硝酸锌和0. lmol/L柠檬酸的混合液，将混合液加热至80°C保温 lh，得到透明均勻的氧化锌前躯体。将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的前躯体中，在真空干燥器中抽真空6min，(真空度< 1.33 )。关闭真空系统使体系恢复常压。将填充了前躯体的聚苯乙烯微球阵列电极于100°C下烘lh，前躯体变成凝胶。用乙酸乙酯溶解掉聚苯乙烯微球后，将电极于马弗炉中以5°C/min的升温速率升至450°C下恒温池，降至室温，得到氧化锌球腔微电极阵列。将3mg血红蛋白溶于ImL PBS (0. lmol/L, ρΗ7. 0)溶液中，配成3g/L血红蛋白储备液，取10 μ L血红蛋白储备液直接滴加在氧化锌球腔微电极阵列表面，置于30°C下至干成膜，得到用于测定H2A的血红蛋白修饰氧化锌球腔微电极阵列生物传感器E。对比应用例测定了制备的5种H2A球腔微电极阵列生物传感器检测H2A时线性范围与检出限，结果如下表所示表1球腔微电极阵列生物传感器性能测试结果
生物传感器线性范围(md/L)检出限(md/L)
生物传感器 A2.0X106 1.2X1025.7X10"7
生物传感器 B6.7x10* 1.3X1037.3X10"7
生物传感器 C3.3xl0^~l.lxl044.1x107
生物传感器 D4.0x10 6~1.4xl022.5X10"7
生物传感器 E3.3x107 3.7x1038.9_ 8通过以上的对比应用例证实，本发明得到的球腔微电极阵列生物传感器具有线性范围宽、检出限低等特点。其原因在于球腔微电极阵列生物传感器具有微电极阵列电化学特征，可有效提高检测讯号的信噪比；球腔内部提供更大的比表面，有利于提高蛋白质的负载量；氧化物球腔亲水性的微环境可很好保持蛋白质的生物和电化学活性；球腔内的微反应区域促进了蛋白质与电极之间的直接电子转移。综合解决了氧化还原蛋白负载量、活性、 蛋白质与电极之间直接电子转移速率、信噪比等问题。上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种球腔微电极阵列生物传感器，其特征在于所述传感器通过以下方法制备(1)通过Langmuir-Blodgett膜方法自组装形成微球Langmuir膜，并将微球Langmuir 膜转移到电极表面形成聚苯乙烯微球阵列电极；所述电极选自金电极、银电极、钼电极、石墨电极、玻碳电极、氧化铟锡导电玻璃；(2)将氧化物前躯体/溶胶填充到聚苯乙烯微球阵列电极的电极与聚苯乙烯微球 Langmuir膜之间空隙内，干燥电极并去除聚苯乙烯微球形成球腔微电极阵列；所述氧化物选自金属氧化物或非金属氧化物；(3)将氧化还原蛋白溶液直接滴涂在球腔微电极阵列上，于挥发至干，得到所需的球腔微电极阵列生物传感器；所述氧化还原蛋白选自氧化酶、脱氢酶或含铁蛋白质。
2.根据权利要求1所述的球腔微电极阵列生物传感器，其特征在于所述金属氧化物选自氧化锌、二氧化硅、二氧化钛、氧化钨。
3.一种球腔微电极阵列生物传感器的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)通过Langmuir-Blodgett膜方法自组装形成微球Langmuir膜，并将微球Langmuir 膜转移到电极表面形成聚苯乙烯微球阵列电极；所述电极选自金电极、银电极、钼电极、石墨电极、玻碳电极、氧化铟锡导电玻璃；(2)将氧化物前躯体/溶胶填充到聚苯乙烯微球阵列电极的电极与聚苯乙烯微球 Langmuir膜之间空隙内，干燥电极并去除聚苯乙烯微球形成球腔微电极阵列；所述氧化物选自金属氧化物或非金属氧化物；(3)将氧化还原蛋白溶液直接滴涂在球腔微电极阵列上，于挥发至干，得到所需的球腔微电极阵列生物传感器；所述氧化还原蛋白选自氧化酶、脱氢酶或含铁蛋白质。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述步骤(1)中Langmuir-Blodgett膜方法包括将电极依次用丙酮、乙醇、水超声洗涤后置于水中保存；以体积比1 0. 5^2的乙醇 水混合液作为溶剂配制质量分数1%的聚苯乙烯微球乳液；采用体积比1 0.广0.25的水与乙醇混合液为亚相，将50(Γ2000 μ L聚苯乙烯微球乳液缓慢滴加到亚相表面，静置 15 30min后，滑障以l(T50Cm/min的速度压缩；当膜压达到l(T30mN/m时，保持相同膜压 5 30min，使气液界面上的微球Langmuir膜稳定；采用垂直提拉法以lmm/min速度将其转移到电极上即得到聚苯乙烯微球阵列电极。
5.根据权利要求3的方法，其特征在于所述步骤(2)的填充方法采用真空填充方法，所述真空填充方法包括将聚苯乙烯微球阵列电极水平放置在制备好的氧化物前躯体/溶胶中，在真空干燥器中抽真空广lOmin，使小球与电极之间的空隙处于真空状态；然后恢复体系中压力，当体系恢复正常压力时，前躯体/溶胶填注到聚苯乙烯微球与电极之间的空隙内。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述步骤(2)当聚苯乙烯微球与电极间空隙内填充氧化物前驱体/溶胶后，将填充了前躯体/溶胶的聚苯乙烯微球阵列电极于3(Γιοο 下烘干lh，使前躯体/溶胶变成凝胶；然后用乙酸乙酯溶解掉聚苯乙烯微球后，3(T500°C加热使凝胶转变为氧化物，得到球腔微电极阵列。
7.根据权利要求3的方法，其特征在于所述步骤(3)中氧化还原蛋白溶液以磷酸盐缓冲液为溶剂。
全文摘要
本发明公开了一种球腔微电极阵列生物传感器，采用将溶解有蛋白质的磷酸盐缓冲液滴涂在球腔微电极阵列表面后挥发至干成膜即得蛋白质修饰球腔阵列生物传感器；所述蛋白质为各种氧化酶、各种脱氢酶、以及所有含铁蛋白质。该生物传感器检测讯号的信噪比高；而且蛋白质的负载量大，大大提高了灵敏度；解决了氧化还原蛋白负载量、活性、蛋白质与电极之间直接电子转移速率、信噪比等问题。
文档编号G01N27/327GK102183561SQ201110041319
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月21日 优先权日2011年2月21日
发明者周丽娟, 周宇, 周群, 孙磊, 尹凡, 池小雷, 陈奠宇 申请人:常熟理工学院
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