专利名称：一种检测空肠弯曲菌的方法
技术领域：
本发明涉及细菌的基因检测，特别涉及空肠弯曲菌的荧光PCR检测。
背景技术：
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是近十几年来被认识的世界范围广泛流行的人兽共患病原菌。鸟、禽、狗、牛、猪等动物是该菌的贮存宿主，其中猪带菌率为30％，奶牛带菌率为10.7％，鸡带菌率高达60％～95％。该菌可引起�：兔嘌蛄鞑鸺Ω窝缀屠豆诓。蛹统邓佬愿窝祝约俺�、犊�：妥兄砀剐旱榷嘀旨膊�。空肠弯曲菌可以通过动物、鸟和患病者的粪便进入环境中，由于该菌对环境较敏感，所以不可能在宿主外存活时间太长，但在水中可以进入一种称为“非可培养状态”(Viable butnon-culturerable，VNC)的休眠期。在条件适宜时，VNC状态的空肠弯曲菌可增殖生长，通过环境及食物链进入人体。接触畜禽类，或食入受到污染的禽制品、水源和牛奶是该菌感染人体的主要媒介。
空肠弯曲菌可引起人体急性肠炎和食物中毒，并引发格林-巴利综合症、反应性关节炎、瑞特氏病和肝炎等严重的并发症。世界卫生组织已将该病列为最常见的食源性传染病之一，并指出必须加强监测各地区空肠弯曲菌在动物和人体中的分布，减少或切断主要传染家禽、家畜及其制品对人体的传播。
建立空肠弯曲菌快速而特异性的分离和检测方法，是有效控制和预防该类“正在发展的食源性病原菌”的关键所在。面对复杂多样的实物样品时，传统的分离鉴定方法需要耗费大量的时间和人力，而且存在敏感性低、难以检测VNC状态的空肠弯曲菌和易出现假阴性结果等问题，这将严重制约对该菌的快速准确检测，因此迫切要求新的检测技术能有效的改变这一状况。
发明内容
本发明旨在提供一种空肠弯曲菌的实时荧光PCR检测方法。该方法利用抗弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌，通过荧光PCR技术分别检测空肠弯曲菌特定的基因，从而达到准确、快速、灵敏检测空肠弯曲菌的目的。
实现本发明方法的技术方案是应用抗血清和磁性微珠制备空肠弯曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌，煮沸法提取空肠弯曲菌的DNA，设计合成用于扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物与探针和/或空肠弯曲菌的马尿酸酶(hipO)基因的引物与探针，通过荧光PCR技术检测得到扩增产物的荧光信号。
其中flaA基因的引物序列为flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’及flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；hipO基因的引物序列为hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’及hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’，所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，二者可构成能量传递结构。
本发明的优点是(1)利用免疫磁珠捕获技术可快速收集、浓缩检样中的目的菌，简便、特异、安全的免疫磁珠法也为分离受损伤或处于VNC状态的空肠弯曲菌提供了一种有效手段，这也是常规培养分离方法所不及的。(2)实时荧光PCR使PCR扩增与产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了对PCR扩增及产物分析的实时监控和自动化操作，无须电泳步骤，避免了交叉污染和假阳性结果。而且实时荧光PCR增加了荧光标记探针与目标序列的杂交步骤，因而专一性更高、结果更准确。(3)免疫磁珠捕获结合实时荧光PCR检测方法，更显示出优越性。免疫磁珠直接分离检样中的靶细菌，除去了PCR抑制物质，提高了畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度；荧光PCR特异性地扩增空肠弯曲菌flaA基因和hipO基因，免疫磁珠吸附的其它杂菌不会干扰PCR结果，解决了亲缘关系很近的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴别难题。
图1为flaA引物及荧光探针的实时PCR特异性试验结果。其中各条曲线表示1.空肠弯曲菌ATCC33560，Ct＝23.248；2.空肠弯曲菌ATCC8341，Ct＝27.147；3.空肠弯曲菌XMIQ030516，Ct＝29.196；4.灭菌超纯水，Ct＝40.00；5.埃希氏大肠杆菌，Ct＝40.00；6.鼠伤寒沙门氏菌，Ct＝40.00；7.结肠弯曲菌，Ct＝40.00；8.单核细胞增生李斯特菌，Ct＝40.00；9.宋氏志贺氏菌，Ct＝40.00。
图2为hipO引物及荧光探针的实时PCR特异性试验结果。其中各条曲线表示1.空肠弯曲菌ATCC33560，Ct＝21.344 2.空肠弯曲菌ATCC8341，Ct＝16.348；3.空肠弯曲菌XMIQ030516，Ct＝16.147；4.空肠弯曲菌XMIQ030827，Ct＝22.796；5.灭菌超纯水，Ct＝40.00；6.埃希氏大肠杆菌，Ct＝40.00；7.结肠弯曲菌，Ct＝40.00。
图3为磁捕获-荧光PCR检测混合菌结果。其中各条曲线表示1.hipO引物及探针的PCR扩增，Ct＝18.766；2.flaA引物及探针的PCR扩增，Ct＝22.038；3.灭菌超纯水，Ct＝40.00。
图4为磁捕获-荧光PCR(hipO引物及探针)检测实物样品结果。其中各条曲线表示1.实物样品-3，Ct＝17.432；2.实物样品-5，Ct＝19.021；3.空肠弯曲菌ATCC33560，Ct＝19.011；4.结肠弯曲菌，Ct＝40.000。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明首先是用抗弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌，磁捕获方法分离空肠弯曲菌特异性高且时间短。磁捕获方法分离空肠弯曲菌采用以下步骤1.免疫磁珠的制备取磁珠液于磷酸缓冲液(PBST)中，混匀，2000～5000rpm离心2～5min，弃液体；重复清洗2～3次后，加入PBST使磁珠重悬其中；加入弯曲菌免疫血清，4℃轻缓旋转振荡15～25h；同上清洗3～5次后，加入PBST使磁珠重悬其中，制备的免疫磁珠悬液于4℃保存备用。
2.空肠弯曲菌的捕获无菌操作取检样至蛋白胨水中，轻缓振荡20～30min；取检样上清液于2000～3000rpm离心2～5min，上清液再次于3000～5000rpm离心15～30min，弃液体，沉淀重悬于PBST中；取检样悬液于装有免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡20～30min；将小管置于磁场旁1～3min，小心移出管中液体；加入PBST混匀，置于磁架或磁场旁3min，移出液体；重复清洗3～5次，加入灭菌超纯水使吸附弯曲菌的磁珠重悬其中。取弯曲菌磁珠悬液，100℃水浴10min，3000～5000rpm离心5～10min，即可获得空肠弯曲菌。
本发明的要点在于设计合成用于扩增及检测空肠弯曲菌的两组引物与探针。第一组探针针对flaA基因，其引物为flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’/flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；第二组针对hipO基因，其引物为hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’/hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’。所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，二者可构成能量传递结构。
3.DNA扩增及实时荧光PCR检测。荧光PCR扩增反应体系含有10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dUTP)，flaA基因引物和/或hipO基因引物，TaqMan探针，DNA糖基化酶(UNG酶)，DNA聚合酶(Taq酶)，细菌DNA模板，灭菌超纯水。扩增或检测时可单独针对flaA基因，也可单独针对hipO基因，也可同时扩增或检测两个基因，即要扩增或检测某个基因，就加入相应的引物及探针。荧光PCR扩增反应条件为50℃/2min，预变性95℃/10min；而后95℃/15s，55℃/60s，共40个循环，不同仪器应将反应参数作适当调整。检测时可设立阳性对照如空肠弯曲菌ATCC33560，阴性对照如结肠弯曲菌和灭菌超纯水的空白对照。反应结束后，打开分析软件，仪器自动给出每个检样的循环阀值(Ct值)，依据所得Ct值对检样进行结果判定。
免疫磁珠的制备与空肠弯曲菌DNA的获取取0.1mL磁珠液(Dynal公司生产的Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG)于1.0mL PBST缓冲液中，混匀，3000rpm离心2min，弃液体；重复清洗2～3次后，加入1.0mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中；加入0.1mL弯曲菌免疫血清，4℃轻缓旋转振荡18h；用1.0mL PBST缓冲液清洗3～5次后，加入0.5mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中，制备的免疫磁珠悬液于4℃保存备用。无菌操作取检样至50mL蛋白胨水中，轻缓振荡30min；取检样上清液于3000rpm离心2min，上清液再次于5000rpm离心20min，弃液体，沉淀重悬于1.0mL PBST缓冲液中；取检样悬液于装有0.1mL免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡30min；将小管置于Dynal MPC-S磁架上3min，小心移出管中液体；加入1.0mL PBST缓冲液混匀，置于磁架上3min，移出洗液；重复清洗3～5次，加入0.1mL PBST缓冲液使吸附弯曲菌的磁珠重悬其中。取50μL弯曲菌磁珠悬液于0.5mL离心管中，100℃水浴10min，5000rpm离心5min，上清液于-20℃条件下保存备用。
合成用于检测空肠弯曲菌的两组引物与探针。第一组探针针对flaA基因，其引物为flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’/flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；第二组针对hipO基因，其引物为hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’/hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’。
实施例1扩增及检测空肠弯曲菌flaA基因的实时荧光PCR取空肠弯曲菌ATCC33560、空肠弯曲菌ATCC8341、空肠弯曲菌XMIQ030516、埃希氏大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、结肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、宋氏志贺氏菌的DNA及灭菌超纯水各2μL，取合成的flaA引物1/2及探针各0.2μL，按照前述的步骤3“DNA扩增及实时荧光PCR检测”中的反应体系及条件进行扩增及检测试验，结果如图1所示，多份空肠弯曲菌DNA均显示阳性结果见图1中曲线1～3；而其它菌株DNA均显示阴性结果，其中包括属内同源程度极高的结肠弯曲菌见图1中曲线7。结果表明，flaA引物及荧光探针对空肠弯曲菌检测特异性高，能有效地鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。
实施例2用于检测空肠弯曲菌hipO基因的实时荧光PCR取空肠弯曲菌ATCC33560、空肠弯曲菌ATCC8341、空肠弯曲菌XMIQ030516、空肠弯曲菌XMIQ030827、埃希氏大肠杆菌、结肠弯曲菌DNA及灭菌超纯水各2μL，取合成的hipO引物1/2及探针各0.2μL，按照前述的步骤3“DNA扩增及实时荧光PCR检测”中的反应体系及条件进行扩增及检测试验，结果如图2所示，多份空肠弯曲菌DNA均显示阳性结果见图2中曲线1～4；而其它菌株DNA均显示阴性结果，其中包括属内同源程度极高的结肠弯曲菌见图A2中曲线6。结果表明，hipO基因引物及荧光探针对空肠弯曲菌检测特异性高，能有效地鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。
实施例3磁捕获-荧光PCR检测混合菌由于实际检样中可能同时带有多种细菌，本实施例对多种混合菌进行实验，针对含有单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、宋氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、腊样芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌、豚鼠气单胞菌、溶藻弧菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、埃希氏大肠杆菌、结肠弯曲菌和空肠弯曲菌ATCC33560等16种细菌的混合样品，细菌磁捕获及DNA提取方法按照实施例1进行，采用实施例2和3的步骤检测空肠弯曲菌的flaA及hipO基因，结果如图3所示，磁捕获-荧光PCR检测方法能抵抗其它细菌干扰，从含有混合菌的样品中检出空肠弯曲菌，排除了包括结肠弯曲菌在内的多种细菌干扰，显示出良好的特异性和抗干扰性，具有实际的应用价值。
实施例4磁捕获荧光PCR方法检测实物样品采集畜禽类实物样品，弯曲菌的磁捕获及DNA提取方法按照前述的步骤进行，本实施例只检测空肠弯曲菌的hipO基因，hipO引物和探针的设计合成及hipO基因的荧光PCR检测与实施例3相同，从27份实物样品中检出2份样品含有空肠弯曲菌，结果显示见图4。
本方法利用抗弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中的目的菌，磁珠捕获的细菌进行DNA抽提；通过荧光PCR技术分别检测空肠弯曲菌的鞭毛蛋白A(flaA)基因和马尿酸酶(hipO)基因。本方法采用的磁捕获结合荧光PCR技术，提高了畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度，解决了亲缘关系很近的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴别难题，达到了准确、快速、灵敏的要求。
权利要求
1.一种检测空肠弯曲菌的方法，利用抗血清免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌，磁珠捕获的细菌进行DNA抽提，其特征在于设计合成用于扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物与探针和/或空肠弯曲菌马尿酸酶(hipO)基因的引物与探针，通过荧光PCR技术检测得到扩增产物相应的荧光信号；其中flaA基因的引物序列为flaA15’-ctgaatttgataccttaagtgcagc-3’/flaA25’-aggcacgcctaaacctatagct-3’，探针序列为5’-tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga-3’；hipO基因引物序列为hipO15’-tgcttctttacttgttgtggcttt-3’/hipO25’-gctcctatgcttacaactgctgaatt-3’，探针序列为5’-caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc-3’，所有探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团，二者可构成能量传递结构。
全文摘要
本发明涉及空肠弯曲菌的荧光PCR检测，提供一种空肠弯曲菌的实时荧光PCR检测方法，应用抗血清和磁性微珠制备空肠弯曲菌免疫磁珠，利用免疫磁珠直接捕获检样中的空肠弯曲菌，煮沸法提取空肠弯曲菌的DNA，设计合成用于扩增空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的引物与探针和/或空肠弯曲菌的马尿酸酶(hipO)基因的引物与探针，通过荧光PCR技术检测得到扩增产物的荧光信号；其中flaA基因的引物序列为flaA15’－ctgaatttgataccttaagtgcagc－3’/flaA25’－aggcacgcctaaacctatagct－3’，探针序列为5’－tgtgaaagaatttatcctaaagatgagcaaggaga－3’hipO基因引物序列为hipO 15’－tgcttctttacttgttgtggcttt－3’/hipO25’－gctcctatgcttacaactgctgaatt－3’，探针序列为5’－caaagcatagtatctcgcaatgttgatcccc－3’，本发明为畜禽等食品中的空肠弯曲菌的检测提供快捷方法。
文档编号G01N33/52GK1598544SQ20041005108
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月13日 优先权日2004年8月13日
发明者刘光明, 韩雅莉, 章跃陵 申请人:汕头大学
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