专利名称：兔抗鹅IgY+IgY(△Fc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种酶抗体结合物及其制备方法，具体地说是辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体。
背景技术：
酶免疫检测技术是以酶的反应放大作用和抗原-抗体特异性结合特性为原理、以酶抗体和/或抗原结合物为基础的一种新型检测技术。其包括酶免疫组织化学染色和酶免疫检测技术(包括固和非固相酶免疫检测技术)，前者主要用于组织、细胞的免疫检测，后者主要用于抗原/抗体的检测。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫检测技术中发展最快、应用最广泛的一种，其以快速、准确、灵敏的特点逐渐成为一种公认的检测技术。目前，该检测技术已在部分动物疫病检测中使用，但仅有极少数鹅类疾病的检测使用该技术。原因很多，其中缺乏一种高质量、可商品化生产的酶标记抗体是阻碍其发展的主要原因之一。
我国是世界养禽大国，更是世界主要鹅类养殖地和消费国，鹅类养殖业的持续、稳定、健康发展不仅直接关系到我国农村发展、农民增收，而且关系到我国畜牧业的持续稳定发展。而酶标记抗鹅抗体不仅为鹅类疫病的检测搭建物质平台，更为鹅类整体免疫机理的研究提供物质支持，并最终为鹅类养殖业的发展提供技术平台。
发明内容本发明的目的在于提供辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的本发明中所使用的缩写分别代表PBS磷酸盐缓冲液；PB磷酸缓冲液；DE52阴离子交换纤维素；Sephodex G200葡聚糖G200；IgY免疫球蛋白YIgY(ΔFc)免疫球蛋白Y(ΔFc)。
本发明的兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体是(1)它是由辣根过氧化物酶与兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体组成的酶抗体结合物，其可与鹅免疫球蛋白IgY和IgY(□Fc)特异性结合，并可使辣根过氧化物酶的底物显色；(2)它是克分子比在1.0-2.0之间，酶活性＞1000U/mg(临联茴香氨法)，ELISA使用浓度＞1∶1000，Weston-Blotting使用浓度＞1∶500的产品。
本发明的兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体是采用这样的方法来制备的1)纯化鹅卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)按v/v为卵黄∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混匀，3000r/min离心30min，取上清，用终浓度(w/v)分别为18％、14％、9％、14％的无水Na2SO4依次盐析，3000r/min离心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用适量PBS悬浮，4℃PBS透析72h，将透析物2000r/min离心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)为洗脱液，过DE52纤维素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；2)兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体的制备和纯化首免，弗氏完全佐剂与鹅卵黄免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v为1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多点注射；以后每隔14～28d加强免疫，二免改用弗氏不完全佐剂，剂量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳缘静脉注射，心脏采血，37℃，1h，4℃过夜析出并收集血清；10ml血清经50％和33％饱和硫酸铵依次盐析3次，末次沉淀用2～4m1的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并对其透析除盐，以PB(0.01mo1/L，pH7.4)为洗脱液过DE52离子交换层析柱纯化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；3)改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体将N×4mg辣根过氧化物酶溶于N×1ml去离子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃搅拌20min，于醋酸钠缓冲液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析过夜，加入N×mg纯化的兔抗鹅抗体，立即加入0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(pH9.5)调节pH值致9-9.5，20～25℃搅拌2h(注N为常数)；4)标记物的纯化将上述标记物平均分为2份，一份用50％饱和硫酸铵盐析30min，离心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除盐；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析过夜，并以其为洗脱液过SephodexG200层析柱，1ml/15min，2ml/管，将两部分合并；5)酶标记抗体的质量鉴定280nm和403nm测定其OD值，计算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、结合物标记率(A403/A280×100％)酶结合物产率(酶含量×结合物总体积/最初加入酶量)，联茴香胺法测定标记物及的酶学活性，直接ELISA测法定其最佳使用浓度。当酶标记抗体的酶结合物产率在30％-60％之间、克分子比在1.0-2.0之间、酶结合物标记率＞60％，酶活性＞1000U/m g、使用浓度＞1∶1000时符合制备标准。
采用本发明的方法可用于①本方法可用于提纯鹅类卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)；②本方法可用于兔抗鹅辣根过氧化物酶标记坑体的质量鉴定；采用本发明生产的产品可用于①本产品可用于鹅类相关酶免疫组织化学染色。
②本产品可用于鹅类相关的各种匀相和非匀相免疫酶检测技术，主要包括各种ELISA试验、Weston-Blotting、酶免疫沉淀试验等。
本发明的产品优点表现在应用此酶标记抗体可以建立多种鹅类疫病检测技术，预防鹅类多种传染病。
具体实施方式
1)纯化鹅卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)按v/v为卵黄∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混匀，3000r/min离心30min，取上清，用终浓度(w/v)分别为18％、14％、9％、14％的无水Na2SO4依次盐析，3000r/min离心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用适量PBS悬�。�4℃PBS透析72h，将透析物2000r/min离心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)为洗脱液，过DE52纤维素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；2)兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体的制备和纯化首免，弗氏完全佐剂与鹅卵黄免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v为1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多点注射；以后每隔14～28d加强免疫，二免改用弗氏不完全佐剂，剂量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳缘静脉注射，心脏采血，37℃，1h，4℃过夜析出并收集血清。10ml血清经50％和33％饱和硫酸铵依次盐析3次，末次沉淀用2～4ml的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并对其透析除盐，以PB(0.01mol/L，pH7.4)为洗脱液过DE52离子交换层析柱纯化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰；3)改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体将N×4mg辣根过氧化物酶溶于N×1ml去离子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃搅拌20min，于醋酸钠缓冲液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析过夜，加入N×mg纯化的兔抗鹅抗体，立即加入0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(pH9.5)调节pH值致9-9.5，20～25℃搅拌2h(注N为常数)；4)标记物的纯化将上述标记物平均分为2份，一份用50％饱和硫酸铵盐析30min，离心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除盐；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析过夜，并以其为洗脱液过SephodexG200层析柱，1ml/15min，2ml/管，将两部分合并；5)酶标记抗体的质量鉴定280nm和403nm测定其OD值，计算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、结合物标记率(A403/A280×100％)酶结合物产率(酶含量×结合物总体积/最初加入酶量)，联茴香胺法测定标记物及的酶学活性，直接ELISA测法定其最佳使用浓度。当酶标记抗体的酶结合物产率在30％-60％之间、克分子比在1.0-2.0之间、酶结合物标记率＞60％，酶活性＞1000U/mg、使用浓度＞1∶1000时符合制备标准。
权利要求
1.兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体，其特征是(1)它是由辣根过氧化物酶与兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体组成的酶抗体结合物，其可与鹅免疫球蛋白IgY和IgY(□Fc)特异性结合，并可使辣根过氧化物酶的底物显色；(2)它是克分子比在1.0-2.0之间，酶活性＞1000U/mg，ELISA使用浓度＞1∶1000，Weston-Blotting使用浓度＞1∶500的产品。
2.兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体的制备方法，其特征是1)纯化鹅卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)按v/v为卵黄∶PBS(pH7.4 0.01mol/L)∶氯仿＝1∶2∶3的比例混匀，3000r/min离心30min，取上清，用终浓度(w/v)分别为18％、14％、9％、14％的无水Na2SO4依次盐析，3000r/min离心30min，其中，第三次取上清，其余三次取沉淀，末次沉淀用适量PBS悬�。�4℃PBS透析72h，将透析物2000r/min离心10～15min，以PB(PH7.4，0.01mol/L)为洗脱液，过DE52纤维素柱，1ml/min，1管/5min，收集第一峰，提纯鹅卵黄免疫球蛋白的浓度在1.0～5mg/ml之间，纯度＞90％；2)兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体的制备和纯化首免，弗氏完全佐剂与鹅卵黄免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v为1∶1的比例混合，2ml/只兔背部皮下多点注射；以后每隔14～28d加强免疫，二免改用弗氏不完全佐剂，剂量方式同上；三免1ml(0.4mg/ml)耳缘静脉注射，心脏采血，37℃，1h，4℃过夜析出并收集血清；10ml血清经50％和33％饱和硫酸铵依次盐析3次，末次沉淀用2～4ml的PBS(0.01mol/L，pH7.4)溶解并对其透析除盐，以PB(0.01mol/L，pH7.4)为洗脱液过DE52离子交换层析柱纯化，1ml/min，1管/5min，收集第一峰，兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)血清效价＞1∶32，纯化兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体效价＞1∶16，且其浓度1mg/ml～4mg/ml、纯度＞90％；3)改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体将N×4mg辣根过氧化物酶溶于N×1ml去离子水，加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L)，20～25℃搅拌20min，于醋酸钠缓冲液(pH4.4，0.001mol/L)4℃透析过夜，加入N×mg纯化的兔抗鹅抗体，立即加入0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(pH9.5)调节pH值致9-9.5，20～25℃搅拌2h，其中N为常数；4)标记物的纯化将上述标记物平均分为2份，一份用50％饱和硫酸铵盐析30min，离心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L，pH7.4)，并于PBS透析除盐；另一部分以PB(0.02mol/L，pH7.2)透析过夜，并以其为洗脱液过SephodexG200层析柱，1ml/15min，2ml/管，将两部分合并；5)酶标记抗体的质量鉴定280nm和403nm测定其OD值，计算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、结合物标记率(A403/A280×100％)酶结合物产率(酶含量×结合物总体积/最初加入酶量)，联茴香胺法测定标记物及的酶学活性，直接ELISA测法定其最佳使用浓度。当酶标记抗体的酶结合物产率在30％-60％之间、克分子比在1.0-2.0之间、酶结合物标记率＞60％，酶活性＞1000U/mg、使用浓度＞1∶1000时符合制备标准。
全文摘要
本发明提供的是兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体及其制备方法。本发明辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体是利用盐析、层析等蛋白纯化技术和酶标记技术，在提纯鹅卵黄免疫球蛋白的基础上，免疫家兔制备并纯化兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体，再通过改良过碘酸钠法将其与辣根过氧化物酶结合，并采用盐析及Sephodex G200纯化，从而制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体。应用此酶标记抗体可以建立多种鹅类疫病检测技术，预防鹅类多种传染病。
文档编号G01N33/535GK1818651SQ20061000980
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月13日 优先权日2006年3月13日
发明者王君伟, 孙凌霜 申请人:东北农业大学
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