专利名称：用于β-淀粉样肽的改进检测的方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫测定领域，并且更具体地，涉及用于增加测定生物流体中的 β-淀粉样肽的免疫测定的灵敏度的方法。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是一种中枢神经系统的进行性·退行性疾�。涮卣魇墙行缘暮筒欢显黾拥募且渖ナВ艚幼攀巧ナФ灾搴蜕硖骞δ艿目刂撇⒆钪账劳觥Ｆ涫浅沾糁⒆畛＜牟∫颍跋�1-6%的65岁以上人群和10-20%的80岁以上人群。AD与其他类型痴呆症的区别在于几个病理学特征，包括患者大脑中在神经元之间的细胞外隙中进行性地出现老年斑。该斑块具有淀粉样蛋白沉积物的中心核，其主要由被变性神经炎和胶质细胞包绕的称为淀粉样β肽(Αβ)的40-42个氨基酸肽的原纤维形成。 此肽由称为β淀粉样蛋白前体蛋白(βΑΡΡ)的前体蛋白的蛋白水解而成。AD可以根据出现的年龄分为早发型(60岁以下的年龄)和迟发型(60岁以上的年龄)，根据常染色体显性遗传的存在分为家族性AD或散发性AD。AD的早发家族形式可能与βΑΡΡ编码基因早老素I和早老素2(分别位于染色体21、14和I上)的已知突变有关。 这些分类不相互排斥。最常见的形式是散发性迟发形式。在临床惯例中，使用基于典型临床标志的存在的临床标准并使用神经影像技术和血液分析排除其他类型痴呆症进行AD的诊断。使用这些标准，诊断的可靠性是可接受的， 但是根据使用脑组织活检完成的研究，10-20%的被诊断有AD的患者患有不同的疾病。而且，目前的诊断方法仅可以在神经变性过程进展到患者患有严重的痴呆症并且大脑损害广泛到治疗措施数目有限的地步时才可进行。明确诊断需要尸检脑组织的病理学检查。鉴于Αβ在AD患者的大脑中积累并且是AD发病机制的中心要素的事实，此蛋白已经被认为是作为AD生物标志物的最合适候选物。然而，Αβ作为AD的血浆生物标志物的使用面临着这样的问题，即Αβ肽(Αβ (1-40)和Αβ (1-42))在血清中的浓度极低，使得没有足够灵敏以便允许可靠检测所述肽物种的测定方法。已经使用不同的测量来测定生物样品中的β_淀粉样肽水平(参见，例如，由 Scheuner 等(Nature Med. ,1996,2 :864-870) ；Tamaoka A 等(J Neurol Sci. ,1996,141， 65-68) ；Suzuki, N.等(Science，1994，264 :1336-1340) ；W0200722015, Vanderstichele H 等(Amyloid,2000,7,245-258) ；Fukomoto y col. (Arch. Neurol. 2003,60,958-964)； Mehta et al. (Arch. Neurol. 57,2000,100-105) ；Mayeux, R.等(Ann Neurol. 1999,46, 412-416) ；Lanz, T. A 和 Schacthter, J. B. (J. Neuroscience Methods, 2006，157 :71-81), W0200750359, W00162801, W00315617, W00246237, W00413172 所述的方法。然而，目前已知的所有基于ELISA的测定具有较小的检测限，其最大也达不到单位数的pg/mL的范围，其适于检测CSF中的A β 40和A β 42以及检测患有家族性AD的患者血浆中的所述物种，但不适合于检测患有散发性AD的患者血浆中的A β 42，在散发性AD中A β 42血浆浓度低得多。至今，显示检测限低于单位数pg/mL的唯一的A β肽测定对应于W0200646644中和TO2009015696中所述的测定。W0200646644描述了一种电致化学发光(ECL)夹心测定，其中mAb 21F12(识别 Αβ42的氨基酸33-42)与磁珠偶联，然后磁珠用来捕获含有A β 42的样品中的A β 42肽并进一步和与钌复合物偶联的3D6mAb接触。然后当施加电能时通过由钌复合物发射的光检测结合的3D6抗体的量。使用此测定，该发明人能够检测低至O. 5pg/mL的Αβ 42标准品。 然而，当使用同一测定来比较来自AD患者和健康对照的血浆样品中的A β 42时，在两组患者之间没有观察到显著的差异，这使得该发明人得出结论血清中完整Αβ 42的量由于降解而非常低，并且转为使用21F12mAb的竞争性ELISA测定，该测定提供ng/mL范围内的较低灵敏度水平。W02009015696描述了一种高灵敏度ELISA夹心测定，其中检测抗体与生物素标记的显示对所述抗体有特异性的试剂接触。该试剂和与过氧化物酶偶联的链霉亲和素接触。 然后通过使用TMB的比色法检测或使用QuantaBlue荧光检测过氧化物酶活性。W02006053251描述了一种测定样品中的β -淀粉样肽物种的方法，该方法包括使样品与变性剂接触，从样品-变性剂混合物中提取肽混合物，将β -淀粉样肽从该混合物中分离，并测定β_淀粉样肽物种的量。该方法在测定前需要分离肽的步骤，这导致增加的处理时间和增加的成本。
因此，在本领域中存在着对用于检测Αβ -衍生肽的改进的免疫学测定和试剂盒的需求，所述免疫学测定和试剂盒克服本领域中已知的方法和试剂盒的问题，具体地，它们足够灵敏从而以可靠的方式检测患有散发性AD的患者的血浆中的Αβ肽。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及一种诊断受试者中的神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述方法包括以下步骤⑴确定选自由下列各项组成的组的一种或多种参数(a)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的淀粉样肽的水平，(b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述 一种或多种β -淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β_淀粉样肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种β-淀粉样肽的量来确定，(C)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种淀粉样肽的水平， 其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定；(ii)将参数(b)或(C)中的至少一个的值或由参数(a)至(C)中的至少两个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或(C)或所述计算参数的值的参比值进行比较；以及(iii)当相对于所述参比值所述参数的值或所述计算参数的值存在改变时,诊断所述神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。在第二个方面，本发明涉及一种用于测定生物样品中的β_淀粉样肽的试剂盒， 其包含(i)蛋白增溶剂，和(ii)至少一种针对β -淀粉样肽的抗体。
图I A-F.对在两个外部实验室(Labl和Lab2)获得的(A)UP Αβ 1-40, (B) DPAβ 1-40，(C)CBAβ I-40，(D)UP Αβ I-42，(E)DP Αβ 1-42 和(F)CB Αβ 1-42 的测量值的点阵图。大多数点靠近索引线(concordance line)，表明了测量值极大程度至几乎完全程度的一致性。在每个图表中的右下部插入指明了一致性相关系数(CCC)和95%置信区间。图2 :Α β 1-40 (A)，A β 1-42 (B)的直接标志物以及 A β 1-40 和 A β 1-42 (C)的计算 标志物。Α.在健康对照(HC)，患有轻度认知损害(MCI)的患者和患有阿尔茨海默病(AD) 的患者中以pg/ml计的血清中游离的A β 1-40 (FP)，血浆中的总A β 1-40水平(包括游离的 Αβ 1-40和与血浆成分结合的Aβ 1-40) (TP)以及与细胞结合的Aβ 1-40 (CB)的浓度。B.在健康对照(HC)，患有轻度认知损害(MCI)的患者和患有阿尔茨海默病(AD)的患者中以pg/ ml计的血清中游离的A β 1-42 (FP)，血浆中的总A β 1_42水平(包括游离的A β 1_42和与血浆成分结合的A β 1-42) (TP)以及与细胞结合的A β 1-42 (CB)的浓度。C.以pg/ml计的总血浆Αβ 1-40(通过将血浆样品与蛋白增溶剂接触获得)加上与细胞结合的Αβ 1-40 (TP+CB Αβ 1-40)的合计值，总血浆Αβ 1-42(通过将血浆样品与蛋白增溶剂接触获得)加上与细胞结合的 Αβ 1-42 (TP+CB Αβ I-42)的合计值，或TP+CB Αβ 1-40和Αβ 1-42 (TP+CB Αβ I-42) 的合计值。Η、Μ和A分别表示与HC、MCI和AD相比显著(p < O. 05)。*表示p<0.01。图3 :A-F. HC、MCI 和AD受试者中的(A)DPAβ 1-40, (B)CB Αβ I-40，(C)UPAβ I-42， (D)DP A β 1-42，(E) T40和(F) T- β APB值的点阵图。*旁边的数值指示MCI和AD组中的异常值，为了清楚地表示，其以与纵轴不同的刻度表示。水平线表示MCI和HC之间的截止值。图4 :患有MCI/HC的患者中lab40标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积=O. 510。图5 :患有MCI/HC的患者中2ab40标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积=O. 778。图6 :患有MCI/HC的患者中3ab40标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积=O. 458。图7 :患有MCI/HC的患者中lab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积=O. 576。图8 :患有MCI/HC的患者中2ab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积=O. 667。图9 :患有AD/HC的患者中3ab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积=O. 744。图10 :患有MCI/HC的患者中3ab42标志物的ROC曲线。ROC曲线下面积=O. 508。图11 :患有MCI/HC的患者中2ab40+3ab40标志物的ROC曲线。曲线下面积为 O. 830。图12 :患有AD/HC的患者中2ab42+3ab42标志物的ROC曲线。曲线下面积为O. 713。图13 :患有MCI/HC的患者中2ab42+3ab42标志物的ROC曲线。曲线下面积为ROC O. 777。图14 MCI/HC的2ab40+3ab40+2ab42+3ab42标志物的ROC曲线。曲线下面积为O.848。
具体实施例方式本发明的作者已经惊奇地发现用样品缓冲液稀释血浆导致Αβ 1-40和Αβ 1-42的可检测水平升高。不希望受任何理论约束，相信血浆的稀释导致样品内的离子强度和分子相互作用的改变，引起与血浆蛋白和其他成分结合的Αβ 1-40和Αβ 1-42的释放。因此，在血浆稀释后测量值的增加可能是由于检测到从蛋白和其他血浆成分释放的Αβ肽所引起的，并且可能被解读为血浆中Αβ总水平的估计值。无论如何，这些结果显示血液中的A β肽水平比由简单地测定其在未稀释血浆中的水平所估计的值高得多。总β APB血液水平的完整测定应当包括定量血浆中游离的肽， 与血浆蛋白结合的肽和与血细胞结合的肽。这种对β APB的不同成分的综合定量将得到 Αβ血液水平的更精确量度并且可能有助于明确健康和疾病中Aβ肽的复杂调节作用。此夕卜，所述淀粉样肽池的水平以及通过将不同池的浓度与游离淀粉样肽的浓度算术组合得到的某些计算参数的值可以用于确定患者是否患有神经退行性疾�。颊呤欠翊τ谏窬诵行约膊≈暗淖刺徒窬诵行约膊∮肷窬诵行约膊≈暗淖刺嗲�。本发明的诊断方法 因此，在第一个方面，本发明涉及诊断受试者中的神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述方法包括以下步骤(i)确定选自由下列各项组成的组的一种或多种参数(a)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的淀粉样肽的水平，(b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述一种或多种β -淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β_淀粉样肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种β-淀粉样肽的量来确定，(C)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种淀粉样肽的水平， 其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定；以及(ii)将参数(b)或(C)中的至少一个的值或由参数(a)至(C)中的至少两个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或(C)或所述计算参数的值的参比值进行比较；以及(iii)当相对于所述参比值所述参数的值或所述计算参数的值存在改变时,诊断所述神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。术语“诊断”当在本文中使用时包括评估受试者对疾病的易感性，确定受试者目前是否具有所述疾�。约笆芩黾膊∮跋斓氖苁哉叩脑ず蟆１玖煊蚣际跞嗽币斫獾氖牵庵制拦劳ǔ６杂谝姓锒系氖苁哉呃此挡豢赡�100%正确，尽管优选是100%正确的。然而，该术语要求统计学显著部分的受试者可以被鉴别为患有该疾病或具有该疾病的易患倾向。如果一部分是统计学显著的，则其可以由本领域技术人员使用几种公知的统计学评价工具，例如，确定置信区间，确定P值，t检验,Mann-Whitney检验等简单地确定。细节参见 Dowdy 和 Wearden, Statistics for Research, John ffiley&Sons, New York 1983。优选的置信区间为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。P值为优选 O. 2、0· I 或 O. 05。当在本文中使用时，术语“受试者”涉及被归类为哺乳动物的所有动物，并且包括但不限于家养动物和耕作动物，灵长类动物和人类，例如，人、非人灵长类动物、奶牛、马、 猪、绵羊、山羊、犬、猫或啮齿类动物。优选地，受试者是任何年龄或人种的男性或女性人类。术语“神经退行性疾病”，当在本文中使用时，是指这样的病症或功能障碍，其中神经元细胞由于细胞死亡而损失，引起认知功能的衰退或导致可能以神经性、神经退行性、生理性、心理或行为异常为特征的损害、功能紊乱或并发症。可以采用本发明的方法诊断的合适的神经退行性疾病包括，而不限于，年龄相关性黄斑变性、克雅氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease)、阿尔茨海默病(Alzheimer' s Disease)、放疗诱发的痴呆症、轴突损伤、急性皮层扩布性抑制(acute cortical spreading depression)、α -共核蛋白病(alpha-synucleinopathies)、脑缺血、亨廷顿病、持续性局灶性脑缺血、周围神经再生、癫痫持续状态后模型(post-status epilepticus model)、脊髓损伤、散发性肌萎缩侧索硬化和传染性海绵状脑病。在优选的实施方案中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病。术语"阿尔茨海默病"(或"老年性痴呆")是指与特定的退行性脑病相关的精神衰退，所述特定的退行性脑病的特征为老年斑、神经炎性缠结(neuritic tangles)和进行性神经元丧失,其在临床上表现为进行性记忆减退、意识混乱、行为问题、个人不能自理、渐进性体质恶化(gradual physical deterioration)和，最终死亡。患有阿尔茨海默病的患者使用NINCDS-ADRDA标准(⑶R = I,丽SE 16至24分和在Scheltens量表中颞叶内侧萎缩(通过MRI确定)> 3 分进行鉴别。术语“所述神经退行性疾病之前的阶段”，当在本文中使用时，是指在正常个体和患有神经退行性疾病的受试者之间发生的一种过渡性状况，其特征为出现神经退行性疾病的一些体征和症状或出现在患有神经退行性疾病的患者中观察到的体征和症状亚群。在优选的实施方案中，所述神经退行性疾病之前的阶段是轻度认知损害(此后称为MCI)，其是指在正常衰老和早期阿尔茨海默病之间的认知损害过渡期。如果患者满足Mayo临床标准 (⑶R = 0. 5，他们显示颞叶内侧萎缩(通过MRI确定)，在Scheltens量表中大于3分，则他们通常被鉴别为MCI，他们在采用18-氟脱氧葡萄糖的正电子断层扫描仪(PET-FDG)中显示顶叶和/或颞叶代谢减退的表现(提示AD)。术语“区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段”是指区分处于神经退行性疾病之前的阶段或前驱期的患者与已经患有该疾病的患者的能力。在具体的情况下，神经退行性疾病是阿尔茨海默�。痉⒚鞯姆椒ㄔ市砬职⒍暮Ｄ� 和已知为轻度认知损害(MCI)的所述疾病的前驱期在第一步骤中，本发明的方法包括确定选自由下列各项组成的组的至少一种参数
(a)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的β_淀粉样肽的水平，(b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述一种或多种β -淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β_淀粉样肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种β-淀粉样肽的量来确定，(c)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种淀粉样肽的水平， 其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述β-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定。术语“β_淀粉样肽”在本文中与 “Αβ ”、" Abeta"、" β AP "、" Abeta 肽"或"Αβ肽”可互换使用，并且是指为在阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合症(Down' s Syndrome)和遗传性脑出血伴荷兰型淀粉样变(HCHWA-D)患者脑中中发现的老年斑和血管淀粉样蛋白沉积物(淀粉样蛋白血管病)的主要化学成分的肽家族。B-淀粉样肽是β-淀粉样前体蛋白的片段(APP)，其包含可变数目的氨基酸，一般为38-43个氨基酸。
B-淀粉样肽通常表示为"Αβ (x-y)"其中x表示β _淀粉样肽的氨基末端的氨基酸编号，y表示羧基末端的氨基酸编号。例如，Αβ (1-40)是其氨基末端以氨基酸编号I开始且羧基末端以氨基酸编号40结束的β-淀粉样肽，其序列由SEQ IDNO :1给出。β_淀粉样肽的实例包括可以用本发明的方法确定的那些，包括，不限于，Αβ (1-38) (SEQ ID NO :2)、Αβ (1-39) (SEQ ID NO :3)、Αβ (1-40) (SEQ IDNO :1)、Αβ (1-41) (SEQ ID NO 4), and Αβ (1-42) (SEQ ID NO ；5), Αβ (1-43) (SEQ ID NO :6)、Aβ (11—42) (SEQ ID NO 7), Αβ (3-40) (SEQ ID NO :8)、Αβ (3-42) (SEQ ID NO :9)、Αβ (4-42) (SEQ ID NO 10)、A β (6-42)(SEQ IDNO : 11)、A β (7-42)(SEQ ID NO : 12)、A13(8-42)(SEQ ID NO : 13)、 Αβ (9-42) (SEQ ID Ν0:14)、Αβ (χ_40)、Αβ (χ-42)和 Αβ (χ_38)，以及总 β-淀粉样肽，后者是指多个β_淀粉样肽物种，其中不区分单个物种。在优选的实施方案中，根据本发明的方法检测的β_淀粉样妝是Αβ (1-40)和Αβ (1_42)。术语“Αβ (1-42)”，当在本文中使用时，涉及对应于APP的氨基酸672至713 (SEQ ID N05)的42个氨基酸肽，其通过淀粉样前体蛋白(SEQ ID NO 15)被β-和Y -分泌酶相继溶蛋白性裂解而产生。术语“Αβ (1-40)”，当在本文中使用时，涉及对应于氨基酸672至711 (SEQ IDNO I)的40个氨基酸肽，其通过淀粉样前体蛋白(SEQ ID NO 15)被β-和Y -分泌酶相继溶蛋白性裂解而产生。术语“生物样品”，当在本发明中理解时，包括(I)生物流体诸如全血、血清、血浆、 尿、淋巴、唾液、精液、痰、眼泪、粘液、汗液、乳、脑提取物和脑脊液；(2)血液成分，诸如血浆、血清、血细胞和血小板；(3)从实体组织或器官诸如脑获得的提取物；和(4)来自人或动物细胞系或原代细胞的培养物，所述原代细胞诸如原代人神经元，和来自携带人APP基因的转基因小鼠的原代神经元，例如，来自转基因PDAPP动物(例如，小鼠)的细胞，以及 293人肾细胞系，人神经胶质瘤细胞系，人HeLa细胞系，原代内皮细胞系(例如，HUVEC细胞)，原代人成纤维细胞系或原代淋巴母细胞系(包含来源于具有APP突变的患者的内源性细胞)，原代人混合脑细胞培养物(包含神经元、星形细胞和神经胶质)，或中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞系。本发明的方法特别适合于测量人或非人动物的血液样品中的Αβ，所述血液样品诸如全血、血浆，或包含任何量的任何血液成分的样品。术语“全血”是指来自人或动物的包含细胞成分和液体成分两者的血液。全血可以处于凝固状态或非凝固状态。“全血”还包括其中一部分或全部细胞成分诸如白细胞或红细胞已经被溶解的血液。术语“血浆”是指全血的液体成分。取决于使用的分离方法，血浆可以完全不含有细胞成分，或可以含有不同量的血小板和/或小量的其他细胞成分。术语“血清”是指不含凝血蛋白纤维蛋白原和其他凝血因子的血浆。术语“游离的β_淀粉样肽”，当在本文中使用时，是指不与生物样品的任何成分缔合并且易于与特异性抗体结合的β_淀粉样肽。该肽可以通过常规的免疫学技术通过将生物样品与对所述肽特异的抗体接触来测定。在优选的实施方案中，游离淀粉样肽的水平在血衆中测定。术语“与大分子成分缔合的β -淀粉样肽”，当在本文中使用时，是指与被研究的生物样品中存在的分子非共价结合或连接的β_淀粉样肽。该肽通常不容易被利用用于免疫学检测并且因此需要对生物样品预处理以便实现该肽与所述成分的分离。在这些条件下，与 大分子成分连接的β-淀粉样肽将从所述成分释放并且将变得可被利用用于使用特异性抗体的免疫学检测。由于生物样品已经含有特定量的游离β_淀粉样肽，因此在将样品与蛋白增溶剂接触后游离淀粉样肽的总量将为初始存在的游离β-淀粉样肽和在用蛋白增溶剂处理后已经释放的β_淀粉样肽水平的合计水平。在需要测定与生物样品中存在的大分子成分缔合的β_淀粉样肽的水平的情况下，通�？梢匀缦吕赐瓿刹舛ㄓ玫鞍自鋈芗链砬坝卫毽耞淀粉样肽的水平和用蛋白增溶剂处理后游离β_淀粉样肽的水平，并将第二值减去第一值。为了本发明的目的，其通常足以测定游离β_淀粉样肽的合计水平， 该合计水平包括初始的游离β-淀粉样肽以及在用蛋白增溶剂处理后已经从大分子成分释放的β_淀粉样肽的水平。因此，通常当样品被处理以便将淀粉样肽从大分子成分解离时测定的参数对应于样品中存在的游离肽加上与大分子成分缔合的肽。可以结合β -淀粉样肽并且有助于与大分子成分缔合的β -淀粉样肽的池的样品大分子成分包括蛋白以及脂质两者。在血液或血浆样品中进行所述方法的具体情况下，所述大分子成分包括，不限于，血液蛋白和脂质。示例性的血液蛋白包括白蛋白、免疫球蛋白 G、免疫球蛋白Ε、免疫球蛋白Μ、免疫球蛋白Α、纤维蛋白原(纤维蛋白及其降解产物)、α -I 抗胰蛋白酶、前白蛋白、α I抗胰蛋白酶、α I酸性糖蛋白、α I甲胎蛋白、触珠蛋白α 2、巨球蛋白、血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、C3/C4i32微球蛋白、β脂蛋白；α、β和Υ球蛋白、C-反应蛋白(CRP)、凝血酶原、甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白等。示例性的血液脂质包括游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酯、磷脂、鞘脂等。与大分子成分缔合的β_淀粉样肽的量可以通过将生物样品的无细胞样品与蛋白增溶剂在适于诱导所述β-淀粉样肽从大分子成分释放的条件下接触来确定。对于接触，其在本文中是指向样品加入足量的包含蛋白增溶剂的溶液使得混合物中蛋白增溶剂的浓度足以 有效地溶解与样品中的蛋白和细胞结合的β_淀粉样肽。优选地，所述蛋白增溶剂以缓冲溶液的形式存在于溶液中使得蛋白增溶剂的添加不会导致样品pH的大幅改变。术语“蛋白增溶剂”当在本文中使用时，是指能够改变多肽的二级、三级和/或四级结构同时保留一级结构完整的任何化合物或组合物。由于这些性质，蛋白增溶剂能够增加样品中蛋白的溶解度以及防止蛋白的分子间和分子内聚集。适合于在本发明中使用的蛋白增溶剂包括，不限于，洗涤剂、离液剂、还原剂及其混合物。术语“洗涤剂”，当在本文中使用时，通常作为表面活性剂的同义词使用，是指两亲性表面活性剂，其当加入至液体时，与缺少洗涤剂时的相同液体相比，减少液体的表面张力。洗涤剂还能够防止蛋白的聚集和防止污染物与目的蛋白的非特异性相互作用或结合。 适合于在本发明中使用的洗涤剂包括，不限于，非离子(中性)、阴离子、阳离子或两性离子洗涤剂。 非离子或中性洗涤剂的实例包括，不限于，Tween系列的洗涤剂，诸如Tween 20、Tween 21、Tween 40、Tween 60、Tween 61、Tween 65、Tween 80、 Tween 81、Tween 85 ；Span⑩系列的洗涤剂，诸如Span 20 ；TergitoI系列的洗涤剂，诸如 Tergitol 型号 15-S-12系列的洗涤剂，诸如Brij 35、Brp> 56、Brij 72、Brij 76、Brij 92V、Brij 97、Brij 58P ；Tween 系列的洗涤剂，诸如Tween 20、 Tween. 2l、Tween 40 > Tween 60、Tween ⑩ 6l、Tween 65 > Tween 80、Tween 81、Tween 85 ; Triton 系列的洗漆剂，诸如Triton⑩ X-100、Triton X-114、Triton CF-21、Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton⑩ X-102、 Triton X-15 > Triton X-151>TritonC X-207> Triton X-165> Triton X-305> Triton X-405、Triton X~45> Triton X-705-70,或至少一种所述洗涤剂的非尚子保守的变体。阴离子洗涤剂的实例包括，不限于，胆酸及其衍生物，牛磺胆酸、TritonX-200, Triton ff-30、Triton-30、Triton-770、磺基丁二酸二辛酯、N5N- 二甲基十二烷基胺 N-氧化物、I-烷基磺酸钠、N-月桂酰肌氨酸或脂肪酸盐。阳离子洗涤剂的实例包括，不限于，一和二-甲基脂肪胺、烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、烷基胺乙酸盐、三烷基乙酸铵、烷基二甲基苄基铵盐、二烷基甲基苄基铵盐、 齒化烧基卩比淀鐵和烧基(烧基取代的)卩比淀鐵盐、烧基甲硫基卩比淀鐵盐、烧基酸胺基甲基批淀鐵盐、烧基喧琳鐵盐、烧基异喧琳鐵盐、N，N-烧基甲基批略烧鐵盐、I，I- _■烧基喊淀鐵盐、4,4- _■烧基硫吗琳鐵盐、4,4-而烧基硫吗琳鐵-I-氧化物盐、甲基二(烧基乙基)~2~烧基甲基硫酸咪唑鎗盐(和其他盐类)、甲基双(烷基酰胺基乙基)-2_羟乙基甲基硫酸铵(和其他盐类)、烷基酰胺基丙基一二甲基苄基铵盐、羧基烷基-烷基二甲基铵盐、烷基胺氧化物、烷基二甲基胺氧化物、聚(乙烯基甲基吡啶鎗)盐、聚(乙烯基吡啶)盐、聚乙烯亚胺、 二烧基鱗碳酸龜!盐(和其他盐类)、二烧基甲基鱗盐、烧基乙基甲基琉盐和烧基_■甲基氧化琉盐。两性离子洗涤剂的实例包括，不限于，3_[ (3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-I-丙磺酸盐(CHAPS) ;3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-I-丙磺酸盐(CHAPSO)； N-(烷基C10-C 16)-N, N-二甲基甘氨酸甜菜碱(EMPIGEN BB);硫代甜菜碱(SB3-10)；
3-[N, N- 二甲基(3-肉豆蘧酰基氨基丙基)铵基]丙磺酸盐(酰胺基磺基甜菜碱-14 ； ASB-14) ;N-十四烷基-N，N-二甲基-3-铵基-I-丙磺酸盐(3_14洗涤剂；ZWITTERGENT)； N-十二烷基-N，N' - 二甲基-3-铵基-I-丙磺酸盐；N-十八烷基-N，N-二甲基-3-铵基-I-丙磺酸盐；N-癸基-N,N-二甲基-3-铵-I-丙磺酸盐；Mirataine CB ；Mirataine BB; Mirataine CBR ；Mirataine ACS ；Miracare2MHT 和 Miracare 2MCA。在优选的实施方案中，蛋白增溶剂是洗涤剂。在另外更优选的实施方案中，洗涤剂是Tween 20。在另外更优选的实施方案中，Tween 20以O. 5%的浓度使用。“离液剂”，当在本文中使用时涉及破坏蛋白之间和蛋白内的氢键和疏水相互作用化合物或化合物的混合物。当以高浓度使用时，离液剂破坏二级蛋白结构并使否则为不溶的蛋白进入溶液中。合适的离液剂包括，不限于，尿素、异硫氰酸胍、硫氰酸钠(NaSCN)、盐酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾、或三氟乙酸铯。术语“还原剂”，当在本文中使用时，是指将巯基保持在还原状态并且还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。作为实例，适合于本发明的方法的还原剂包括巯基或膦还原剂。巯基还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)、二硫丁四醇(DTE)和β-巯基乙醇。膦还原剂的实例包括三丁基膦(TBP)和三-羧基乙基膦(TCEP)。典型地，生物样品首先被处理以去除细胞级分。然后无细胞样品与蛋白增溶剂接触。在优选的实施方案中，样品使用包含蛋白增溶剂的缓冲液稀释。典型地，样品在包含 Tween 20的缓冲溶液中稀释5倍。·当在本文中使用时，“缓冲溶液”是能够中和酸和碱两者而一点也不会改变溶液的初始酸度或碱度的处于溶液中的任何物质或化合物的混合物。待在本发明的方法中使用的合适的缓冲溶液包括，不限于，Tris缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液等。优选地，缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液诸如磷酸盐-缓冲盐水或PBS。加入至生物样品的包含蛋白增溶剂的溶液的量不是至关重要的，只要实现淀粉样肽的充分解离即可。作为实例，生物流体可以在包含蛋白增溶剂的溶液中以至少 1/2 (ν/ν)、1/3 (ν/ν)、1/4 (ν/ν)、1/5 (ν/ν)、1/6 (ν/ν)、1/7 (ν/ν)、1/8 (ν/ν)、1/9 (ν/ν)、 1/10 (ν/ν)、1/20 (ν/ν)、1/50 (ν/ν)、1/60 (ν/ν)、1/80 (ν/ν)、1/90 (ν/ν)、1/100 (ν/ν)或更大的稀释度稀释。专业技术人员将理解，可以使用所述稀释率的任意组合和所述蛋白增溶剂浓度的任意组合，只要蛋白增溶剂的终浓度足以达到所需的作用即可。例如，包含蛋白增溶剂的溶液可以包含浓度在O. 001%至O. 5% (w/v)范围的所述选择的一种或多种蛋白增溶齐U。在包含蛋白增溶剂的所述溶液中已经稀释后，所述生物流体典型地含有处于小于O. I % (w/v)、优选小于O. 6% (w/v)、更优选不多于O. 5% (w/v)、最优选不多于O. 45% (w/v)和甚至最优选O. 5%的所述一种或多种表面活性剂。用于本发明的合适的缓冲体系包括Tris-HCl缓冲液，其包含盐诸如NaCl或KCl 和，任选地包含BSA。具体的缓冲体系包括，不限于，50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，O. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20, IM GuHCl ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20, IM GuHCl ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-80 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-80 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl ；0. 05% ；BSA,0. 05% Triton X-100
50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M KCl，0· 05% ；BSA,0. 05% Triton X-100 ；50mM Tris-HCl pH 8 ；0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 1% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 1% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 1% ；BSA,0. 1% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，IM NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，I. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；
50mM Tris-HCl pH 8，2M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，2，5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8，3M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl,0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20,10% DMSO ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20,0. 5M GuHCl ；50mM Tris-HCl pH 6,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 7,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 9,0. 5M NaCl，0. 05% ；BSA,0. 05% Tween-20 ；50mM Tris-HCl pH 8,0. 5M NaCl,0. 05% ;BSA。例如，当Tween 20用作蛋白增溶剂时，优选的浓度为0. 004-0. 02 %，更优选 O. 005-0. 01% (w/v) ο优选在低温下进行接触步骤以便抑制样品中存在的蛋白水解活性。合适的温度为约0-10摄氏度，优选约3-5摄氏度，例如，约4摄氏度。一旦生物流体与包含蛋白增溶剂的溶液接触，两种流体就可以被混合。混合可以通过搅拌，优选通过摇动，更优选通过高速摇动，最优选通过涡旋至少5秒、优选至少10秒、 更优选至少15秒(例如，15-50秒)来进行。所述混合、搅拌、摇动、高速摇动或涡旋的有利速度包括至少250rpm、优选至少500rpm、更优选至少1，OOOrpm、最优选约2，000-2, 500rpm 的速度。在适于实现β_淀粉样肽从生物样品中存在的蛋白和脂质部分地或优选全部解离的条件下来进行接触步骤。所述条件可以由本领域普通技术人员通过监测在接触步骤前可检测到的β-淀粉样肽的量和在已经进行接触步骤后不同的时间点时进行性地监测 β-淀粉样肽的量来适当地确定。时程实验可以如实验部分的实施例中所述进行确定。专业技术人员要理解的是当通过用包含蛋白增溶试剂的缓冲液稀释生物样品来测定β-淀粉样肽的水平时，通过免疫学测定获得的游离β -淀粉样肽的水平要进行校正以便考虑先前应用于生物样品的稀释因子。因此，在优选的实施方案中，在本发明的方法的步骤α)中确定的参数为选自由下列各项组成的组的一种或多种参数所述受试者的生物样品中游离ΑΒΕΤΑ40肽的水平 (此后称为lab40或UP Αβ (1-40))，生物样品中的游离ΑΒΕΤΑ40肽和如上所述获得的与所述生物样品的成分缔合的ABETA40肽的合计水平(此后称为2ab40或DP A β (1-40))，生物样品中的游离ΑΒΕΤΑ42肽的水平(此后称为lab42或UP Αβ (1-42))和生物样品中的游离 ABETA42肽和如上所述获得的与所述生物样品的成分缔合的ABETA42肽的合计水平(此后称为 2ab42 或 DP Αβ (1-42))
术语“与细胞缔合的β_淀粉样肽”，当在本文中使用时，是指与生物样品中存在的细胞表面非共价缔合并且不能被利用用于与添加至样品的抗体结合，因此不能被免疫学检测到的β_淀粉样肽。典型地，如果生物样品是血液，则β_淀粉样肽缔合至红细胞、白细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，以及血小板。可以确定指定样品中与细胞缔合的β_淀粉样肽的量，并且该值可以单独使用或结合本发明的方法中的涉及β_淀粉样肽的其他参数一起使用。为此目的，首先需要从生物样品中分离细胞级分。这可以使用专业技术人员已知的任何技术来进行，诸如离心、沉降、过滤等。一旦生物样品的细胞级分已经被分离，则将细胞与蛋白增溶剂接触。合适的蛋白增溶剂包括如上所定义的洗涤剂、离液剂和还原剂，并且通常在缓冲溶液中以适宜的浓度提供。合适的试剂、缓冲溶液和缓冲溶液中试剂的浓度已经在上面进行了描述。接触步骤基本上如上面在释放与生物样品的成分(蛋白和脂质)连接的淀粉样肽的方法中所解释的那样进行。在优选的实施方案中，蛋白增溶剂是洗涤剂。在还更优选的实施方案中，洗漆剂是Tween 20。用作蛋白增溶剂的Tween 20的合适浓度如上面所定义，即，O. 004-0. 02%,更优选 O. 005-0. 01% (w/v)。优选在低温下进行接触步骤以便抑制样品中存在的蛋白水解活性。合适的温度为约0-10摄氏度，优选约3-5摄氏度，例如，约4摄氏度。典型地，接触步骤通过用包含蛋白增溶剂的溶液重悬浮生物样品中的细胞级分来进行。所述重悬浮 可以通过轻柔地上下吹吸，通过搅拌，优选通过摇动，更优选通过高速摇动，最优选通过涡旋至少5秒，优选至少10秒，更优选至少15秒(例如，15-50秒)来进行。 所述混合、搅拌、摇动、高速摇动或润旋的有利速度包括至少250rpm、优选至少500rpm、更优选至少1，OOOrpm、最优选约2，000-2, 500rpm的速度。在足以实现淀粉样肽从生物样品中存在的细胞部分地或优选全部解离的条件下来进行接触步骤。所述条件可以由本领域普通技术人员通过监测在接触步骤前可检测到的β_淀粉样肽的量和在已经进行接触步骤后不同的时间点时进行性地监测β_淀粉样肽的量来适当地确定。时程实验可以如实验部分的实施例中所述进行确定。因此，在优选的实施方案中，在本发明的方法的步骤(i)中确定的参数为选自由下列各项组成的组的一种或多种参数与生物样品中存在的细胞缔合的ABETA40的水平 (此后称为3ab40或CB Αβ (1_40))和与生物样品中存在的细胞缔合的ΑΒΕΤΑ42的水平(此后称为 3ab42 或 CB A β (1-42))。本发明的方法的下列步骤包括将参数(b)或(C)中的至少一个的值或由参数(a) 至(C)中的一个或多个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或 (C)或所述计算参数的值的参比值进行比较；其中(a)、(b)和(C)已经在上面被详细地定义，并且分别对应于所述受试者的生物样品中游离淀粉样肽的水平(a)，所述受试者的生物样品中的游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述β_淀粉样肽的合计水平(b)以及与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的β_淀粉样肽的水平
(C)。在本发明的方法的步骤(ii)中使用的参数是直接参数，即，可以如上面所定义的那样直接测定的参数，其对应于前面被定义为2ab40、3ab40、2ab42和3ab42的那些。备选地，还能够将一种或多种直接参数算术组合以便获得计算参数。在实践中，两种以上参数的任意算术组合可以具有诊断价值的计算参数，包括加法、减法、乘法、除法和它们的组合。用于本发明的方法中的具体计算标志物包括，不限于，2ab40/2ab42、 3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、lab40+2ab40、lab40+3ab40、2ab40+3ab40、 Iab40+2ab40+3ab40>Iab42+2ab42>Iab42+3ab42> 2ab42+3ab42>Iab42+2ab42+3ab42、 Iab40+2ab40+lab42+2ab42>Iab40+3ab40+lab42+3ab42> 2ab40+3ab40+2ab42+3ab42> Iab40 + 2ab40 + 3ab40 + lab42 + 2ab42 + 3ab42、(Iab40 + 2ab40)/(Iab42 + 2ab42)、 (Iab40+3ab40)/(Iab42+3ab42)、 (2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、 (Iab40+2ab403ab40)/ (Iab42+2ab42+3ab42)、 (Iab42+2ab42)/(Iab40+2ab40)、 (Iab42+3ab42)/(Iab40+3ab40)、 (2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、 (Iab42+2ab423ab42)/(Iab40+2ab40+3ab40)、 2ab40-lab40、2ab42-lab42y (2ab40_lab40) / (2ab42_lab42)。在优选的实施方案中，计算参数由2ab40和3ab40参数相加得到(此后称为T40)。在另一优选的实施方案中，计算参数由2ab42和3ab42参数相加得到(此后称为T42)。还在另一个优选实施方案中，计算参数由2ab40、3ab40、2ab42和3ab42参数相加得到(此后称为T-β APB)。术语“参比值”，当在本文中使用时，是指用于比较并且已经在未患 有神经退行性疾病或没有任何神经退行性疾病史的受试者中测定的参数的值。优选地，从其获得用于不同参数和计算参数的参比值的受试者是显示没有记忆主诉，在神经心理学测试中表现正常且在MRI中没有结构改变的患者。具体地，选择参比值，能够获得大于85%的灵敏度和大于75%的特异性。在另一优选的实施方案中，选择参比值以便获得大于70%的灵敏度和大于70%的特异性。优选地，参比值能够获得具有至少80%的准确度或精确度的预测。在本发明的方法的步骤(iii)中，使用特定组的标志物或计算标志物来进行神经退行性疾病的诊断，对神经退行性疾病之前的阶段的检测或神经退行性疾病与神经退行性疾病之前的阶段的区分，所述特定组的标志物或计算标志物提供特别适宜的特异性和灵敏度水平。因此，在具体实施例中，神经退行性疾病的诊断通过比较选自由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或选自由2ab40+3ab40和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42组成的组的计算参数的值来进行。在另一个具体实施方案中，对神经退行性疾病之前的阶段的检测通过比较选自由2ab40、3ab40和2ab42组成的组的参数的值或选自由 2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+ 3ab42、lab40+2ab40+3ab40，lab42+2ab42+3ab42、lab40+lab42+2ab42+3ab42， Iab40+2ab40+lab42+2ab42 和 Iab40+3ab40+lab42+3ab42 组成的组的计算参数的值来进行。还在另一个实施方案中，神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的区分通过比较选自由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或通过比较选自由2ab40+3ab40、 2ab40+3ab40+2ab42+3ab42 和 Iab40+2ab40+lab42+2ab42 组成的组的计算参数的值来进行。用于本发明的不同诊断方法的适当参比值概括在表I中。
权利要求
1.诊断受试者中的神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述方法包括以下步骤 (i)确定选自以下的一种或多种参数 (a)所述受试者的生物样品中一种或多种游离的￠-淀粉样肽的水平， (b)所述受试者的生物样品中一种或多种游离淀粉样肽和与所述生物样品中存在的大分子成分缔合的所述一种或多种3 -淀粉样肽的合计水平，其中所述合计水平通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述￠-淀粉样肽与所述生物样品中存在的成分解离的条件下接触后定量所述样品的无细胞级分中所述一种或多种￠-淀粉样肽的量来确定， (C)与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的一种或多种￠-淀粉样肽的水平，其中所述水平通过分离所述生物样品的细胞级分，将所述样品的所述细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进一种或多种所述P-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触来确定；以及 (ii)将参数(b)或(c)中的至少一个的值或由参数(a)至(c)中的至少两个算术组合产生的计算参数的值与参比样品中对应于所述参数(b)或(C)或所述计算参数的值的参比值进行比较；以及 (iii)当所述参数的值或所述计算参数的值相对于所述参比值存在改变时，诊断所述神经退行性疾病、检测神经退行性疾病之前的阶段或区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。
2.权利要求I所述的方法，其中在步骤(i)中确定的参数是选自下列的一个或多个参数 (a)lab40，对应于所述受试者的生物样品中游离ABETA40肽的水平， (b)lab42，对应于所述受试者的生物样品中游离ABETA42肽的水平， (c)2ab40，对应于所述受试者的生物样品中游离ABETA40肽和与所述生物样品的成分缔合的ABETA40肽的合计水平，其中通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进ABETA40肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品中的ABETA40肽的量来确定2ab40， (d)2ab42，对应于所述受试者的生物样品中的游离ABETA42肽和与所述生物样品的成分缔合的ABETA42肽的合计水平，其中通过在将所述样品与蛋白增溶剂在足以促进ABETA42肽与所述生物样品中存在的所述成分解离的条件下接触后定量所述样品中的ABETA42肽的量来确定2ab42， (e)3ab40,对应于与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的ABETA40肽的水平，其中通过在将所述生物样品的细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进￠-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触后定量ABETA40肽的量来确定3ab40，和 (f)3ab42，对应于与所述受试者的生物样品中的细胞缔合的ABETA42肽的水平，其中通过在将所述生物样品的细胞级分与蛋白增溶剂在足以促进￠-淀粉样肽与所述样品中存在的所述细胞解离的条件下接触后定量ABETA42肽的量来确定3ab42。
3.权利要求2所述的方法，其中步骤(ii)中获得的所述计算参数选自下组2ab40/2ab42、3ab40/3ab42、2ab40/3ab40、2ab42/3ab42、lab40+2ab40、lab40+3ab40、2ab40+3ab40、lab40+2ab40+3ab40、lab42+2ab42、lab42+3ab42、2ab42+3ab42、Iab42+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+lab42+2ab42、lab40+3ab40+lab42+3ab42、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42Uab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42, (Iab40+2ab40) /(Iab42+2ab42)、(Iab40+3ab40)/(Iab42+3ab42)、(2ab40+3ab40)/(2ab42+3ab42)、(Iab40 + 2ab403ab40)/ (Iab42+2ab42 + 3ab42)、(Iab42 + 2ab42)/ (Iab40+2ab40)、(Iab42+3ab42)/(Iab40+3ab40)、 (2ab42+3ab42)/(2ab40+3ab40)、 (Iab42+2ab42+3ab42)/(Iab40+2ab40+3ab40)、2ab40-lab40、2ab42_lab42 和(2ab40_lab40)/(2ab42_lab42)。
4.权利要求2或3所述的方法，其中 (i)通过比较选自由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或选自由2ab40+3ab40、Iab42+2ab42+3ab42和2ab40+3ab40+2ab42+3ab42组成的组的计算参数的值进行对神经退行性疾病的诊断， (ii)通过比较选自由2ab40、3ab40、lab42和2ab42组成的组的参数的值或选自由 2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42、lab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42、Iab40+2ab40+3ab40、Iab42+2ab42+3ab42、Iab40+lab42+2ab42+3ab42、Iab40+2ab40+lab42+2ab42 和 Iab40+3ab40+lab42+3ab42 组成的组的计算参数的值进行对神经退行性疾病之前的阶段的检测，或 (iii)通过比较由3ab40和2ab42组成的组的参数的值或通过比较由2ab40+3ab40、2ab40+3ab40+2ab42+3ab42 和 Iab40+2ab40+lab42+2ab42 组成的组的计算参数的值区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段。
5.权利要求4所述的方法，其中步骤(ii)中用来比较所述参数的值或所述计算参数的值的所述参比值选自以下 (i)当所述参数2ab40用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为63.8pg/ml, (ii)当所述参数3ab40用于诊断神经退行性疾病时为71.9pg/ml, (iii)当所述参数3ab40用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为71.lpg/ml, (iv)当所述参数3ab40用于区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段时为 211. 3pg/ml, (V)当所述参数2ab42用于诊断神经退行性疾病时为47. 4pg/ml, (vi)当所述参数2ab42用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为50.3pg/ml, (vii)当所述参数2ab42用于区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段时为 151. 7pg/ml， (viii)当所述参数为3ab42且用于诊断神经退行性疾病时为76.9pg/ml, (ix)当所述参数为3ab42且用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为58.8pg/ml, (X)当所述参数2ab40+3ab40用于诊断神经退行性疾病时为132. 7pg/ml, (xi)当所述参数2ab40+3ab40用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为132.7pg/ml, (xii)当所述参数2ab40+3ab40用于区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段时为550. 8pg/ml， (xiii)当所述参数为2ab42+3ab42且用于诊断神经退行性疾病时为115.8pg/ml， (xiv)当所述参数为2ab42+3ab42且用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为103.3pg/ml,(XV)当所述参数2ab40+3ab40+2ab42+3ab42用于诊断神经退行性疾病时为235. 5pg/ml, (xvi)当参数2ab40+3ab40+2ab42+3ab42用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为235.5pg/ml, (xvii)当所述参数2ab40+3ab40+2ab42+3ab42用于区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段时为778. lpg/ml， (xviii)当所述参数Iab40+2ab40+3ab40+lab42+2ab42+3ab42用于检测神经退行性疾 病之前的阶段时为272. lpg/ml， (xix)当所述参数Iab40+2ab40+3ab40用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为 155.8pg/ml, (xx)当所述参数Iab42+2ab42+3ab42用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为124.3pg/ml,(xxi)当所述参数Iab40+2ab40+lab42+2ab42用于诊断神经退行性疾病时为158.3pg/ml, (xxii)当参数Iab40+2ab40+lab42+2ab42用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为142. 4pg/ml, (xxiii)当所述参数Iab40+2ab40+lab42+2ab42用于区分神经退行性疾病与所述神经退行性疾病之前的阶段时为161. 2pg/ml,以及 (xxiv)当所述参数Iab40+3ab40+lab42+3ab42用于检测神经退行性疾病之前的阶段时为 154. 7pg/ml。
6.权利要求I至5中任一项所述的方法，其中所述参数的值或所述计算参数的值相对于所述参比值的改变是增加。
7.权利要求I至6中任一项所述的方法，其中所述蛋白增溶剂是洗涤剂，优选Tween20。
8.权利要求I至7中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血浆或血液。
9.权利要求I至8中任一项所述的方法，其中Iab40、lab42、2ab40、2ab42、3ab40和3ab42中的至少一种或多种的确定步骤通过免疫学方法来进行。
10.权利要求9所述的方法，其中所述免疫学方法是ELISA测定。
11.权利要求10所述的方法，其中所述ELISA测定是ELISA夹心测定。
12.权利要求11所述的方法，其中所述ELISA夹心测定中的捕获抗体是针对P-淀粉样肽的N-末端区的抗体。
13.权利要求12所述的方法，其中所述针对所述￠-淀粉样肽的N-末端区的抗体针对位于ABETA40和ABETA42的氨基酸I至7内的表位。
14.权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述ELISA夹心测定中的检测抗体是对位于￠-淀粉样肽的C-末端区中的表位特异的抗体。
15.权利要求14所述的方法，其中对所述￠-淀粉样肽的C-末端区特异的抗体选自下列 (i)针对对应于ABETA42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异性地结合ABETA42，但与ABETA40不产生任何实质性的交叉反应，(ii)针对对应于ABETA40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异性地结合ABETA40，但与ABETA42不产生任何实质性的交叉反应，和 (iii)同时识别ABETA40和ABETA42两者的C-末端区的抗体和(iv)⑴和(ii)项所述的抗体的组合。
16.权利要求11至15中任一项所述的方法，其中该检测抗体使用对所述抗体显示亲和性的试剂进一步检测，所述试剂与结合对的第一成员偶联。
17.权利要求16所述的方法，其中使用与可检测标记偶联的结合对的第二成员进行所述检测。
18.权利要求I至17中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病和/或所述神经退行性疾病之前的阶段是轻度认知损害。
19.一种用于测定生物样品中的￠-淀粉样肽的试剂盒，其包含 (i)蛋白增溶剂，和 (ii)至少一种针对￠-淀粉样肽的抗体。
20.权利要求19所述的试剂盒，其中所述蛋白增溶剂是洗涤剂，优选Tween20。
21.权利要求19至21中任一项所述的试剂盒，其中至少一种针对所述￠-淀粉样肽的抗体选自下列 (i)针对所述￠-淀粉样肽的N-末端区的抗体， (ii)针对所述P-淀粉样肽的C-末端区的抗体，以及 (iii)针对所述￠-淀粉样肽的N-末端区的抗体和针对所述￠-淀粉样肽的C-末端区的抗体的组合。
22.权利要求21所述的试剂盒，其中所述针对所述￠-淀粉样肽的N-末端区的抗体针对位于ABETA40和ABETA42的氨基酸I至16内的表位和/或其中对所述P -淀粉样肽的C-末端区特异的抗体选自下列 (i)针对对应于ABETA42肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异性地结合ABETA42，但与ABETA40不产生任何实质性的交叉反应， (ii)针对对应于ABETA40肽的C-末端区的肽制备的多克隆抗体，其特异性地结合ABETA40，但与ABETA42不产生任何实质性的交叉反应，和 (iii)同时识别ABETA40和ABETA42两者的C-末端区的抗体和(iv)⑴和(ii)项所述的抗体的组合。
23.权利要求19至22中任一项所述的试剂盒，其中针对所述￠-淀粉样肽的所述抗体与固相载体偶联。
全文摘要
本发明涉及诊断神经退行性疾病，检测神经退行性疾病之前的阶段或基于β-淀粉样肽的特定池的水平以及特定的计算参数区分神经退行性疾病与神经退行性疾病之前的阶段的方法，所述β-淀粉样肽的特定池与血浆成分结合或与血细胞结合，所述特定的计算参数通过一个或多个的淀粉样肽水平的算术组合获得。本发明还涉及用于实施上述方法的试剂盒。
文档编号G01N33/68GK102713633SQ201080062241
公开日2012年10月3日 申请日期2010年12月13日 优先权日2009年12月11日
发明者J·曼纽尔·萨拉萨巴里欧 申请人:艾拉科隆生物技术公司
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