专利名称：用于检测生物颗粒群的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测表面上的生物颗粒群的方法，所述生物颗粒例如为微生物 (细菌、酵母菌、真菌等)或植物细胞或动物细胞，所述表面例如为培养基的表面或功能化基底的表面。这些颗粒呈微观尺寸，通常约为O. 5μπι至3mm，更特定地在O. 5μπι至ΙΟμπι的范围内。
本发明特别适用于检测微生物的群落。
背景技术：
在众多应用中，期望尽可能快地检测培养基(通常是营养凝胶表面)上的微生物 (如细菌或酵母菌)的生长。一般情况下，由于琼脂培养基的表面常常在遍布几毫米(mm)的距离中呈现几微米(μ m)的局部深度缺陷，因此该琼脂培养基的表面与精确地呈平面有着显著偏离。与样本一起输送的灰尘或碎片也可以引起呈高空间频率的局部表面变形。
细菌和酵母菌在生长的初期是难以识别的，这是由于它们吸收很少的可见光、近紫外光或近红外光，并且它们的折射率非常接近周围介质的折射率。因此，通常情况下，只有直径大于100 μ m的菌落才可以通过肉眼检测到，菌落生长到这样的尺寸所需要的时间通常约为6小时(h)至24h。
用高倍显微镜检查，优选地以黑色为背景，是一种可行的方法，但很难实现。
通常使用其他技术。
例如，可以通过由微生物的新陈代谢转化为荧光物质的各种非荧光添加剂来使微生物发荧光，选择在微生物内保留长时间的荧光物质。在细菌发荧光前，该方法需要大量的时间(大于5小时)，并且该方法还需要形成产生荧光的代谢产物。
类似地，颜色生成介质使得能够以选择性的方式观察微生物，但存在同样的问题在肉眼可见之前，染色需要相当长的时间(几小时)。
此外，所有这些方法有着导致微生物的代谢严重紊乱的危险，而随后的测试(例如，测量对抗生素的敏感度)需要使微生物在最有利的可能条件下生长。发明内容
本发明的目的是通过提供一种尽可能少侵入性地检测生物颗粒群以及可以实现小尺寸群(如生长初期的微生物群落)的早期检测的方法来减轻上述的缺点。
根据本发明，通过一种检测表面上的生物颗粒群的方法来实现这样的目的，所述方法包括以下步骤
a)确定所述表面的地貌表示；以及
b)在所述地貌表示中检测至少一个限定可能对应于生物颗粒群的区域的轮廓。
使用适当编程的计算机或其它电子数据处理器装置，结合适当的测量装置(特别用于进行步骤a ))，来实施这些步骤。
在本发明的有利的实现方式中
一所述生物颗�？梢匝∽晕⑸�(如细菌、酵母菌或真菌)以及植物细胞或动物细胞。
一所述生物颗粒的直径或主尺寸可在ΙΟμ 至3mm范围内，或优选地小于或等于几百微米，如小于或等于100 μ m。
一所述表面可以选自培养基和周围介质(如空气)之间的界面、功能化基底的表面以及微孔膜的表面。
一可通过无接触以及无需准备样品进行的光学方法来实施确定所述表面的地貌表示的所述步骤a)，以保证最小的侵扰。具体地，其可以由彩色共焦微地貌或纹影摄影术或阴影摄影术(strioscopie)组成。
一所述步骤b)可在于，通过测量所述表面的地貌表示的局部坡度以及定阈值来实施检测至少一个轮廓。
一该方法还可以包括预处理所述地貌表示的操作，该预处理操作包括检测参考表面并减去该参考表面。
一该方法可以包括在连续的时间重复步骤a)和步骤b)，以及仅选择步骤b)中确定的形状或尺寸随时间变化的区域。
在本发明的有利的变型中，该方法可以包括另一步骤C)，所述步骤c)在于量化与检测到的群的尺寸(例如，其体积)有关的指标。当已知所考虑的生物颗粒的平均尺寸时， 这特别地有利。在这样的情况下，该步骤c)可以评估该群中存在的生物颗粒的量。单独来看，知道所关注的生物颗粒的平均尺寸，一旦群的尺寸被确定，则量化所述群中存在的生物颗粒的数量是容易的。当生物颗粒是微生物且设想对所述微生物进行随后处理(在这种情况下，有必要从群落中采取样品)时，本发明的这种变型是特别有利的。因此，这种变型可以确保存在的微生物的数量是足够的，例如在抽样前。
在本发明的有利的变型中，所述方法可以包括原位识别或非原位识别排列在群中的微生物的另一步骤。
参照附图阅读通过示例给出的以下描述后，本发明的其它特征、细节和优点变得明显，其中
一图1示出其上存在有细菌群落的培养基的表面；
一图2是示出实施本发明的方法的各个步骤的一图3示出在本发明的方法的第一变型中使用的彩色共焦微地貌的原理；
一图4A和图4B以及图5A、图5B、图5C、图和图5E示出通过对接
种细菌的培养基应用彩色共焦微地貌技术而获得的实验结果；
—图6A至图6D示出基于纹影摄影技术的本发明的方法的第二变型；以及
-图7A至7C示出基于阴影摄影技术的本发明的方法的第三变型。
具体实施方式
图1不出培养皿10的俯视图，该培养皿包括营养培养基(琼脂),营养培养基的表面11上生长有细菌群落12。本发明的方法致力于在这些群落的生长初期阶段，当群落的直径过小(几十微米，如30 μ m或小于30 μ m)而对肉眼不可见时，检测所述群落。所述培养基的表面11 (即，琼脂-空气界面)呈现出与琼脂的表面状态相关的不平顺部13。在图1的示例中，琼脂直接暴露在空气中，因此趋于干燥，从而导致其表面变形，特别是导致琼脂的平均高度发生变化。有利的是，检测琼脂表面上的生物颗粒群的方法考虑到这些表面不平顺部以及表面所受的变形。
本发明的方法利用已知的事实，即，营养培养基的表面处的细菌繁殖形成突起。所述突起的高度在群落生长初期约为几百纳米或几微米。本发明的观点在于，利用已知的表面形貌学技术，结合适当的图像处理，检测与所述生物颗粒群相关的突起。
如图2所示，本发明的方法的第一步骤El在于确定其上正生长有用于检测的群12 的表面11的地貌表示20。该图中所示的示例中，所述地貌表示是三维的，且特别以“三维板”的形式。该表面的每一个点具有在Oxy平面中的坐标(x，y)，且在三维地貌表示中与沿着轴线Oz的z坐标相关,所述轴线Oz优选地与Oxy平面垂直。该表示可以是在Ox、Oy和 Oz参考系中的三维表面的形式，或者是矩阵的形式，在该矩阵中，元素ai, j对应于具有Oxy 平面中的坐标(i，j)的点的沿z轴线的高度。
第二步骤E2是预处理地貌表示20的操作，该操作包括检测和减去基础表面。如上所述，所述表面11可能不好界定，甚至可能会随着时间而变化。为了确保良好地检测颗粒群，需要确定基础表面，该基础表面通过适当的数据处理得出，例如通过低通空间滤波， 其截止频率通常约为O. 001/微米(μ πΓ1)，例如，在1/2000 μ πΓ1至1/500 μ πΓ1的范围内。因准备培养基造成的划痕、厚度变化、甚至非均匀变化和偏离平面化全部消失。
在较简单的变型中，为了确定平坦的且倾斜的基础表面，计算表面区域附近的平均坡度。
附图标记21表示滤波后的三维板(更通常地地貌表示)，其中，低空间频率的不平顺部201 (例如，由于培养基13的不平顺部引起)已经通过上述处理操作消除。板21上剩下的都是尺寸足够小和/或空间频率足够高的不平顺部和高低不平部202。术语“高”用在空间频率中是指频率大于1/500 μ πΓ1。可以排除甚高频率的部分，即，对应于大于几μ πΓ1 的空间频率的部分，其中，这样的部分对应于构成培养基的凝胶的高低不平部。
第三步骤Ε3在于从所述三维板21提取轮廓22。在已知的方式中，可以由本领域技术人员公知的轮廓探测滤波器，通过测量所述板的局部坡度，之后通过定阈值，或通过带通空间滤波(例如具有位于Ι/δΟΟμπΓ1的几倍至1/ΙΟμπΓ1的几倍的范围内的通带的滤波器)，来检测轮廓。所述轮廓22中的至少一些轮廓限定封闭区域23，在第四步骤Ε4中，封闭区域23被确定为可能对应于生物颗粒群。所述步骤Ε4可以包括选择予以考虑的封闭区域的操作。例如，可以利用选择标准，由此仅有足够小尺寸(约数十微米的对角线或直径)的区域被保留为可能表示生物颗粒群。在变型或其组合中，可以连续地重复步骤El至步骤Ε4， 且仅选择形状或尺寸随着时间变化的区域22。生物颗粒群是随着时间变化的“活”结构，然而，在两个连续的测量之间，非生物结构即使发生变化，变化也非常小。这也可以测量所述群的生长速率。
可以通过应用其本身已知的各种不同的微地貌技术来实现所述方法的第一步骤 Ε1，该第一步骤在于确定其上生长有用于检测的群的表面的地貌表示。为了避免干扰待检测的群的生长，特别优选的是使用不涉及接触的技术，尤其是不涉及制备样品的光学技术(即，不依赖于使用染料、荧光团或其前体)。
在通常情况下，光学微地貌技术包括
一使用光源照射一表面，待获得关于该表面的三维表示；
-使用光传感器检测由所述表面反射或透射的光所对应的信号；以及
—根据检测到的信号确定所述表面的三维地貌表示。
对表面的照射可以自周围介质直接导向所述表面。当未使照射准直时，照射可以集中在待被测量的区域。光源可以在空间和/或时间上是相干的，或者其可以是不相干的。 光源可以是多色的或单色的。检测可以通过互补金属氧化硅(CMOS)、电荷耦合器件(CCD)、 光电倍增管、光电二极管等类型的一维图像传感器(带)或二维图像传感器(矩阵)来进行。所述传感器可以具有光谱测定功能，使得能够分析检测到的光的频谱。该传感器还可以与光圈或“小孔”连接，以构成共焦检测器设备。
下面详细描述构成本发明的优选实现方式的两种技术。然而，其它光学技术也可以应用至本发明的方法，例如通过自准直或图像处理而自动聚焦在所述表面上；干涉测量法和/或全息方法；分析反射波前锋等。
已经成功地应用于表面上的生物颗粒群的早期检测的第一微地貌光学技术是彩色共焦微地貌。彩色共焦微地貌已由供应商Stil S.A.开发出且在文献FR 2738343中予以详细描述。
图3示出了彩色共焦微地貌技术或彩色共焦成像。
白光(或在任何情况下的多色光)的点源300 (例如，以与小孔关联的广延性源的形式实现)发射出光束301，该光束通过物镜310聚焦。该物镜310呈现出扩展的轴向色差因此，光束301的各个频谱分量被聚焦在沿着所述物镜的光轴分隔开的相应焦点321、 322,323...处。以这种方式聚焦的垂直入射的光束被导向至样品的表面330上。由所述表面330反射的光再次穿过所述物镜310，这次朝向光源300传播；反射光的一部分由分光镜 340获�。止饩�340指向可轴向移动的小孔350，小孔350排列在分光光度计360的前面。 这进行空间滤波仅仅来自与小孔350共轭的点的光线可以到达分光光度计360。由于物镜310的轴向色度，因此这些光线呈现出相应的良好限定的波长Xi，波长Xi取决于物镜 310和反射表面330之间的距离H。因此，可以根据由分光光度计360所测定的波长λ ,来确定H。
因此，可以通过扫描来获得所述表面330的地貌表示。
已经通过利用接种的琼脂培养基和光学系统实验性地证明了用于实现本发明方法的技术的用途，该光学系统的特征在于
— I千赫(kHz )的采样频率；
一约300 μ m的距离动态范围；
—分光光度计使用1000像素的CXD带作为其检测器，每个像素编码300纳米(nm)的高度。
信号处理方法(例如，超像素化)使得可以获得小于300nm的垂直分辨率。这种已知的方法有助于通过组合相邻像素的内容来提高分辨率。
作为示例说明，可以使用来自供应商Altimet的装置Altisurf 500。
图4A和图4B以及图5A至图5E示出了实验结果。在这些图中，三维板被完全等效的且使用灰阶(深灰色代表低高度，浅灰色或白色代表较高的高度)的表示所取代。
图4A是由表皮葡萄球菌接种的琼脂培养基的表面的地貌表示。可以观察到,表面在数十微米中以带的形式变形。图4B示出预处理以减去基础表面后的相同表示。表面变形已消失，但观察到高度约2 μ m且直径范围为10 μ m至几百μ m的细菌群落是没有困难的。 此后，通过计算局部坡度和定阈值，自动识别群落。在该示例中所研究的琼脂表面的尺寸为1. 2mm X 5mm0
图5A是接种大肠杆菌的另一琼脂培养基的表面的减去背景之前的地貌表示。图 5B示出背景表面，显示出以带的形式的表面不平顺部，且图5C示出已减去背景后的表面， 其中细菌群落是清晰可见的。
图和图5E示出那些群落中的两个群落的一维轮廓随时间(在时间O小时、1. 3 小时、2. 2小时、3小时、3. 9小时)而变化。可以看出，约2小时后群落为可检测的，且可以跟踪它们的生长速率。
在该方法中，培养基表面的地貌表示是三维表示。所检测的轮廓对应于限定体积的封闭环。根据使用的轮廓检测方法，封闭环使对应于相同的坡度的像素或者对应于相同的高度的像素相互连接。
由轮廓限定的每个体积可以被一指标量化，该指标可以包括所述体积中包含的像素的重量的积分(即，高度)。当计算该积分时，可以对像素的重量定阈值。换言之，仅考虑超过一定阈值的重量值。可以基于组成该轮廓的一个或多个像素的重量或分布在所述轮廓所限定的表面区域中的一个或多个像素的重量，来建立该阈值。
当已知构成该体积的微生物的类型时，该指标可以估计其生物量。
在另一实现方式中，通过纹影摄影法检测生物颗粒群。
纹影摄影是一种已知的光学方法，且基于傅里叶光学原理。图6A示出了用于执行本发明的第二实现方式的纹影设置。
点源600发射出基本上是单色光的辐散光束601，辐散光束601随后通过物镜620 聚焦。包含接种的培养基的透明培养皿610直接位于物镜620的下游，以便使聚焦光束穿过培养皿610,接种的培养基的表面611上生长有用于检测的微生物群落612。遮罩630置于物镜620的焦平面中。遮罩遮挡来自光源的且穿过物镜和培养皿而不发生偏转的所有光线。如果表面611是完全平面的和均匀的(以及在几何光学近似内)，则光束601中的所有的光将都被遮罩拦截。实际中，表面不平顺部611 (包括由于群落612引起的不平顺部)使一些光线偏转，使得这些光线绕过该遮罩。从傅里叶光学的观点看，了解到，在物镜的焦平面中，形成对应于表面611的空间频谱的光分布，因此遮罩进行高通空间滤波。
成像系统(摄像机640)位于遮罩的下游，且聚焦于培养基的表面。通过成像系统获得的图像包含与表面611的局部坡度相关的信息，因此可以重构所述表面(更好地，该表面已经部分经受高通滤波，而不需任何预处理)的三维板。
考虑到遮罩具有有限的尺寸，仅检测那些偏转角度大于或等于阈值的光线。当遮罩尺寸与物镜的衍射图案的尺寸相同时，该阈值被最小化。如果假定光源600通常是点源 (始终近似)，则可以检测到的局部坡度仅仅是大于X/(n-l)d的坡度，其中，λ是所用光的波长，d是物镜的直径，以及η是培养基的折射率。角度α的局部坡度使光线偏转角度 (η-Ι)α，且仅可观察到大于衍射的偏差。在实际中，培养基具有约几毫弧度的表面缺陷，为了可以不需要任何预处理，这需要远远大于该理论限度的遮罩。遮罩的直径需要为约(n-1) l*pmax,其中,pmax是表面缺陷的最大局部坡度，I是物镜和遮罩之间的距离。厚度为Ium 且直径为30 μ m的微群落向波形表面赋予(1. 35-1)/15=23毫弧度的平均局部坡度，其远远大于凝胶的表面缺陷，且因此很容易看到。群落边缘处的局部坡度甚至更大，通常不小于几百微弧度(或十分之几弧度)。
纹影摄影术与几何映射技术(例如彩色共焦成像)相比的优点是，不必要有优于微群落的大小的横向分辨率因为使用黑色的背景，因此检测和定位小于分辨率极限的项目 (虽然本质上不可能将两个相互靠近程度大于所述分辨率极限的项目分离开)不存在困难。
另一个优点是，在单次采集中，相比于使用上述的共焦微地貌技术，所观察到的区域可以覆盖更广的区域。因此，通过纹影法获取的图像使得可以观察到培养皿广泛的部分或甚至培养皿所有部分。
在该方法中，所述培养基的表面的地貌表示是二维表示，S卩，图像，其中，两个相邻像素之间的强度变化代表所照射的表面的高度变化和/或所述表面的折射率的局部变化。 所检测到的轮廓对应于限定区域的封闭环。这些环将对应于灰度级的相同变化的像素连接在一起。
当两个相邻像素之间的高度变化是通过细菌群落而产生时，该细菌群落的边缘相对于培养基的表面形成通常大于十分之几弧度的角度。这样的坡度大于培养基的高度变化所形成的坡度，在培养基的高度所形成的坡度中，所涉及的角度通常小于10毫弧度。
图6B示出能够通过纹影摄影术实现本发明的方法的另一种设置。不同于图6A中的设置，当照射光束301’穿过透明的培养皿610时，使照射光束301’准直，且该照射光束被位于培养皿下游的第一物镜620’(物镜焦距200mm ;直径50mm-仅仅以示例的方式给出这些值)聚焦。第二物镜621(焦距10mm ;数值孔径NA f/3-也仅仅以示例的方式给出这些值)形成培养皿的图像。位于物镜620’的焦平面中的遮罩630’拦截非因所观察的表面611 中的局部坡度的变化或非因所述表面中的折射率的局部变化而被反射的光线(以及向下偏转的光线，即使这不是必须的)。当细菌群落在培 养基的表面611上生长时，其使入射在其上的光辐射偏转，使得光不集中于遮罩630’上，但由检测器640 (例如，具有1400Χ10003μπι 像素的摄像机)检测到。因此，因为细菌群落612引起表面611中的局部坡度波动，因此可以由检测器640检测到以黑色背景上的光点的形式的细菌群落。
使用平行的照射光束，而不是如图6Α的设置中的发散光束/会聚光束，具有使信号的强度与所观察的表面的部分的位置无关的作用。换言之，在整个观察区域中，所观察到的表面中的相同的局部坡度在检测器上产生具有相同强度的信号，而与该局部坡度在培养基610的表面611上的位置无关。
图6C对应于在大肠杆菌型细菌已被接种在大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)型琼脂的表面上8小时后来利用图6Β的设置观察大肠杆菌型细菌群落。白点对应于细菌群落。在图像的右下部分中形成明亮的直角的连续线对应于构成视觉参考的玻璃载片。
图6D是相同的培养基在接种24小时后的照片。可以看出，在图6D中拍摄的细菌群落与在图6C中示出的通过透射纹影摄影术检测的细菌群落之间具有良好的匹配。
纹影摄影术也可以在反射布局中实施，光源被布置成面向培养基，检测器也被布置成面向培养基。这适用于观察不透明的介质。
在另一实现方式中，通过实施阴影摄影技术的设置观察细菌群落。所述设置如图 7A中所示。平行光束穿过含有培养基的培养皿710，然后通过第一物镜720 (物镜焦距 200mm ;直径50mm-仅仅以示例的方式给出这些值)聚焦在检测器740上。当细菌群落712 在培养基的表面711上生长时，因为高度变化，以及因此形成在表面711上的局部坡度的变化，细菌群落使光辐射偏转。不同于纹影方法，通过高度变化和/或所观察的表面上的折射率变化而偏转的光辐射没有被检测器740(具有1400 X 10003 μ m的像素、物镜焦距f=10mm、 数值孔径NA=f/3的摄像机，仅仅以示例的方式给出这些值)获得。此装置用于借助由检测器740形成的图像上出现的暗区域来检测用于分析的平面型表面上的局部坡度。因此，在该方法中，细菌群落712以暗点的形式出现在浅背景中，该背景对应于培养基的表面711。
如以上关于纹影摄影的主题所述的，当实施阴影摄影术时，培养基表面的地貌表示是二维表示，即，图像，其中，两个相邻像素之间的强度变化表示所照射的物体表面的高度变化。该强度变化也可以表示所述表面的折射率的局部变化。
图7B示出了大肠杆菌型细菌群落被接种在TSA型琼脂的表面上8小时后使用图 7A的设置观察大肠杆菌型细菌群落的结果。暗点对应于细菌群落。可以观察到，这些群落位于与图6D的结果(照片)和通过透射纹影摄影得到的图6C中所示的观察相匹配的位置中。
同纹影技术一样，可以通过 阴影摄影术在反射布局中实施观察细菌群落，光源700 被放置成面向含有待观察的培养基的培养皿710，检测器740也面向该培养皿。图7C示出了这样的设置，分光镜750偏转光源产生的光,然后物镜720使光平行。当培养基不透明时， 这样的设置是优选的。
关于纹影摄影术和表面映射，有利的是，使用图像处理的任何方法和使连续图像相减从而适于显示因生长而发生的变化的任何方法。
一旦群的位置被确定，则可使用已知的测量方法识别细菌本身，例如，通过原位分析(衍射法、拉曼光谱法)或者通过其他分析方法(如质谱分析法)。在这种情况下，进行非原位分析，因此需要移除细菌群落。
例如，通过地貌的测位可以选择体积超过一定阈值的群，随后，对所选择的群进行定性分析。
本发明并不限定于检测培养基的表面上的微生物群落。其上放置有用于检测的生物群且更一般地生物颗粒的表面同样可呈固态，如玻璃基底或功能化硅基底或用于回收过滤液中获得的细菌的微孔过滤器(可以但并不必须适于在培养基上放置)。在所述方法的第二步骤E2中实施的预处理操作优选地适合于所考虑的表面类型。
位于所述表面上的周围介质可以是真空或流体，如气体或液体，气体尤其是空气是优选的。周围介质可以被封闭，以避免受污染的风险以及在适当的情况下避免琼脂蒸发的风险。
权利要求
1.一种检测表面(11)上的生物颗粒群(12)的方法，所述方法包括以下步骤a)确定(El)所述表面的地貌表示(20);以及b)在所述地貌表示中，检测(E3、E4)至少一个限定可能对应于所述生物颗粒群的区域的轮廓；所述步骤是在电子数据处理器装置的帮助下实现的。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物颗粒选自微生物以及植物细胞或动物细胞，所述微生物诸如细菌、酵母菌或真菌。
3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述生物颗粒的直径或主尺寸小于或等于100 μ m。
4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述表面(11)选自培养基和周围介质如空气之间的界面、功能化基底的表面和微孔膜的表面。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述步骤a)在于，通过无接触以及无需准备样品而进行的光学方法来实现确定所述表面的地貌表示。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤a)在于，通过彩色共焦微地貌来实现确定所述表面的地貌表示。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤a)在于，通过纹影摄影术或阴影摄影术来实现确定所述结构的地貌表示。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述步骤b)在于，通过测量所述表面的所述地貌表示的局部坡度以及定阈值来实现检测至少一个轮廓。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，还包括所述地貌表示的预处理操作(E2)，所述预处理操作包括检测参考表面和减去所述参考表面。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，包括在连续的时间重复步骤a)和步骤b)，以及仅选择步骤b)中确定的形状或尺寸随时间变化的区域。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，包括另一步骤C)，所述步骤c)在于评估生物颗粒的群中存在的生物颗粒的量。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，包括原位识别或非原位识别排列在群中的所述微生物的另一步骤。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测表面(11)上的生物颗粒群(12)的方法，所述方法包括以下步骤a.确定(E1)所述表面的地貌表示(20);以及b.在所述地貌表示中检测(E3、E4)至少一个限定可能对应于所述生物颗粒群的区域的轮廓。
文档编号G01B11/24GK103025888SQ201180026768
公开日2013年4月3日 申请日期2011年4月6日 优先权日2010年4月6日
发明者让-皮埃尔·莫亚, 马蒂厄·杜波伊, 奥利维尔·费伽德瑞, 弗莱德瑞克·皮恩斯顿, 吉娜维芙·波斯塞, 劳伦·德拉泽克, 玛丽丝·吉谢尔, 法宾·罗曼恩斯, 弗莱德瑞克·马勒拉瑞德 申请人:原子能与替代能源委员会, 生物梅里埃公司
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