专利名称：Hek 293细胞和红细胞内外钾离子交换动态检测方法
技术领域：
本发明为一种简易且高灵敏HEK 293细胞和红细胞内外钾离子交换动态检测新方法，属于用二电极体系对动物细胞进行电化学研究的方法。
背景技术：
所有的活体细胞都由一个近似40�：竦闹仕肿硬阋簿褪窍赴ぐ�。细胞膜的存在使得细胞内的各种物质能够稳定存在并进行生命体的化学反应，同时还能够选择性地运输对生命体至关重要的物质如Na+、K+、Ca2+、CF等。生命体系中的信号传递与细胞之间的离子跨膜运输有着至关重要的联系，而离子的运输通常就是由细胞膜上的各种离子通道完成的。膜片钳技术是利用负反馈电子线路，通过微电极与细胞之间形成高阻封接，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，观察和记录通过通道的微小离子电流，从而研究其功能。膜片钳检测手段虽然被广泛应用于细胞电生理的检测中，但是也存在着一些不足之处，如离子选择性比较差；封接破膜时对细胞有一定的伤害作用；一次只能检测一个细胞等。非损伤微测技术用于测量活体或者非损伤性地测量材料表面的离子和分子的流速和运动方向，并不探讨细胞内外的离子交换，同时该技术的测试仪器昂贵，不利于广泛应用。膜片钳K+通道电流的I-V关系曲线能反应该通道的功能，结合离子选择性电极的原理，加之电化学的分析手段，我们开发了一种检测HEK 293细胞和红细胞内外K+交换的新方法，该方法是基于物理学、化学、细胞生物学等原理集成而来。不同浓度材料与细胞孵育前后，采用这种方法研究HEK 293细胞和红细胞内外K+浓度的变化，进而探讨材料对于HEK 293细胞和红细胞离子通道性质和功能的影响，可作为评价材料细胞相容性的一种新的手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测HEK 293细胞和红细胞内外K+交换的新方法，该方法对细胞无损伤，具有灵敏度高、准确度好、选择性强、操作简单、分析速度快等优点，为探讨生物材料作用于动物细胞后对细胞内外K+交换产生的影响提供了一种新的检测方法。本发明以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；(2)在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有K+载体的DCE溶液，为有机相；HEK 293细胞和红细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极，利用循环伏安法对HEK 293细胞和红细胞内外K+交换进行动态连续检测。本发明的原理是制备纳米毛细管微电极，内充含有K+选择性载体的有机相溶液，当这种微电极无限接近细胞时(HEK 293细胞和红细胞溶液为水相)，K+选择性载体会将细胞表面的K+运输至电极的亲水与疏水界面(液/液界面)上，从而产生微弱的电流，通过循环伏安方法检测这种微电流(图I)。本专利的创新之处在于
膜片钳记录的全细胞记录图表示的是细胞内外的K+交换的通道电流(包括稳态电流和尾电流)，随着测试样品的加入，细胞内外的K+交换发生了变化，反映在通道电流改变上，并呈现剂量-效应关系，通道电流的变化反映了材料对细胞K+通道功能的影响。(图2)
我们通过循环伏安法测定细胞的表面K+交换情况，得到闭合的循环伏安电流曲线。随着测试样品的加入，细胞的循环伏安电流曲线电流差值发生了变化，同时也呈现出剂量-效应关系。电流差值的变化与测试细胞溶液中的K+浓度成比例关系，而K+浓度的变化是由于细胞内外K+交换量发生变化引起的。经过反复的与膜片钳数据比较实验验证，我们发现循环伏安电流差值的变化即能相应地反映材料对细胞K+通道功能的影响。文献报道，人们对红细胞K+通道的表达较为困难，因此通过膜片钳技术很难实现对红细胞内外K+的交换和通道的功能特异性的检测。因此，我们选用循环伏安法对红细胞进行特异性的连续动态检测，反映测试样品对红细胞内外K+的交换和通道功能的影响。该检测方法可以弥补膜片钳技术的不足，不但能够检测膜片钳技术能够检测的细胞，同时能够实现对膜片钳技术无法检测的细胞进行动态连续检测。纳米毛细管的拉制以硼娃毛细管(外径I. O mm内径O. 58 mm, L = 10 cm)为材料制备纳米毛细管，通过调节P-2000 Puller的5个参数(Heat, Filament, Velocity,Delay, Pull),制备毛细管(patch-type)，纳米毛细管的内外管径比为2. 0。时在使用前，毛细管需通过BX-41光学显微镜(Olympus)初步检查其外形，特别是管口是否平整。管口不规整以及管口不是圆形的毛细管都不能使用。纳米毛细管内壁的疏水化处理把纳米毛细管尖端浸入到三甲基氯硅烷溶液，持续片刻(毛细效应使三甲基氯硅烷进入毛细管)，然后从管后端用注射器将进入毛细管的三甲基氯硅烷慢慢往管端推动，使其到达管尖，毛细管内不能存留气泡并使其在管内保留大约30 min,而后从管后端将多余的三甲基氯硅烷吸出。硅烷化后的纳米毛细管静置一夜，晾干备用。实现对K+的检测前，需在内表面经疏水化处理过的毛细管中注入一定量(一般为靠近毛细管尖端，毛细管总体积的2/3)含有K+选择性载体的1，2-二氯乙烷(DCE)有机溶液。所述的K+选择性载体包括但不限于缴氨霉素(Valinomycin)。所述循环伏安法检测HEK 293细胞和红细胞内外K+交换的具体实验过程在BAS100B电化学工作站(美国Bioanalytical Systems公司)上完成。纳米毛细管的循环伏安实验采用二电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。基于纳米毛细管微电极中钾离子载体对K+的运输作用形成的微电流
(I)在电解池中加入一定浓度的KCl水溶液，通过微电流的变化，得到电流与钾离子浓度关系曲线。(2)确定迁移至界面附近的K+浓度的变化，进而确定细胞内外K+的交换能力。所述方法中，水相中 参比电极为Ag/AgCl电极，有机相中参比电极Ag/AgTPBCl。所述的Ag/AgCl电极通过以下步骤制备直径为O. 25 mm的银丝作阳极，直径为Imm的钼丝作阴极，电解KCl的水溶液。所述的Ag/AgTPBCl电极通过以下步骤制备把少量的氯化四苯硼四丁基铵(TBATPBC1)溶于DCE溶液中，直径为O. 25 mm的银丝作为阳极，直径为I mm的钼丝作为阴极，电解TBATPBC1的DCE溶液。电化学池设计的表示式如下
Ag I AgCl I extracellular fluid IOmM TBATPBC1 +ImM Valinomycin Ag AgTPBCl本发明在不损伤细胞膜的前提下，实现了对人胚肾上皮细胞(HEK 293)和红细胞内外K+交换检测。本发明还公开了所述的方法在测定二氧化硅对HEK 293细胞和红细胞内外K+交换影响中的应用。具体是以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有K+载体的DCE溶液为有机相；HEK 293 细胞和红细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极，利用循环伏安法细胞内外K+进行检测；随后向细胞溶液中滴加一定浓度二氧化硅纳米粒子，孵化5 min，进行循环伏安测定；得到不同浓度二氧化硅纳米粒子处理后，细胞溶液中K+在液/液界面迁移的循环伏安曲线。本发明具有以下优点根据本发明的以二电极体系对HEK 293细胞和红细胞内外K+交换进行检测，不破坏细胞膜，同时实现对整个细胞溶液中K+迁移的检测，评价材料作用于细胞后对细胞内外K+交换的影响，该检测过程不需要昂贵的仪器设备，操作简单。检测中所需样品量少，检测快且灵敏度高。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施方式
为限，而是由权利要求加以限定。
图I为循环伏安法检测细胞内外K+交换的原理示意图。图2为经不同浓度Si NPs处理后的HEK 293细胞hERG K+通道电流全细胞记录图(a) O mg/mL (b) O. 02 mg/mL (c) O. 08 mg/mL。图3为不同浓度二氧化硅纳米粒子(SiNPs)处理后循环伏安法对HEK 293细胞内外K+交换检测曲线。二氧化娃纳米粒子浓度依次为(a) O mg/mL (b) O. 01 mg/mL O. 10mg/mL。图4为不同浓度二氧化硅纳米粒子(SiNPs)处理后循环伏安法对红细胞内外K+交换检测曲线。二氧化娃纳米粒子浓度依次为(a) O mg/mL (b) O. 01 mg/mL O. 10 mg/mL。
具体实施例方式实施例I
(1)纳米毛细管拉制
以硼娃毛细管(外径I. O mm内径O. 58 mm, L = 10 cm)为材料制备纳米毛细管,设置拉制仪(P_2000 Puller)参数(Heat, Filament, Velocity, Delay, Pull),拉制毛细管，得到尖端内外管径比为2. O的毛细管。(毛细管长度为10 cm，从中间拉断，得到两根一端有尖端的纳米毛细管)
(2)纳米毛细管内壁疏水化处理
把纳米毛细管尖端浸入到三甲基氯硅烷溶液，持续片刻(毛细效应使三甲基氯硅烷进入毛细管)，然后从管后端用注射器将进入毛细管的三甲基氯硅烷慢慢往管端推动，使其到达管尖，毛细管内不能存留气泡并使其在管内保留大约30 min，而后从管后端将多余的三甲基氯硅烷吸出。硅烷化后的纳米毛细管静置一夜，晾干备用。(3)电极制备
Ag/AgCl的制备直径为O. 25 mm的银丝作阳极，直径为I mm的钼丝作阴极，电解KCl的水溶液。Ag/AgTPBCl的制备把少量的氯化四苯硼四丁基铵(TBATPBC1)溶于DCE溶液中，直径为O. 25 mm的银丝作为阳极，直径为I mm的钼丝作为阴极，电解TBATPBC1的DCE溶液。( 4 )实验装置的搭建
检测前，在步骤(2)疏水化处理的纳米毛细管中通过注射器注入一定量(纳米毛细管体积的2/3)含有K+选择性载体的1，2- 二氯乙烷(DCE)有机溶液。 将Ag/AgTPBCl电极一端插入到上述毛细管(有机相)至尖端，将组装后的电极尖端插入细胞溶液(水相)中，露在纳米毛细管外面的Ag/AgTPBCl电极用电化学工作站的连接夹夹�。⒐潭�。将Ag/AgCl电极一端插入细胞溶液(水相)(2 mL)中，另一端用电化学工作站的连接夹夹�。⒐潭�。( 5 )循环伏安法检测微电流
所述循环伏安法检测HEK 293细胞和红细胞内外K+的具体实验过程在BAS 100B电化学工作站(美国Bioanalytical Systems公司)上完成。纳米毛细管的循环伏安实验采用二电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。纳米毛细管中的K+选择性载体对K+的运输作用形成的微电流，调节测试参数(电压范围，扫速，灵敏度)，通过循环伏安法检测这种微电流。通过微电流的变化，确定迁移至界面附近的K+浓度的变化，进而确定细胞内外K+的交换能力，反映出细胞K+通道功能的变化。将组装后的电极和水相中的参比电极Ag/AgCl电极的尖端分别插入到HEK 293细胞溶液(2 mL )的液面以下，构成二电极体系，连接装置，通过循环伏安测试得到未经纳米材料处理时，HEK 293细胞内外K+交换的I-V曲线，即空白对照。实验在室温下进行(25±20C)。HEK 293细胞溶液制备过程HEK_293细胞(ATCC公司，美国)，置于含10%的胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37 °C、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，72h后进行瞬时转染。用O. 25%胰酶和O. 02%EDTA将转染后的HEK 293细胞消化成单细胞悬浮液，37°C培养3_5h，用细胞外液配制HEK 293细胞溶液，进行循环伏安法检测。(细胞外液自配136 mM NaCl,5.4 mM KCl，5 mM HEPES，I mM MgCl2 ·6Η20，I mM CaCl2 和 10 mM glucose，用 NaOH 调整 pH至 7. 4。)
配制浓度为10 mg/mL的二氧化硅纳米粒子(SiNPs)悬液，超声分散。在得到HEK 293细胞未经SiNPs处理时的I-V曲线后，用移液枪取适量SiNPs悬液滴加到HEK 293细胞溶液中，材料与HEK 293细胞孵育计时5 min后，测试得到一定浓度样品处理后的HEK 293细胞I-V曲线，随后继续加入适量SiNPs悬液，孵育5 min，检测。依次进行，得到低浓度和高浓度SiNPs处理下HEK 293细胞内外K+交换的I-V曲线。设置电压范围为-400 mV到400mV，扫速为20 mV/s，测试灵敏度为10 nA。分析得到的I-V曲线(图3)，可以看出HEK 293细胞内外K+交换的能力变化，由此、可以判断SiNPs对HEK 293细胞的膜运输K+能力的影响，即SiNPs对K+通道功能的影响。实施例2 以硼娃毛细管(外径I. O mm内径O. 58 mm, L = 10 cm)为材料制备纳米毛细管，通过调节 P-2000 Puller 的 5 个参数(Heat, Filament, Velocity, Delay, Pull),制备管口较短的毛细管(patch-type)。将电极内表面进行疏水化处理，电极自然晾干后,通过注射器注入少量含有钾离子载体的DCE溶液。随后将有机相参比电极Ag/AgTPBCl插入到装有上述含有离子载体的毛细管中，将组装后的电极和水相中的参比电极Ag/AgCl电极的尖端分别插入到红细胞溶液(2 mL 2%红细胞悬液)的液面以下，构成二电极体系，连接装置，通过循环伏安测试得到未经纳米材料处理时，红细胞内外K+交换的I-V曲线，即空白对照。实验在室温下进行(25±2°C)。SiNPs与红细胞孵育及其检测过程同实施例I完全相同，得到相应红细胞内外K+交换的I-V曲线(图4)。设置电压范围为-400 mV到400 mV，扫速为20 mV/s，测试灵敏度为 10 nA。红细胞溶液制备过程取新西兰大白兔一只，无菌条件下抽取兔血18 mL，立刻注入到含有2 mL3. 8 wt%枸橼酸钠抗凝剂的试管中，制备成新鲜的抗凝血。全血2500 r/min离心10 min除去上清液，再加入生理PBS离心洗涤2-3次，至上清液不呈红色为止。然后按红细胞的体积，用生理PBS配成2%的红细胞悬液。(PBS缓冲液自配(g/L) =NaCl 8.00，KCl O. 20, Na2HPO4 · 12H20 I. 15, KH2PO4 0.20。)
权利要求
1.一种简易的HEK 293细胞和红细胞内外K+交换动态检测方法，其特征在于包括以下步骤 (O以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性； (2)在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有K+载体的DCE溶液，为有机相；HEK 293细胞和红细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中參比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中參比电极，利用循环伏安法对HEK 293细胞和红细胞内外K+交换进行动态检測。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述循环伏安法采用ニ电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。
3.权利要求I所述的方法在测定ニ氧化硅对HEK293细胞和红细胞内外K+迁移影响中的应用。
4.根据权利要求4所述的应用，其特征在干以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有K+载体的DCE溶液为有机相；HEK 293细胞和红细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中參比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中參比电极，利用循环伏安法对HEK 293细胞和红细胞内外K+交换进行检测；随后向细胞溶液中滴加一定浓度ニ氧化硅纳米粒子，孵化5 min，进行循环伏安测定；得到不同浓度ニ氧化硅纳米粒子处理后，细胞内外K+在液/液界面迁移的循环伏安曲线。
全文摘要
本发明涉及一种简易的人胚肾上皮细胞(HEK293)和红细胞内外钾离子(K+)交换动态检测方法。该方法以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有K+载体的1,2-二氯乙烷(DCE)溶液，为有机相；HEK293细胞和红细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极。本发明利用纳米管离子选择性微电极，通过循环伏安法对HEK293细胞和红细胞内外K+交换进行动态检测，从而实现了离子选择性电极与电化学检测技术的完美组合。该方法结合了膜片钳技术和离子选择性电极的特点，具有非损伤、成本低、检测快、灵敏度高的优点。
文档编号G01N27/48GK102636551SQ20121011416
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者杜春蕾, 王燕, 蔡称心, 赵文波, 黄晓华 申请人:南京师范大学
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