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专利名称：一种测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种咪达唑仑及其代谢产物的检测方法，尤其涉及測定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法，属于医学检验领域。
背景技术：
细胞色素P450 (CYP450)是药物在体内代谢重要的酶系，在药物代谢和生物转化过程中起重要作用，主要存在于肝、肠等器官的细胞内质网内。CYP3A作为肝脏CYP家族中主要的亚型，许多外源性和内源性物质都要经过其代谢，临床上使用的药物，约有60%经过CYP3A的代谢，如红霉素、酮康唑以及他汀类药物。研究表明，一些药物与天然产物存在着相互作用，如葡萄柚汁能抑制CYP3A的活性，使得经过CYP3A代谢的药物的生物利用度提高。 因此，CYP3A酶的活性对了解药物代谢及相互作用十分重要。咪达唑仑(MDZ)作为CYP3A的探针药，广泛地用于体内外的研究，I-羟基咪达唑仑(1-0HMDZ)是其主要的代谢产物，通过测定咪达唑仑及其代谢产物含量，计算代谢率可以推测评价CYP3A酶的活性。目前，由于高效液相色谱法具有高效、快速和灵敏的特点，因而广泛用于测定咪达唑仑及其代谢产物的浓度。如赵娜萍等(HPLC法测定大鼠血浆中咪达唑仑的含量及其在药物相互作用研究中的应用，药物分析杂志，2007年第27期)以ー定比例的磷酸盐缓冲液和甲醇作为流动相，该含磷酸盐缓冲液的流动相配制繁琐，而且磷酸盐缓冲液易析出，磷酸盐对仪器和柱子有一定的损害，其采用外标检测法，操作误差会对检测结果造成较大的影响。

发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物I-羟基咪达唑仑浓度的方法，从而应用于CYP3A酶活性的评价。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法，包括如下步骤I)样品预处理取大鼠肝微粒体加入咪达唑仑进行体外孵育，加入含内标物卡马西平的こ腈溶液进行蛋白质沉淀，离心后取上清液20 μ L进样；2)色谱柱分离采用通用型C18色谱柱，填料为Agilent Zorbax SB-C18，流动相为水-こ腈-O. I %三氟こ酸的混合液，该混合液的体积比为44 54 26 36 15 25 ;3)紫外检测采用ニ极管阵列检测器，检测波长为230nm,流速为I. OmL · mirT1,柱温为40°C,测定峰面积，用标准曲线方程计算咪达唑仑及其代谢产物的浓度。所述的代谢产物为I-羟基咪达唑仑。在步骤(2)所述的色谱条件下，I-羟基咪达唑仑、咪达唑仑以及内标卡马西平的保留时间分别为3 4min、4 5min、7 8min。
采用本发明的方法具有以下优点(I)样本预处理采用こ腈沉淀法直接处理样品，省略了提取的步骤，快速简易，蛋白沉淀效果好，而且能很好地终止微粒体的反应，适合体外孵育实验。(2)流动相选用水-こ臆-O. I %三氟こ酸的混合液作为流动相，离子对试剂三氟こ酸的使用可改善I-羟基咪达唑仑、咪达唑仑以及卡马西平色谱峰峰形不对称、峰展宽和拖尾现象，取得了良好的分离效果，理论塔板数达到10000以上，可同时检测咪达唑仑及其代谢产物的浓度。(3)内标法使用卡马西平为内标，減少了操作误差对检测结果带来的影响，卡马西平的保留时间在7 8min左右，每个样本的分析时间在9分钟以内。本发明的样本处理简便、检测灵敏快速，对肝微粒体中咪达唑仑和I-羟基咪达唑仑的浓度可同时进行检测，可以应用于CYP3A酶活性的评价研究。本发明中咪达唑仑的线 性范围为O. 06 12μ g · mじ1，ト羟基咪达唑仑的线性范围为O. 06 3μ g · mじ1，提取回收率在95%以上，日内日间精密度标准偏差均小于10%。


图I为咪达唑仑肝微粒体孵育后样本的色谱图。其中，I为I-羟基咪达唑仑，2为咪达唑仑，3为卡马西平(内标物)。
具体实施例方式色谱条件色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18 (4. 6mm x 150mm 5 μ m);保护柱为SB-C18 (4.6X12. 5mm，5 μ m，Agilent, USA);流动相为水-こ腈-O. I %三氟こ酸的混合液，该混合液的体积比为49 : 31 : 20，流速为I. Oml · mirT1 ;进样量为20 μ L ;检测器为ニ极管阵列检测器(DAD);柱温为40°C ;检测波长为230nm。肝微粒体制备采用差速离心法制备肝微粒体。将大鼠断头处死，迅速取出肝脏，用冰冷的生理盐水清洗，滤纸吸干后称重，每IOg肝脏加入25mL蔗糖PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)，在冰浴中充分匀浆。取匀浆液10，OOOg离心15min，取上清液再次10，OOOg离心15min，取上清，100, OOOg离心90min ;弃上清液，沉淀用IOmL的PBS复溶，_80°C分装保存，以上所有操作在低于4°C环境中进行。用BCA法(双辛可宁酸法)测定微粒体蛋白含量为20mg · mL 1 ο肝微粒体体外孵育及样品的处理吸取微粒体10 μ L于I. 5mL的EP管，加入MDZ标准液25 μ L和PBS缓冲液215 μ L，于37°C水浴预孵育5min后，加入20mMNADPH 10 μ L启动反应，继续孵育5min后,置于碎冰中，加入200 μ L的こ腈以终止反应。再加入5 μ g ·ηιじ1的卡马西平内标工作液，润旋混勻2min后13，OOOrpm离心IOmin,取上清液于自动进样器的进样瓶中，设定20yL进样。标准曲线配制MDZ 浓度分另Ij 为 O. 06,0. 12,0. 3,0. 6、I. 2、3、6、12μ g · mじ1 和1-0HMDZ浓度为O. 06,0. 12,0. 2,0. 3,0. 6、I. 2、2、3 μ g · mじ1的微粒体孵育体系，按上述样品的处理方法操作，测定对MDZ面积As1U-OHMDZ面积As2、内标峰面积Ai。以As1Ai为纵坐标(Y1)，以MDZ对应各点浓度为横坐标(X1)绘制MDZ的标准曲线。以ksjki为纵坐标(y2)，以1-0HMDZ对应各点浓度为横坐标(X2)绘制1-0HMDZ的标准曲线。MDZ的标准曲线回归方程为W = O. 9157x「0. 1157 (r = O. 9996) ；I-OHMDZ的标准曲线回归方程为y2 =I. 2251χ2-0· 0691 (r = O. 9996)。提取回收率配制低、中、高三种浓度(MDZ浓度为O. 12，O. 6,6. OOyg-mじ1和1-0HMDZ浓度为O. 12，O. 3，2. 00 μ g · mじ1)微粒体孵育体系，每种浓度6份，处理后检测，记录MDZ和1-0HMDZ的峰面积，为微粒体孵育体系的峰面积。另取I. 5mL EP管6支，两个ー组；每组配制成终浓度与低、中、高三种浓度(MDZ浓度为O. 12，O. 6,6. OOyg-mじ1和1-0HMDZ浓度为O. 12,0. 3,2. 00 μ g · πιΓ1)相同的标准品溶液，20 μ L进样检测；记录不同浓度MDZ和1-0HMDZ的峰面积，为纯标的峰面积。计算微粒体孵育体系的峰面积与纯标的峰面积的比值，即为提取回收率，见表I。表I肝微粒体孵育体系MDZ和1-0HMDZ的提取回收率结果(η = 6，mean土SD)
权利要求
1.一种测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法，其特征在于包括如下步骤 1)样品预处理 取大鼠肝微粒体加入咪达唑仑进行体外孵育，加入含内标物卡马西平的有机溶剂进行蛋白质沉淀，离心后取上清液20 y L进样； 2)色谱柱分离 采用通用型C18色谱柱，填料为Agilent Zorbax SB-C18，流动相为水-乙腈-0. I %三氟乙酸的混合液,该混合液的体积比为44 54 : 26 36 : 15 25 ; 3)紫外检测 采用二极管阵列检测器，检测波长为230nm，流速为I. OmL mirT1，柱温为40°C，测定峰面积，用标准曲线方程计算咪达唑仑及其代谢产物的浓度。
2.根据权利要求I所述的测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法，其特征在于所述的代谢产物为I-羟基咪达唑仑。
3.根据权利要求I所述的测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法，其特征在于所述步骤(I)中的有机溶剂为乙腈。
4.根据权利要求I或2所述的测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法，其特征在于在步骤(2)所述的色谱条件下，代谢产物I-羟基咪达唑仑、咪达唑仑以及内标卡马西平的保留时间分别为3 4min、4 5min、7 8min。
全文摘要
本发明涉及一种测定肝微粒体中咪达唑仑及其代谢产物浓度的方法，包括如下步骤1)样品预处理；2)色谱柱分离采用通用型C18色谱柱，填料为Agilent Zorbax SB-C18，流动相为水-乙腈-0.1％三氟乙酸的混合液，该混合液的体积比为44～54∶26～36∶15～25；3)紫外检测采用二极管阵列检测器，检测波长为230nm，流速为1.0mL·min-1，柱温为40℃，测定峰面积，用标准曲线方程计算咪达唑仑及其代谢产物的浓度。本发明的样本处理简便、检测灵敏快速，对肝微粒体中咪达唑仑和1-羟基咪达唑仑的浓度可同时进行检测，可以应用于CYP3A酶活性的评价研究。本发明中咪达唑仑的线性范围为0.06～12μg·mL-1，1-羟基咪达唑仑的线性范围为0.06～3μg·mL-1，提取回收率在95％以上，日内日间精密度标准偏差均小于10％。
文档编号G01N30/02GK102706972SQ20121001165
公开日2012年10月3日 申请日期2012年1月15日 优先权日2012年1月15日
发明者徐涛, 王勇, 王哲, 胡国新, 邱相君 申请人:河南科技大学