专利名称：检测四种常见肿瘤血清蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤早期检测领域，尤其是在体外检测脑胶质瘤、脑膜瘤、乳腺癌、肝癌四种常见肿瘤血清蛋白质的方法，可在筛选这些常见肿瘤治疗药物中应用。同时也提供了一系列的候选肿瘤标志物用于进一步研究。
背景技术：
随着人类疾病谱的改变，肿瘤已成为目前死亡常见原因之一，是严重�：θ死嘟】档闹匾参郎侍�。目前，如何提高肿瘤的检测率尤其是早期检测率已被公认为是改善其疗效和预后的关键。随着人类基因组计划的顺利实施，以蛋白质作为主要研究对象的功能基因组学已逐渐成为生命科学中最具活力的领域之一。由于蛋白质而并非核酸才是生命活动的具体执行者和体现者，因此深入研究消化系统恶性肿瘤发病机制，寻找特异、灵敏的肿瘤标志物用于检测尤其是早期检测，客观上要求在蛋白质组的水平进行进一步探索，进而深入探究肿瘤发生发展的机制。
表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(Surface Enhanced LaserDesorption/Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry SELDI-TOF-MS)技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法，其根本的原理是通过使用特异的探针表面俘获蛋白质来增强亲合力。SELDI可以克服二维凝胶电泳存在的内在问题，包括疏水性问题、强酸性、强碱性的蛋白质的分离、膜蛋白的分离问题、低分子量检测的灵敏性、低丰度蛋白质的灵敏性问题[1-3]。蛋白质只要与SELDI蛋白质芯片结合，就可通过质谱仪按蛋白质质量、电荷比(m/z)的不同及量的多寡用位置、强弱不同的峰直观的表现出来，进而形成相应图谱，用于分析、判别。
目前图像检测(包括超声、CT、核磁共振等)、化学检测(血清学和免疫学)及细胞组织学检测是肿瘤检测三大支柱，而后两者均以肿瘤生物学标志为主要或辅助观察指标，现已发现有肿瘤抗原、激素、受体、酶与同工酶、癌基因与抗癌基因及其产物等100余种肿瘤标志物，目前临床常用的肿瘤标志物有20多种。公认理想的肿瘤标志物标准是(1)特异度强；(2)灵敏度高；(3)其表达量或血中水平与肿瘤组织发展或大小呈正相关[4]。然而在目前所应用的标志物中，即便是AFP(肝癌)、CEA(大肠癌)、CA125(卵巢癌)等公认具有较高检测价值的标志物也远未达到上述要求，其它标志物则更是如此，大多存在灵敏度和特异度难以统一、约登指数(Youden’s Index，YI，YI＝灵敏度+特异度-1)小等问题，尤其对于早期患者。相当一部分肿瘤甚至还缺乏理想的标志物。这一现状给肿瘤的早期分子检测、疗效及预后评价、复发及转移监测和生物治疗等方面造成了一定的困难。
肿瘤是一种多基因参与、多步骤发展、内外环境交互作用下形成的复杂疾病，单一的肿瘤标志物往往难以反映肿瘤的全貌。目前联合检测多种肿瘤标志物来相对全面的反映肿瘤特征以达到更好的检测效果，已为大多数学者所认同。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测四种常见肿瘤血清蛋白质的方法，四种常见肿瘤是指脑胶质肿瘤、脑膜肿瘤、乳腺肿瘤、肝癌，具体通过以下方案实现(1)用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(SELDI)仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱；(2)结合生物信息学的方法筛选出相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分析检测。
本发明采用疏水结合表面(H4)芯片(Ciphergen)检测脑胶质肿瘤、脑膜肿瘤、乳腺肿瘤的蛋白质质谱，用弱阳离子结合表面(WCX2)芯片检测肝癌的蛋白质质谱。
本发明采用人工神经网络(ANN)、支持向量机(SVM)、生物信息学方法筛选肿瘤标志物并建立检测模型，进行判别分析。
脑胶质肿瘤标志物由15个蛋白质质荷比峰组成2021m/z、2082m/z、2103m/z、2368m/z、2389m/z、3226m/z、4299m/z、4469m/z、4815m/z、6457m/z、7764m/z、8214m/z、8612m/z、8702m/z和8926m/z。
脑膜肿瘤标志物由5个蛋白质质荷比峰组成2367m/z、8215m/z、8937m/z、14045m/z和21982m/z。
从健康人群中检出乳腺肿瘤的标志物由4个蛋白质质荷比峰组成5750m/z、8923m/z、17338m/z和26267m/z；从乳腺非癌疾病患者人群中检出乳腺肿瘤的标志物由7个蛋白质质荷比峰组成3341m/z、4182m/z、6547m/z、6614m/z、8625m/z、25485m/z和26591m/z。
从健康人群中检出肝癌的标志物由2个蛋白质质荷比峰组成3015m/z、5900m/z；从肝硬化患者人群中检出肝癌的标志物由2个蛋白质质荷比峰组成13134m/z和7759m/z。
本发明应用SELDI质谱仪测定了脑肿瘤、乳腺癌和肝癌等常见肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱，并采用了不同于传统统计学方法的支持向量机和反向传播算法(BP)人工神经网络等生物信息学手段进行数据处理，首次得到四种肿瘤血清蛋白质指纹图谱检测模型，本发明方法在筛选这些肿瘤药物中应用，也为肿瘤的早期发现、早期检测提供了新的途径和方法，所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源；同时也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新思路。
图1为人工神经网络(ANN)预测模型。
图2为脑胶质瘤患者和健康人的蛋白质质荷比峰。
图3为乳腺癌患者和健康人的蛋白质质荷比峰。
图4为肝癌患者和肝硬化患者的蛋白质质荷比峰对照。
图5为肝癌患者和健康人的蛋白质质荷比峰对照。
具体实施例方式
本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例一 本发明的检测方法1.血清标本在冰浴中解冻后3000rpm离心5分钟，取10ul用90ul0.5％CHAPS(3-环乙胺-1-丙磺酸)(pH7.4)溶液稀释后加入到Cibacron Blue3GA(白蛋白亲和树脂Sigma)中，在4℃摇床上反应60分钟，12000rpm离心5分钟(4℃)，取上清溶液50ul，进一步用20mM HEPES[N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2(丙磺酸)](pH7.4)(H4)/50mM乙酸钠(pH4.0)(WCX2)稀释至200ul，加至已装好H4/WCX2芯片的Bioprocessor(96孔上样器，美国Ciphergen)中，振荡器上振荡60分钟。甩去血清标本，20mM HEPES(pH7.4)(H4)/50mM乙酸钠(pH4.0)(WCX2)200ul清洗芯片3次×5分钟，再用去离子水清洗芯片2次×1分钟，干燥后加0.5ul能量吸收分子CHCA(α-氰基-4-羟基苯乙烯酸，美国Ciphergen)2次到已经结合上蛋白质的H4/WCX2芯片上，干燥。SELDI质谱系统校正到分子量误差小于0.1％。将结合好蛋白质的H4/WCX2蛋白芯片用质谱阅读仪分析。用Ciphergen ProteinChip Software 3.1(美国Ciphergen)软件收集质谱信号。
2、生物信息学方法应用Ciphergen ProteinChip Software 3.1软件同时将所有样本的质谱图在2000到30000的m/z峰进行两次信噪比过滤，并将他们的强度值初始化到-1至1范围内。
(1)特征向量选择每个质荷比峰对各类样本区分的相对重要性都不同，这里综合用了计算建立人工神经网络的均方误差值(mse)[5]、以及t检验的p值和接受特性(ROC)曲线的方法来评价每个峰的相对重要性。
计算均方误差的人工神经网络是一个3层的网络，隐含层有2个神经元，输出层1个神经元。采用sigmoid传递函数，运用共厄梯度学习方法改善反向传播算法。分别以各个质荷比作为特征向量输入，用所有的样本作为训练，迭代1000次，以最终均方误差值(各样本的期望值与输出值差的平方和)的大小来评价各质荷比的对分类的相对重要性。均方误差越小表明各样本在这个质荷比峰的值与分类的相关性越好。以此来初步筛选特征向量。
(2)综合神经网络模型人工神经网络模型在肿瘤的识别上有着广泛的应用[6，7]，本发明的人工神经网络运用共厄梯度学习方法改善的反向传播算法[8]，4层结构，除输入层外还包括两个分别含100个神经元的隐含层，和含一个神经元的输出层。在样本划分时，我们将总样本集随机的划分将所有样本随机分出2/3用来训练神经网络，剩余的1/3作为测试集，用测试集的准确率来评价模型。这样重复划分样本10次，得到10个准确率，取平均值。这样将很好的使训练与测试样本相互独立，更好的估计建立模型的真实准确率。
在训练神经网络的过程中本发明引入了交叉验证的过程，它可以监督训练过程，网络在过适应之前停止训练[6]，使建立的神经网络具有更好的推广性，在未知样本的预报上给出更加可靠的结果。训练样本同样被随机划分，取其中1/3作为交叉验证样本，剩余的2/3样本作为训练样本，训练过程中每次叠代都用验证样本做交叉验证，到验证样本过适应之前停止训练。用这个模型去预测测试样本。这样重复随机划分样本1000次，建立1000个独立的神经网络，测试样本的最终预测值取1000个神经网络预测的平均值。这种方法不但能防止训练过适应，还可以通过平均多次预测结果避免神经网络预测的误差，使结果更稳定可靠(参见图1)。
(3)支持向量机模型
支持向量机是vapnik等1995提出的一种新的分类技术[9]，模式识别中小样本模型的推广性、模型选择、过拟和、维数灾难等问题在支持向量机中都得到了很好的解决。目前支持向量机在生物学上得到了广泛的应用[10，11]。这里采用线性的支持向量机分类器(linear SVM Classifier)罚分因子C设为1。采用3倍交叉验证(3Cross-Validation)的方法建立模型并估计模型的总体准确率。
(4)候选生物标志物的确定和检测模型的建立对初步筛选的特征向量进行进一步的筛选。用按相关重要性逐步增加质荷比峰数量的方法建立多个综合神经网络并评价其预测的成功率，最后我们筛选出最高准确率的质荷比峰组合。以最高准确率的质荷比峰组合作为输入用2/3样本来训练神经网络，剩余的1/3作为测试集，这样重复划分样本10次，得到10个准确率，取平均，用测试集的准确率来评价模型。同时用3倍交叉验证的支持向量机模型检验其预测的效果。
实施例二 脑肿瘤检测应用实施例一的方法对28例胶质瘤患者、37例脑良性肿瘤患者、40例健康人的血清蛋白质指纹图谱进行了检测分析。数据分析采用人工神经网络工具完成。①将胶质瘤(n＝28)作为受试组，健康对照(n＝40)作为对照组进行比较；②将胶质瘤(n＝28)作为受试组，脑良性肿瘤(n＝37)作为对照组进行比较。取所要比较的两组总样本的2/3样本做为训练集建立神经网络模型，1/3样本做为测试集以对建立的模型做盲法检验。用初步筛选的质核比峰按P值大小从小到大依次排列，并按从小到大依次输入来训练已建立的神经网络模型，直到敏感性和特异性都不再提高时，此模型作为最终的诊断模型。同时由于胶质瘤的样本数较小，采用SPSS10.0软件判别胶质瘤I-II级(15例)和胶质瘤III-IV(13例)。进而建立以下诊断模型1.胶质瘤和健康人对照血清蛋白指纹图诊断模型 为了寻找能鉴别脑胶质瘤和健康人群的潜在标志物，28个来源于胶质瘤样本的蛋白表达质谱与40个来源于健康人群的蛋白表达质谱相比较；聚类和峰值分析后选117个荷质比峰，进一步用神经网络筛选出8214.77m/z、8926.76m/z、4815.11m/z、8612.23m/z、2082.19m/z、4299.87m/z、2103.55m/z、7764.82m/z、2368.19m/z、3226.97m/z、2389.55m/z、2021.78m/z、4469.09m/z、6457.054m/z和8702.416m/z15个荷质比峰，参见图2，图2为质荷比分别是8214m/z(A)和2368m/z(B)的两个蛋白质质荷比峰，左为质谱图，右为模拟电泳图，均为3例脑胶质瘤患者和3例健康人的对照。用这15个标记物组成优化组合作为建立神经网络的输入变量和分类的最终判断依据。以45例样本作为训练集建立神经网络，另以23例样本作为盲法测试，测试集的准确率95.7％(22/23)，敏感度为88.9％(8/9)，特异性为100％(14/14)，阳性预测率为90％(9/10)，阴性预测率为100％(14/14)，参见表1。
表1.胶质瘤和健康人比较的均值(mean)、标准差(SD)和p值胶质瘤 健康对照质荷比峰 P(均值±标准差)(均值±标准差)8214.774 0.70892±0.421845 1.784804±1.2981625.12E-078926.763 2.78242±1.255198 4.009776±1.1293635.74E-064815.106 4.237016±1.4068637.01661±3.539101 2.40E-058612.234 1.568096±0.5530372.407218±0.94228 0.0002262082.189 4.20321±2.001461 8.937125±6.0947170.0004024299.871 2.807823±1.0988753.915422±1.4436 0.0005572103.549 1.945323±1.3179363.139134±1.3552570.0008027764.823 0.596946±0.2462970.977006±0.5078070.0014222368.193 7.877061±4.33783 5.041035±2.77071 0.0036913226.972 6.0137±2.730695 4.442262±1.8712770.0102592389.547 2.728048±1.2899431.91857±1.102702 0.011022021.778 13.93398±9.66345617.32217±8.4759610.0126954469.088 3.583581±1.8078654.78325±2.204768 0.0131476457.054 7.442496±2.7675415.882679±2.1398460.0131478702.416 1.740826±0.56574 2.144117±0.7158420.0161732.脑胶质瘤与脑良性肿瘤血清的蛋白指纹图诊断模型 为了寻找能鉴别脑胶质瘤和脑良性肿瘤的潜在标志物，28来源于胶质瘤样本的蛋白表达质谱与37个来源于脑良性肿瘤样本的蛋白表达质谱相比较；用神经网络对223个经过初步筛选的峰进行分析，总共65样本被随机划分为训练组(43)和测试组(22)，通过自动优化，共1组22个质核比峰，即2256.76m/z、23481.05m/z、9198.31m/z、22513.91m/z、22888.73m/z、23087.61m/z、23087.61m/z、4155.28m/z、2489.11m/z、2246.47m/z、2617.14m/z、15099.38m/z、22666.41m/z、29047.13m/z、14378.33m/z、24002.85m/z、2891.43m/z、14047.77m/z、2006.00m/z、14951.04m/z、2267.22m/z、23672.58m/z和22331.29m/z被最终筛选出来作为标志物，准确率、敏感性和特异性、阳性预测率和阴性预测率分别为93.8％(15/16)、88.9％(8/9)、100(7/7)％、100％(9/9)和87.5％(7/8)，参见表2。
表2.胶质瘤和脑良性肿瘤比较的均值(mean)、标准差(SD)和p值胶质瘤良性脑肿瘤对照质荷比峰 P(均值±标准差)(均值±标准差)2256.7572.893485±1.38871 4.052768±1.2571620.00106723481.050.109464±0.0599890.141506±0.0579240.0026379198.3131.267601±0.4059231.552553±0.3454060.00387722513.910.282157±0.1358110.363743±0.1206540.00439622888.730.201084±0.1083070.263462±0.0981980.0058623087.610.169551±0.0899460.213471±0.0841810.0061024155.2844.653484±4.6245755.916488±3.5069480.0066122489.1052.096568±1.0712511.389716±1.0719540.0071612246.4652.55764±1.116384 1.839567±1.0638310.007752617.1391.538691±0.8865991.012643±0.8414430.00838215099.380.323022±0.1727050.43022±0.170605 0.0090622666.410.244899±0.12878 0.314646±0.1143150.00941729047.130.029825±0.0224390.047416±0.0379890.00941714378.330.388368±0.1926270.505757±0.2002050.01016924002.850.06224±0.035671 0.07909±0.035296 0.0118342891.4291.361056±0.75447 0.890755±0.8024950.01373714047.770.624487±0.5764950.863565±0.6973550.0153372006.0012.745216±1.3942231.932315±1.2919290.01590614951.040.412403±0.2276320.539074±0.2304040.0170992267.2182.801537±1.2297892.046149±1.3476490.01903623672.580.084756±0.0497760.106556±0.0496610.01903622331.290.340582±0.16395 0.414451±0.1371320.023491
3.脑膜瘤和健康人对照血清蛋白指纹图诊断模型32来源于脑膜瘤样本的蛋白表达质谱与40个来源于健康人样本的蛋白表达质谱相比较；用神经网络对30个经过初步筛选的峰进行分析，总共72样本被随机划分为训练组(48)和测试组(24)，通过自动优化，共1组5个质核比峰，即8215.54m/z，2367.067m/z，8937.85m/z，21982.55m/z和14045.22m/z被最终筛选出来作为标志物，准确率、敏感性和特异性、阳性预测率和阴性预测率分别为95.8％(23/24)、100％(10/10)、92.9％(13/14)100％(11/11)和f92.9％(13/14)，参见表3。
表3.脑膜瘤和健康人比较的均值(mean)、标准差(SD)和p值
实施例三 乳腺癌检测应用实施例一的方法对49例乳腺癌患者、37例乳腺非癌疾病患者、33例健康人的血清蛋白质指纹图谱进行了检测分析。列出乳腺癌与健康人血清蛋白质质谱数据比较中得到的所有差异表达蛋白质峰，应用按相关重要性逐步增加质荷比峰数量的方法建立多个综合神经网络并评价其预测的成功率，进而从筛选出检测准确率最高的前4个质荷比峰组合，它们的质荷比分别为17.3kDa、26.3kDa、5.7kDa和8.9kDa。在所有的82例标本中重新随机抽样55例(乳腺癌患者32例，健康人23例)建立新的训练集，收集新训练集中质荷比位于上述4个位置的蛋白质质谱数据，建立简化的诊断模型并将数据返回模型进行检验，结果这一简化模型亦将新训练集中的所有乳腺癌患者和健康人准确分类，灵敏度和特异度均为100％。进而应用这一简化模型对重新随机抽样的测试集27例(乳腺癌患者17例，健康人10例)标本进行盲法分析和预测，结果17例乳腺癌患者中有13例，10例健康人中有9例被正确预测，诊断灵敏度为76.47％(13/17)，特异度为90.00％(9/10)，参见表4。
表4.新抽样的27例测试集标本在简化诊断模型中的盲法验证(例)乳腺癌 健康人 总计乳腺癌(预测)13(76.47％)1(10.00％)14健康人(预测)4(23.53％) 9(90.00％)13总计17 1027通过对49例乳腺癌患者和37例乳腺非癌疾病患者血清蛋白质质谱数据的比较，共得到两者间表达差异有统计学意义的蛋白质峰21个。判别分析显示其中6个蛋白质峰组合所构建的检测模型能达到最佳检测效果8611m/z、16827m/z、25711m/z、28931m/z、25485m/z、2437m/z，参见表5、图3，图3为质荷比分别是5750m/z(A)和8923m/z(B)的两个蛋白质质荷比峰，左为质谱图，右为模拟电泳图，均为3例乳腺癌患者和3例健康人的对照。原始判别和交叉验证所得结果相同，总准确率80.2％(69/86)，灵敏度81.6％(40/49)，特异度78.4％(29/37)，参见表6。
表5.乳腺癌组和乳腺非癌疾病组比较中构建模型的6个蛋白质峰(mean±SD)蛋白质峰(m/z)非乳腺癌组 乳腺癌组 P值8611 1.454063±0.5258032.139016±1.7308680.00641616827 0.105736±0.0524040.076068±0.0363720.00712725711 0.032668±0.0214700.022340±0.0141300.01128228931 0.031256±0.0192720.038361±0.0159460.01276625485 0.033114±0.0182480.024376±0.0119050.0236082437 0.928591±0.8143061.293718±0.8440340.032247表6.模型交叉验证的结果(例)乳腺非癌疾病 乳腺癌 总计乳腺非癌疾病(预测) 29(78.4％) 9(18.4％) 38乳腺癌(预测) 8(21.6％) 40(81.6％)48总计 37 4986
实施例四 肝癌检测应用实施例一的方法对52例肝癌患者、22例肝硬化患者、32例健康人的血清蛋白质指纹图谱进行了检测分析。
应用Ciphergen ProteinChip Software 3.1过滤噪音后在2k到30kDa之间肝癌患者与肝硬化患者比较得到248个差异表达的质荷比峰，肝癌患者与健康人之间比较得到220个差异表达的质荷比峰，分别将他们的强度值初始化到-1至1范围内。综合运用计算建立人工神经网络的均方误差值(mse)、以及t检验的p值和接受特性(ROC)曲线的方法初步筛选并排列出了20个峰。对这些候选标记物进行了进一步的筛选。用按相关重要性逐步增加质荷比峰数量的方法建立多个综合神经网络并评价其预测的成功率，最后从肝癌患者与肝硬化患者比较种筛选出最高准确率的前2个质荷比峰组合(表7)，肝癌患者与健康人只用一个峰就可以完全准确的判断了(表8)。
表7.肝癌患者与肝硬化患者比较筛选的候选蛋白质的质荷比峰统计质荷比值 肝硬化(均值±标准差)肝癌(均值±标准差)P13134.86 0.148808±0.082426 0.063427±0.0428961.58×10-057759.08685.743819±2.895665 3.156772±1.8603338.63×10-05表8.肝癌患者与健康人比较筛选的候选蛋白质的质荷比峰统计质荷比值 肝硬化(均值±标准差)肝癌(均值±标准差)P3015.52690.346975±0.397694 5.988438±2.8942176×10-10肝癌患者与肝硬化患者比较最终筛选出的质荷比峰分别为13134m/z和7759m/z(表7)，用他们将作为潜在生物标记建立区分肝癌与肝硬化的检测模型。这2个质荷比峰在肝癌患者血清中均高表达，在肝硬化患者血清中表达下调，参见图4，图4是质荷比分别是13134m/z(A)和7759m/z(B)的两个蛋白质质荷比峰，左为质谱图，右为模拟电泳图，均为3例肝癌患者和3例肝硬化患者的对照。做常规统计分析2个峰t检验p值都小于10-4，t检验和ROC曲线的结果显示了他们在肝癌和肝硬化对照样本中差异显著性。
联合2个潜在生物标记作为输入，用49例样本训练神经网络，25例样本作为测试建立综合神经网络预测模型。在测试集上分析模型的特异性为87.50％，敏感度为88.24％(表9)。
表9.25例测试集样本在肝癌/肝硬化检测模型中的验证(单位例)肝癌患者肝硬化患者合计预测为肝癌患者 15(88.24％) 1(12.50％)16预测为肝硬化患者2(11.76％) 7(87.50％)9合计17 8 25肝癌患者与健康人比较最终筛选出的质荷比峰分别为3015m/z，用他们将作为潜在生物标记建立区分肝癌患者与健康人的检测模型。这个质荷比峰在健康人血清中高表达，在肝癌患者血清中表达下调，参见图5，图5是质荷比3015m/z的一个蛋白质质荷比峰，左为质谱图，右为模拟电泳图，为3例肝癌患者和3例健康人的对照。做常规统计分析此峰t检验p值都小于10-10，t检验和ROC曲线的结果显示了其在肝癌和健康对照样本中差异显著性。
用3015M/Z作为潜在生物标记作为输入，用56例样本训练神经网络，28例样本作为测试建立综合神经网络预测模型。在测试集上分析模型的特异性为100％，敏感度为100％(表10)。
表10.28例测试集样本在肝癌/健康人检测模型中的验证(单位例)肝癌患者健康人 合计预测为肝癌患者17(100.00％)0 17预测为健康人 0 11(100.00％)11合计 17 11 28本发明检测方法不限于上述肝癌，脑肿瘤和乳腺癌的检测，可同时应用于其他肿瘤的检测对象。
实施例五 与其他非侵入性肿瘤检测方法的比较现阶段脑肿瘤的检测主要依靠影像学手段，尚无一种敏感特异的的肿瘤标志物可用于临床[12，13]。影像学不能完成脑肿瘤的术前性质的判别、术后复发的监测等工作，客观上要求建立新的方法尤其是在蛋白质水平上寻找肿瘤标记物。乳腺癌的检测则主要依靠自我检查、临床体检和钼靶摄片等经典手段，对于肿块较小甚至难以扪及明确肿块的患者以及乳腺较致密而钼靶摄片检测较困难者，仅靠传统手段就存在一定困难。现有乳腺癌肿瘤标志物如CA15.3、CA27.29、CEA等，阳性率仅为25％～50％[14-16]，目前美国FDA也仅推荐其在乳腺癌复发和转移的监测中有一定参考价值，而对早期检测的价值则较低[17]。肝脏肿瘤的检测虽然有较为敏感的AFP(敏感性80％左右)用于临床，但特异性不强，往往要求达到400μg/ml以上才能确诊，而对AFP低表达的肝癌与肝硬化的鉴别目前尚无理想的方法[18，19]。
与传统的非侵入性肿瘤检测方法相比，本发明能高通量的同时找到多个蛋白质标志物来反映被检样本中蛋白质的全貌，因此能克服传统单一标志物检测所存在的缺陷，更符合肿瘤发生发展多因素、多步骤的复杂的相互作用的结果的事实。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
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权利要求
1.检测四种常见肿瘤血清蛋白质的方法，四种常见肿瘤是指脑胶质肿瘤、脑膜肿瘤、乳腺肿瘤、肝癌，具体通过以下步骤实现(1)用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱，(2)结合生物信息学的方法筛选出相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分析，其中采用疏水结合表面芯片H4检测脑肿瘤、乳腺肿瘤的蛋白质质谱，用弱阳离子结合表面芯片检测肝癌的蛋白质质谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(2)是采用反向传播算法人工神经网络、支持向量机方法筛选肿瘤标志物。
3.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是脑胶质肿瘤标志物由15个蛋白质质荷比峰组成2021m/z、2082m/z、2103m/z、2368m/z、2389m/z、3226m/z、4299m/z、4469m/z、4815m/z、6457m/z、7764m/z、8214m/z、8612m/z、8702m/z和8926m/z。
4.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是脑膜肿瘤标志物由5个蛋白质质荷比峰组成2367m/z、8215m/z、8937m/z、14045m/z和21982m/z。
5.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是从健康人群中检出乳腺肿瘤的标志物由4个蛋白质质荷比峰组成5750m/z、8923m/z、17338m/z和26267m/z。
6.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是从乳腺非癌疾病患者人群中检出乳腺肿瘤的标志物由7个蛋白质质荷比峰组成3341m/z、4182m/z、6547m/z、6614m/z、8625m/z、25485m/z和26591m/z。
7.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是从健康人群中检出肝癌的标志物由2个蛋白质质荷比峰组成3015m/z、5900m/z。
8.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是从肝硬化患者人群中检出肝癌的标志物由2个蛋白质质荷比峰组成13134m/z和7759m/z。
全文摘要
本发明提供检测四种常见肿瘤血清蛋白质的方法，四种常见肿瘤是指脑胶质肿瘤、脑膜肿瘤、乳腺肿瘤、肝癌，通过以下方案实现(1)用表面加强激光解吸电离－飞行时间质谱(SELDI)仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱；(2)结合生物信息学的方法筛选出相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分析。本发明方法在筛选这些肿瘤药物中应用，也为肿瘤的早期发现、早期检测提供了新的途径和方法，所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的肿瘤标志物提供了基础和资源；同时也为探索肿瘤发生发展的机制提供了新思路。
文档编号G01N30/88GK1588061SQ20041006630
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月8日 优先权日2004年9月8日
发明者郑树, 余捷凯, 刘建, 胡跃, 张书展 申请人:浙江大学
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