专利名称：一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白的方法，特别涉及一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品方法。
背景技术：
黄酒是世界三大酿造酒之一，“以麦制曲，用曲酿酒”是中国黄酒的特色，也是我国黄酒酿造工艺中一项传统的操作工艺。目前黄酒生产用曲主要是生麦曲和熟麦曲。生麦曲采用的是传统制曲工艺，利用生小麦，以自然培养为主，网罗自然界中的微生物在小麦表面生长繁殖并代谢产生各种代谢产物，形成其独特的风格。在黄酒酿造应用中，所酿的酒香气较浓，口味醇厚，但存在进入主酵时间迟，发酵缓慢，残糖高，压榨困难，原料利用率低等缺点。熟麦曲是对生麦曲生产工艺的继承和发展，其生产工艺的不同之处是将小麦加热蒸熟， 杀死小麦中的微生物，然后接种米曲霉进行纯种培养。在实际生产应用中，能够加快黄酒发酵，提高原料利用率，但存在口感较淡，杂味较重，与传统的黄酒特有风味有一定差别。目前造成这些优缺点的原因至今尚未阐明。有研究表明，生麦曲与熟麦曲由于制曲工艺的不同导致微生物来源的胞外分泌蛋白种类存在很大的差异。目前国内针对黄酒麦曲微生物胞外分泌蛋白研究较少，且主要是利用色谱技术对麦曲中单一酶类进行纯化并开展酶学性质的研究，而通过类似方法无法全面获得麦曲中微生物胞外蛋白的组成信息。宏蛋白质组学是最近几年被提出的新概念，其定义是指对某一特定中环境中微生物群落的所有蛋白质进行大规模的分析和鉴定。宏蛋白质组学的研究策略与经典的蛋白质组学研究策略相似，主要包括环境总蛋白的提取制备、 蛋白质分离以及质谱鉴定和数据库搜索3个步骤。应用宏蛋白质组学理论，利用双向电泳技术对从绍兴黄酒熟麦曲中浸提出的所有可溶性蛋白(即米曲霉分泌的胞外蛋白)进行高分辨率分离，将为后续利用质谱分析手段大规模鉴定麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白，并进一步在酶学水平弄清生麦曲与熟麦曲差异性奠定基础。选择合适的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素之一，制备方法选择不当， 会造成大量盐离子和其他干扰物质残留，严重影响等电聚焦，从而影响双向电泳的结果。熟麦曲中米曲霉胞外的分泌蛋白必须尽可能从固态麦曲中利用缓冲体系全部浸提出来，同时还要除去多糖、脂类、核酸等干扰双向电泳的杂质，并需尽量避免目标蛋白样品的降解。迄今为止，还没有制备熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的有效方法和技术，从而导致利用蛋白组学技术进行黄酒熟麦曲微生物胞外酶的相关研究一直停滞不前。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备较高质量的绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案包括以下步骤
1)称取一定质量的绍兴黄酒熟麦曲，加入适当体积浓度为0. lmol/L, pH4. 2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片，在4°C条件下浸提4-12h;然后使用4层纱布过滤，所得滤液利用高速冷冻离心机以12000r/min转速离心30min，收集上清液；2)将步骤1)中得到的上清液经过微孔滤膜过滤两次，使用超滤管进行浓缩去盐。3)吸取步骤2)中制得的样品提取液100 μ L加到1. 5mL离心管中，使用clean up kit试剂盒按照产品说明书进行样品处理，最终获得样品沉淀。4)向步骤3)中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液(8mol/L尿素、0.02g/mL 的CHAPS、体积百分含量为0. 5%的IPG缓冲液、0. 002g/mL的溴酚蓝，50mmol/L DTT)，室温下充分溶解，离心取上清液，上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品；所述步骤1)中绍兴黄酒熟麦曲用量5-15g/20mL，优选为10g/20mL。所述步骤1)中在4°C条件下浸提麦曲12h。所述步骤2)中微孔滤膜的直径为0. 45 μ m。所述步骤2)中超滤管的截留分子量为lOKDa，以7000r/min转速离心60min来浓
缩样品提取液。所述步骤幻中clean up kit试剂盒处理样品程序如下加入300 μ L沉淀试剂I 于离心管中，混合振荡，冰上静置15min ；加入300yL沉淀试剂II于离心管中，混合振荡； 以12500r/min转速离心5min来沉淀蛋白质，离心结束后，倾倒上清液；加入40 μ L洗液I 于离心管底，混合振荡；以12500r/min转速离心5min来沉淀蛋白质，离心结束后，倾倒上清液；加入25 μ L超纯水于离心管底，混合振荡IOs ；加入ImL的洗液II禾Π 5 μ L的洗液II 添加剂于离心管中，振荡Imin ；将离心管在-20°C下放置30min，放置过程中每IOmin振荡 30s ；冷冻结束后，以13000r/min转速离心5min，倾倒上清液，蛋白沉淀在室温条件下，空气干燥3min。所述步骤4)中制得蛋白沉淀与样品裂解液的质量体积比为 150 μ g/200 μ L-250 μ g/200 μ L,优选为 200 μ g/200 μ Lo发明人通过长时间的科学研究，发现具有较低离子强度的弱酸性缓冲液提取绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉的胞外分泌蛋白，能最大限度地提取出含有目标蛋白的样品。采用 clean up kit试剂盒法来沉淀蛋白质，可以有效地去除盐离子、多糖、脂类、核酸等干扰电泳效果的物质。使用的样品裂解液中，尿素作为变性剂能破坏蛋白质的高级结构，打断非共价连接。CHAPS是一种兼性去污剂，能打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用，增加蛋白质的溶解性。加入二硫苏糖醇是为了打断二硫键，并使所有蛋白质处于还原状态。IPG缓冲液能通过电荷与电荷之间的反应减少蛋白质结合，从而增加蛋白质的可溶性。本发明制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
图1为绍兴黄酒熟麦曲米曲霉分泌胞外蛋白的双向电泳图谱
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法实施例11、样品制备1)称取IOg浙江绍兴某黄酒厂生产的的熟麦曲，加入20mL浓度为0. lmol/L， PH4.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片，在4°C条件下浸提12h ；然后使用4层纱布过滤，所得滤液利用高速冷冻离心机以12000r/min转速离心 30min，收集上清液，此上清液为粗酶提取液。2)将步骤1)中得到的上清液经过0. 45 μ m微孔滤膜过滤两次，使用截留分子量为 IOKDa超滤管以7000r/min转速离心60min，进行浓缩去盐。3)吸取步骤2)制得样品提取液100 μ L加到1. 5mL离心管中，使用clean up kit 试剂盒按照产品说明书进行样品处理，最终获得样品沉淀。4)向步骤3)中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液(8mol/L尿素、0.02g/mL 的CHAPS、体积百分含量为0. 5%的IPG缓冲液、0. 002g/mL的溴酚蓝，50mmol/L DTT)，室温下充分溶解，然后12000r/min离心IOmin取上清液，上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品。2、电泳检测1)水化上样吸取125 μ L含有蛋白样品水化液，加入到IPG胶条再泡涨盘中，将 PH3-10NL, 7cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液之间的气泡，加入2mL矿物油覆盖胶条，水化12h。幻等电聚焦水化结束后将胶条转移至Ettan H^hor胶条槽中，进行等电聚焦。等电聚焦程序设置为St 印，50VX0. 5h ；Gradient, 250VX Ih ；Gradient, 500VX Ih ； Gradient, 1000VX 0. 5h ；Gradient, 5000VX 2h ；Step, 5000V, IOOOOVh ；St�。�500VX 3h。3)胶条平衡将聚焦好后的IPG胶条进行平衡。采用两步平衡法，每次平衡15min， 平衡缓冲液配制如下胶条平衡缓冲液母液6mol/L尿素，质量体积比2%十二烷基磺酸钠SDS，50mmol/ L ρΗ8· 8的Tris-Hcl，体积比30%甘油，体积比0. 002%溴酚蓝，溶剂为水。胶条平衡缓冲液I 每IOmL胶条平衡缓冲液母液加入IOOmg DTT。胶条平衡缓冲液II 每IOmL胶条平衡缓冲液母液加入250mg IAA。4) SDS-PAGE电泳分离胶浓度为12. 5% (10cmX8cmX 1mm)，将平衡结束后的IPG 胶条转移至已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端，用质量体积比0. 5%低熔点琼脂糖封住顶部，以恒流方式进行电泳先IOmA电泳lOmin，然后电流调至20mA。当溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。5)凝胶染色、脱色剥离凝胶，置于固定液(50%乙醇，10%乙酸)固定Ih后，换到考马斯亮蓝染色液(0. 025%考马斯亮蓝R-250，25%乙醇，10%乙酸)中染色4h，换脱色液 (10%甲醇，10%乙酸)中脱色，直至背景为无色透明，蛋白点清晰为止。
6)使用GE公司的hagescarmerIII扫描仪对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、拍照。双向电泳结果如图1所示，结果表明该绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白样品的制备和分离效果较好，最终获得了分辨率较高，重复性较好的双向电泳图谱(图1)。实施例21、样品制备1)称取5g浙江绍兴某黄酒厂生产的的熟麦曲，加入20mL浓度为0. lmol/L, pH42 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片，在4°C条件下浸提4h ；然后使用4层纱布过滤，所得滤液利用高速冷冻离心机以12000r/min转速离心30min，收集上清液，此上清液为粗酶提取液。2)将步骤1)中得到的上清液经过0. 45 μ m微孔滤膜过滤两次，使用截留分子量为 IOKDa超滤管以7000r/min转速离心60min，进行浓缩去盐。3)吸取步骤2)中制得样品提取液100 μ L加到1. 5mL离心管中，使用clean up kit试剂盒按照产品说明书进行样品处理，最终获得样品沉淀。4)按照150 μ g/200 μ L比例向步骤3)中制得的蛋白沉淀加入样品裂解液(8mol/ L尿素、0. 02g/mL的CHAPS、体积百分含量为0. 5 %的IPG缓冲液、0. 002g/mL的溴酚蓝， 50mmol/L DTT)，室温下充分溶解，然后12000r/min离心IOmin取上清液，上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品。2、电泳检测1)水化上样吸取125 μ L含有蛋白样品水化液，加入到IPG胶条再泡涨盘中，将 PH3-10NL, 7cm的IPG胶条胶面向下放入盘中，除去胶面与样品液之间的气泡，加入2mL矿物油覆盖胶条，水化12h。幻等电聚焦水化结束后将胶条转移至Ettan H^hor胶条槽中，进行等电聚焦。等电聚焦程序设置为St �。�50VX0. 5h ；Gradient, 250VX Ih ；Gradient, 500VX Ih ； Gradient, 1000VX 0. 5h ；Gradient, 5000VX 2h ；Step, 5000V, IOOOOVh ；St�。�500VX 3h。3)胶条平衡将聚焦好后的IPG胶条进行平衡。采用两步平衡法，每次平衡15min， 平衡缓冲液配制如下胶条平衡缓冲液母液6mol/L尿素，质量体积比2%十二烷基磺酸钠SDS，50mmol/ L ρΗ8· 8的Tris-Hcl，体积比30%甘油，体积比0. 002%溴酚蓝，溶剂为水。胶条平衡缓冲液I 每IOmL胶条平衡缓冲液母液加入IOOmg DTT。胶条平衡缓冲液II 每IOmL胶条平衡缓冲液母液加入250mg IAA。4) SDS-PAGE电泳分离胶浓度为12. 5% (10cmX8cmX 1mm)，将平衡结束后的IPG 胶条转移至已聚合的聚丙烯酰胺凝胶胶面顶端，用质量体积比0. 5%的低熔点琼脂糖封住顶部，以恒流方式进行电泳先IOmA电泳lOmin，然后电流调至20mA。当溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部时，关闭电源，结束电泳。5)凝胶染色、脱色剥离凝胶，置于固定液(50%乙醇，10%乙酸)固定Ih后，换到考马斯亮蓝染色液(0. 025%考马斯亮蓝R-250，25%乙醇，10%乙酸)中染色4h，换脱色液 (10%甲醇，10%乙酸)中脱色，直至背景为无色透明，蛋白点清晰为止。6)使用GE公司的hagescarmerIII扫描仪对脱色后的双向电泳凝胶进行扫描、拍照。结果表明该绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白样品的制备和分离效果较好， 双向电泳图谱与图1高度相似。虽然本发明已以较佳实例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法，包括以下步骤1)称取一定质量的绍兴黄酒熟麦曲，加入适当体积浓度为0.lmol/L，pH4.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，同时加入一片蛋白酶抑制剂混合片，在4°C条件下浸提4-1 后使用4层纱布过滤，所得滤液利用高速冷冻离心机以12000r/min转速离心30min，收集上清液；2)将步骤1)得到的上清液经过微孔滤膜过滤两次，使用超滤管进行浓缩去盐；3)吸取步骤2)制备的样品提取液100μ L加到1. 5mL离心管中，使用美国Bio-Rad公司生产的clean up kit试剂盒，按照产品说明书进行样品处理，最终获得样品沉淀；4)向步骤幻中制得的蛋白沉淀加入适量的样品裂解液，室温下充分溶解，离心取上清液，上清液即为绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉分泌的胞外蛋白双向电泳样品。
2.根据权力要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中绍兴黄酒熟麦曲用量 10g/20mLo
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中在4°C条件下浸提麦曲12h。
4.根据权力要求1所述的方法，其特征在于所述步骤幻中微孔滤膜的直径为 0. 45 μ m.。
5.根据权力要求1所述的方法，其特征在于所述步骤幻中超滤管截留分子量为 IOKDa,以7000r/min转速离心60min来浓缩样品提取液。
6.根据权力要求1所述的方法，其特征在于所述步骤4)中制得蛋白沉淀与样品裂解液的质量体积比为 150 μ g/200 μ L-250 μ g/200 μ L。
7.根据权力要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白沉淀与样品裂解液的质量体积比为优选为200 μ g/200 μ L。
8.根据权力要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述样品裂解液含有8mol/L尿素、 0. 02g/mLCHAPS、体积百分含量为 0. 5%的 IPG 缓冲液、0. 002g/mL 溴酚蓝、50mmol/L DTT0
全文摘要
本发明公开了一种制备绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法。该方法选取乙酸-乙酸钠缓冲溶液低温浸提麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白，通过clean up kit试剂盒来处理样品提取液，获得纯净的样品蛋白沉淀，最后加入样品裂解液制备出适合双向电泳的高质量样品。本发明制备出绍兴黄酒熟麦曲中米曲霉胞外分泌蛋白双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
文档编号G01N1/28GK102359900SQ20111027098
公开日2012年2月22日 申请日期2011年9月14日 优先权日2011年9月14日
发明者张波, 管政兵, 陆健 申请人:江南大学
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