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专利名称：兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生命科学技术领域，具体涉及为一种兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的制备及应用。
背景技术：
a -乳清蛋白作为乳品中重要的营养成分，约占人乳中总蛋白含量的28%，占乳清白蛋白含量的49%，其蛋白质效率、净蛋白质利用率都高于酪蛋白，是一种极易消化吸收的蛋白质。同时，天然状态下的a-乳清白蛋白，在有C18:1脂肪酸存在下，可以转变成具有杀菌活性的形式。而且a-乳清蛋白富含半胱氨酸和蛋氨酸，它们能维持人体内抗氧化剂的水平，并可促进蛋白质合成，它还富含色氨酸，可促进神经系统发育，并有调节睡眠 和食欲的作用，对该基因内源表达的研究表明，该基因的表达具有很高的组织特异性和发育时期的特异性。a -乳清蛋白是一种小分子质量的酸性钙结合蛋白，等电点在4 5之间，几乎存在于所有的哺乳动物乳汁中，多数a-乳清蛋白含有123个氨基酸，其中包括人、牛、羊、兔等物种，一般该基因的转录单元长度都在2Kb左右，包括4个外显子。a -乳清蛋白在氨基酸序列上与溶菌酶家族同源，X-射线衍射晶体结构分析显示它的三级结构也与溶菌酶相似。a -乳清蛋白在葡萄糖存在条件下，与半乳糖甘转移酶结合在一起，调节该酶的专一性，它限制着乳糖合成复合体的速率，是乳糖合成必需的关键基因，因此a-乳清蛋白被认为具有通过控制乳糖的合成而间接影响乳产量及乳品质的功能。

发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、纯度高、可与人乳腺细胞的a-乳清蛋白发生特异性结合反应的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的制备方法及其应用。本发明的具体实施步骤如下
步骤(I).经DNAStar软件分析后，将人的a -乳清蛋白N端第122~ 141位的20个氨基酸作为兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗体抗原表位，氨基酸序列如下TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys ；
步骤(2).用多肽自动合成仪合成人的a-乳清蛋白多肽并纯化，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成人的a-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白；
步骤(3).将人的a-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔7 ~ 10天；
步骤(4).第三次注射10 ~ 12天后，收集、分离得到含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的血清，ELISA检测血清中兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗体的效价，
所述的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体，其效价在1:60000以上；
步骤(5).将步骤⑵合成并纯化后的人的a-乳清蛋白多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联,形成多肽亲和层析柱；步骤￠).将含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中，并在4°C孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体；
所述的步骤(2)人的a-乳清蛋白多肽的纯化，采用HPLC，可使人的a-乳清蛋白多肽的纯度达到95%以上；
所述的步骤(6)中兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的纯化，采用免疫亲和纯化的方式。兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体初步应用较为广泛，可与人乳腺细胞的a-乳清蛋白发生特异性结合反应，可用于western-blot、免疫组化等试验的要求。本发明有益效果如下
本发明制备的抗a-乳清蛋白多克隆抗体具有特异性好、纯度高的特点、可与人乳腺细胞ct -乳清蛋白发生特异性结合反应,可用于western-blot、免疫组化等实验的要求。本发明兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的制备，为深入研究人a-乳清蛋白的生物学功能和 在乳腺细胞水平调控人的乳汁分泌及品质提供了一个重要工具，具有重要的理论意义和生产价值。


图I为本发明a -乳清蛋白的western-blot分析结果 图2为本发明在人乳腺癌细胞中的免疫组化染色图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例I :
步骤(I).经DNAStar软件分析后，将人的a -乳清蛋白N端第122 一 141位的20个氨基酸作为兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体抗原表位，氨基酸序列如下
TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys ；
步骤(2).用多肽自动合成仪合成人的a-乳清蛋白多肽并纯化，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成人的a-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白；
步骤(3).将人的a-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔7 ~ 10天；
步骤(4).第三次注射10 ~ 12天后，收集、分离得到含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的血清，ELISA检测血清中兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗体的效价，
所述的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体，其效价在1:60000以上；
步骤(5).将步骤⑵合成并纯化后的人的a-乳清蛋白多肽与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联,形成多肽亲和层析柱；
步骤出).将含有兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中，并在4°C孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗体；
所述的步骤(2)人的a-乳清蛋白多肽的纯化，采用HPLC，可使人的a-乳清蛋白多肽的纯度达到95%以上；
所述的步骤(6)中兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体的纯化，采用免疫亲和纯化的方式。兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗体应用I步骤如下步骤(I).蛋白裂解液裂解人乳腺癌组织样品，冰上孵育30 min后，13500g离心45min，获得乳腺癌组织总蛋白；
步骤(2).取5 Ug总蛋白裂解液并加入等体积2 X SDS加样缓冲液，于100°C加热5 min后，进行常规SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为100 g/L ；
步骤(3).电泳结束后，电转至PVDF膜上，用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭I h;
步骤(4).加入I : I 000稀释的兔抗人a-乳清蛋白多克隆抗体，室温下孵育2 h；步骤(5).图I所示，TBST缓冲液洗膜后，加入羊抗兔IgG-HRP抗体，室温下孵育I h，TBST缓冲液洗膜后的图。兔抗人a -乳清蛋白多克隆抗体应用2步骤如下
步骤(I).取人乳腺癌组织石蜡切片，常规脱蜡入水，0. 3%H202-甲醇浸泡30 40分钟，PBS浸洗3次后，0. 1%的凝胶封闭，30 ~ 60分钟后除去多余封闭液； 步骤(2).加入a-乳清蛋白多克隆抗体，37°C I小时或4°C孵育过夜；
步骤(3). PBS洗片3次，每次5分钟，加入羊抗兔IgG-HRP，37°C孵育I小时；
步骤(4).如图2所示，PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后封片镜检，放大400倍拍照记录结果。
权利要求
1.兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备，其特征在于如下步骤 步骤(I).经DNAStar软件分析后，将人的α -乳清蛋白N端第122~ 141位的20个氨基酸作为兔抗人α -乳清蛋白多克隆抗体抗原表位，氨基酸序列如下TyrTrpLeuAlaHisLysAlaLeuCysSerGluLysLeuAspGlnTrpLeuCysGluLys ； 步骤(2).用多肽自动合成仪合成人的α-乳清蛋白多肽并纯化，纯化后与载体蛋白KLH偶联，形成人的α-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白； 步骤(3).将人的α-乳清蛋白多肽-KLH复合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多点注射，先后注射三次，每次间隔7 ~ 10天； 步骤(4).第三次注射10 12天后，收集、分离得到含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的血清，ELISA检测血清中兔抗人α -乳清蛋白多克隆抗体的效价， 所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体，其效价在1:60000以上； 步骤(5).将步骤(2)合成并纯化后的人的α-乳清蛋白多肽与溴化氰活化的Sepharose 4Β偶联,形成多肽亲和层析柱； 步骤(6).将含有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的血清加入到步骤(5)制备的多肽亲和层析柱中，并在4°C孵育过夜后，洗脱抗体，得到兔抗人α -乳清蛋白多克隆抗体； 所述的步骤(2)人的α-乳清蛋白多肽的纯化，采用HPLC，可使人的α-乳清蛋白多肽的纯度达到95%以上； 所述的步骤(6)中兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的纯化，采用免疫亲和纯化的方式。
2.根据权利要求I所述的兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备后的应用，其特征在于该抗体可与人乳腺细胞的α -乳清蛋白发生特异性结合反应，可用于western-blot、免疫组化试验的要求。
全文摘要
本发明公开了兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备与应用。目前没有兔抗人α-乳清蛋白多克隆抗体的制备，本发明方法通过如下步骤制备1)α-乳清蛋白分子N端多肽抗原的合成；2)兔抗人α-乳清蛋白分子多克隆抗体的制备；3)ELISA检测抗血清效价；4)抗血清的纯化；5)α-乳清蛋白多抗的western-blot分析；6)多克隆抗体的免疫组化染色。本发明具有特异性好、纯度高的特点，可与人乳腺细胞的α-乳清蛋白发生特异性结合反应，可用于western-blot、免疫组化等试验的要求。
文档编号G01N33/68GK102633879SQ201110449770
公开日2012年8月15日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者徐宁迎, 沈一飞, 王颖, 郝柱 申请人:浙江大学