专利名称：使用生物相容性的生物可吸收纳米球治疗自身免疫病的方法
技术领域：
本发明涉及免疫和医药相关组合物及方法。具体地，本发明涉及用于诊断和治疗自身免疫病特别是糖尿病的诊断及治疗方法。
现有技术抗原免疫接种可用于在自身免疫作用中诱导T细胞耐受。施用自身抗原性蛋白或肽的溶液在自身免疫病实验模型中可减轻自身免疫作用的发生和/或发展(Wraith等，1989 ；Metzler 和 Wraith, 1993 ；Liu 和 Wraith, 1995 ；Anderton 和 Wraith, 1998 ；Karin等，1994)。但是，利用相似策略的有限的人临床试验几乎毫无例外的遭遇失败(Weiner，1993 ;Trentham 等，1993 ；McKown 等，1999 ；Pozzilli 等，2000 ；Group,D.P.T.-T.D.S.2002 ；Kappos等，2000 ；Bielekova等，2000)。这表明对治疗选择和条件的指导原则尚不完善，因此不适用于人体。自发器官特异性自身免疫病是由针对多种抗原中众多表位的复杂应答所引起的，其以随机且经常是无法预测的顺序自发出现。下述情况增加了这一复杂性:识别相同表位的淋巴细胞克隆在宽的亲合力范围内结合抗原/主要组织相容性复合物(MHC)分子，其强度与致病潜力相关(Amrani等,2000 ；Santamaria, 2001 ;Liblau等,2002)。因此，任何预防自身免疫病的免疫接种策略的结局都有可能受到所选自身抗原、剂量、治疗周期以及施用途径及形式的影响。小鼠中的I型糖尿病(TlD)与自身反应性CD8+T细胞有关。非肥胖糖尿病(nonobese diabetic, NOD)小鼠发生非常类似于人TlD的TlD形式,这是由于识别越来越多自身抗原的T细胞对胰腺β细胞的选择性破坏造成的(Lieberman和DiLorenzo, 2003)。尽管TlD的发生明显需要⑶4+细胞的参与，但是有强有力的证据证明TlD是⑶8+Τ细胞依赖性的(Santamaria, 2001 ;Liblau等,2002)。已经发现NOD小鼠中的相当一部分胰岛相关CD8+ 细胞利用 CDR3 恒定的 V a 17-J a 42+TCR，被称为 “8.3-TCR 样” (Santamaria 等，1995 ；Verdaguer 等，1996 ；Verdaguer 等，1997 ；DiLorenzo 等，1998)。这些识别 MHC 分子 Kd 情况中模拟表位NRP-A7(使用组合肽文库确定)的细胞(Anderson等，1999)已经是最早的NOD膜岛 CD8+浸润物的重要成分(DiLorenzo 等，1998 ;Anderson 等，1999 ；Amrani 等,2001),是致糖尿病的(Verdaguer等，1996 ；Verdaguer等，1997),并且祀向来自胰岛特异性葡萄糖-6-憐酸酶催化亚基相关蛋白(islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic
subunit-related protein, I GRP)的妝(Lieberman 等，2003)-—种功能未知的蛋白质
(Arden 等，1999 ；Martin 等， 2001)。识别该肽(IGRP206_214，类似于 NRP-A7)的 CD8.细胞在循环中非常常见(> l/200CD8+cells) (Lieberman 等,2003 ；Trudeau 等,2003)。值得注意的是，在NOD小鼠中从胰岛炎发展到糖尿病总是伴随着循环中IGRP2(I6_214-反应性CD8+群体的周期性扩增(Trudeau等,2003),还伴随着其胰岛相关对应物的亲合力成熟(Amrani等，
2000)。最近，有报道称NOD小鼠中胰岛相关⑶8+细胞识别多个IGRP表位，表明IGRP是⑶8+细胞的主要自身抗原，至少在小鼠TlD中如此(Han等，2005)。NOD胰岛相关⑶8+细胞，特别是在疾病过程中早期发现的那些细胞也识别胰岛素表位(Ins B15_23 (Wong等，1999))。相关研究已经提示，某些I类HLA等位基因(即HLA-A * 0201)提供了对人TlD的易感性(Fennessy 等，1994 ；Honeyman 等，1995 ；Tait 等，1995 ；Nejentsev 等，1997 ；Nakanishi等，1999 ；Robles等,2002)。病理研究显示，新近诊断患者的胰岛炎病变主要由(I 类 HLA 限制的)CD8+T 细胞组成(Bottazzo 等，1985 ；Atkinson 和 Maclaren, 1990 ；Castano和Eisenbarth, 1990 ;Hanninen等,1992 ;Itoh等,1993 ;Somoza等,1994 ；Atkinson和Maclaren, 1994 ；Moriwaki等，1999 ；Imagawa等，2001)，这也是通过胰腺同系移植(来自同卵双胞胎)或同种移植(来自相关供体)治疗的患者中的主要细胞类群(Sibley等，1985 ； Santamaria 等，1992)。在人和小鼠TlD中，胰岛素都是抗体和⑶4+应答的关键靶标(Wong等，1999;Palmer 等，1983 ；Chentouf i and Polychronakos, 2002 ;Toma 等，2005 ;Nakayama 等，2005 ；Kent等，2005)。在胰岛移植受体(Pinkse等，2005)和自发疾病病程(Toma等，2005)中，人胰岛素B链表位hInsB1(l_18都被HLA-A 0201呈递给自身反应性⑶8+细胞。另外，从小鼠前胰岛素原I或2中已鉴定出四种另外的肽，其被来自HLA-A * 0201背景下的HLA-A *0201转基因小鼠的胰岛相关⑶8+T细胞所识别。由与TlD易感性基因座IDDM7 (2q31)重叠基因(位于染色体2q28_32 (Martin等，
2001))所编码的I GRP (Pociot 和 McDermott，2002 ；Owerbach, 2000)最近也已经被鉴定为人TlD中可能相关的β细胞自身抗原(Takaki等，2006)。人IGRP的两个HLA-A * 0201结合表位(hIGRP228_236和hIGRP265_273)被来自表达HLA-A * 0201转基因的小鼠I类MHC缺陷型NOD小鼠的胰岛相关⑶8+细胞所识别(Takaki等，2006)。值得注意的是，这些“人源化TLA-A * 0201转基因小鼠的胰岛相关⑶8+T细胞对于HLA-A * 0201阳性人胰岛来说具有细胞毒性(Takaki等，2006)。可通过扩增低亲合力自身反应性⑶8+T细胞来预防NOD小鼠中的T1D。施用可溶性肽(不含佐剂)是诱导抗原特异性T细胞耐受的有效方式(Aichele等，1994 ；Toes等，1996)。之前，有报道显示使用可溶性NRP-A7治疗前糖尿病NOD小鼠通过选择性缺失表达对肽/MHC具有最高亲合力的TCR克隆型而减弱了 IGRP2(I6_214反应性CD8+亚群的亲合力成熟(Amrani等，2000)。这些结果增加以下可能性:即NRP-A7的抗TlD活性也是通过激发“低亲合力”(有可能是抗糖尿病发病的)克隆代替“高亲合力克隆型位置(niche) ”(NRP-A7治疗使该位置空出来)所介导。为了检验这一猜想，鉴定了对IGRP2(I6_214反应性⑶8+T细胞具有部分、全部或超级拮抗活性的改变的肽配体(altered peptide ligand, APL),并且在宽剂量范围内对其抗TlD活性进行比较。使用中等剂量中等亲合力APL(NRP-A7)或高剂量低亲合力APL (NRP-14)进行的长期处理提供了针对TlD的保护。这与低亲合力IGRP2Q6_214反应性CD8+T细胞的局部积累(以牺牲其缺失的高亲合力对应物为代价)相关。意外地，使用高剂量高亲合力APL (NRP-V7)或天然配体(IGRP2CI6_214)进行的长期处理仅仅提供部分保护。令人惊奇的是，这些小鼠的胰岛几乎不含IGRP2Q6_214反应性⑶8+细胞，而识别其他IGRP表位的⑶8+细胞群却有所增加。这使我们推断，当其促使靶器官淋巴细胞位置被非致病低亲合力克隆占据时，自身免疫病的肽疗法可能是最为有效的(Han等，2005)，该预测得到了数学模型的支持(Maree等，2006)。令人遗憾的是，仅在很窄的APL剂量和亲合力(针对靶标TCR)范围内具有此结局，表明肽疗法不适合于预防或治疗T1D。因此，仍然需要用于治疗糖尿病以及其他自身免疫病的其他组合物和相关方法。发明内容
用肽来治疗患者是困难的，因为对于IGRP来说，需要每剂数毫克的肽。本文提供了在生物相容性的生物可吸收纳米球上递送抗原/MHC复合物(例如肽/MHC/纳米球复合物，无共刺激分子)。考虑这些复合物比单独的肽或不可生物吸收的纳米球复合物更具有致耐受性。本申请的一些方面和实施方案包括发现治疗自身免疫作用的新模式。传统上，已使用疫苗来扩增能提供针对病原体或癌症的保护的T细胞，或者清除能够造成自身免疫作用的T细胞。本发明的一些方面涉及新型“疫苗”，其选择性诱导具有抗自身免疫性质的自身反应性CD8+细胞扩增，同时清除具有致病(自身免疫性)性质的自身反应性CD8+细胞，以上两者均根据T细胞的抗原特异性来实现。抗自身免疫自身反应性CD8+T细胞(抗致病性CD8+细胞)以组织特异性(在自发募集到靶组织之后)但是非抗原特异性(例如局部抑制其他自身免疫性T细胞应答)的方式抑制自身反应性T细胞应答。结果，使用此类疫苗进行的治疗既可以预防和/或减轻T1D，也可以使高血糖NOD小鼠恢复到正常血糖水平或降低其血糖水平，而不造成普遍性免疫抑制。此策略可用于治疗其他T细胞介导的自身免疫�。⑶铱赡苣芄辉し酪鹊阂浦埠蟮腡lD复发。本发明的一些实施方案涉及根据T细胞的抗原特异性选择性减少或扩增T细胞。因此，认为本发明可用于减少或消除识别自身抗原的T细胞(例如P细胞特异性T细胞)。由此，本发明可用于预防、治疗或减轻自身免疫病例如IDDM。另外，本发明可用于扩增期望的T细胞，例如识别肿瘤抗原的T细胞，以预防、治疗和/或减轻这些T细胞所对抗的疾病。本发明的一些实施方案涉及诊断、预防或治疗自身免疫病的方法，其包括以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量将抗原/MHC/生物相容性的生物可吸收纳米球复合物施用给对象。对于与基质偶联的MHC或MHC样分子的情况，抗原包括但不限于全部或部分的肽、核酸、碳水化合物、脂类或者可调节T细胞或T细胞群体活性的其他分子或化合物。因为纳米球复合物的生物可吸收性防止纳米球在体内的长期积累以及从其中产生的任何伴随毒性，所以其生物可吸收性对于本发明来说至关重要。本发明的一些实施方案包括致耐受性纳米球，其包含偶联到抗原-MHC复合物的生物相容性的生物可吸收纳米球。抗原-MHC复合物可直接或通过接头与这样的纳米球相连。优选的纳米球还可包含生物相容性的生物可吸收金属芯核和生物可降解的生物可吸收包衣。所述纳米球还可包含可易于偶联到抗原-MHC复合物的其他分子(例如链霉亲和素或亲和素或其他已知用于将部分(moiety)附着在纳米球上的分子)的涂层或壳。在一些方面中，生物相容性的生物可吸收纳米球包含选自下列的材料:例如铁III氧化物,磷酸三钙，铬，镓和生物相容性的生物可吸收聚合物，如PGLA、PLLA、PGA、PDLLA、PCL、PDLGA、PLDLA、PLC(其所有都可得自于 Zeus，3737Industrial Blvd, Orangeburg, SC，29118USA，商标名为Absorv )，透明质酸，藻酸盐，聚羟基烷酸酯等。在另一些方面中，生物相容性的生物可吸收纳米球是金属或者可磁化或超顺磁性纳米球。生物相容性的生物可吸收纳米球还可包含由以下形成的生物可降解包衣:葡聚糖，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，甘露醇，PHB-PHV类的聚(羟基烷酸酯)和其他改性多(糖)，如淀粉、纤维素和壳聚糖。本发明的一些方面包括涉及抗原性组合物的方法和组合物，所述抗原性组合物包含多肽、肽、核酸、碳水化合物、脂类和其他引起或诱导抗原性应答或免疫应答之分子(通常称为抗原)的部分、片段或表位。在一些具体方面中，所述抗原来源于自身反应性抗原和/或其复合物，是自身反应性抗原和/或其复合物，或者是自身反应性抗原和/或其复合物的模拟物。肽抗原包括但不限于:hInsB1Q_18(HLVEALYLV(SEQID NO:1))、hIGRP228_236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2))、hIGRP265_273 (VLFGLGFAI (SEQ ID N0:3))、IGRP206-2i4 (VYLKTNVFL (SEQ ID NO:4)) , NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6))、NRP-14(KYNIANVFL(SEQ ID NO:7))、NRP-V7(KYNKANVFL(SEQ ID NO:8)), YAI/Db(FQDENYLYL(SEQ ID NO:9))和 / 或 INS B15_23(LYLVCGERG(SEQ ID NO:10))，以及美国专利公开20050202032中公开的肽和蛋白质，其通过引用整体并入本文。在一些方面中，用于治疗TlD的肽抗原是GAD65114_123，VMNILLQYVV (SEQ IDNO:14) ;GAD65536_545，RMMEYGTTMV(SEQ ID NO:15) ；GFAP143_151, NLAQTDLATV (SEQ IDNO:16) ；GFAP214_222 , QLARQQVHV (SEQ ID NO:17) ; IA_2172_18。，SLSPLQAEL (SEQ ID NO:18) ;IA-2482_490，SLAAGVKLL (SEQ ID NO:19) ;IA_2805_813，VIVMLTPLV (SEQ ID NO:20)；ppIAPP5_13, KLQVFLIVL(SEQ ID NO:21) ；ppIAPP9_17, FLIVLSVAL (SEQ ID NO:22);IGRPi52-160 FLffSVFMLI (SEQ ID NO:23) ；IGRP211_219, NLFLFLEAV(SEQ ID NO:24) ;IGRP215_223，FLFAVGFYL(SEQ ID NO:25) ； IGRP222_230 , YLLLRVLNI (SEQ ID NO:26) ; IGRP228_236，LNIDLLWSV (SEQ ID NO·:2) ;IGRP265_273, VLFGLGFAI (SEQ ID NO:3) ;IGRP293_3(I1, RLLCALTSL (SEQID NO:27);胰岛素原 l2-1q，ALWMRLLPL (SEQ ID NO:28);胰岛素原 L3_n，LWMRLLPLL (SEQ IDNO:29);胰岛素原 L6_14，RLLPLLALL(SEQ ID NO:30);胰岛素原 B5_14，HLCGSHLVEA (SEQ ID NO:31);胰岛素原价。-18，HLVEALYLV(SEQ ID NO:1);胰岛素原B14_22，ALYLVCGER(SEQ ID NO:32)；胰岛素原B15_24，LYLVCGERGF(SEQ ID NO:33);胰岛素原B17_25，LVCGERGFF (SEQ ID NO:34);胰岛素原 B18_27，VCGERGFFYT(SEQ ID NO:35);胰岛素原 B2(l_27，GERGFFYT (SEQ ID NO:36);胰岛素原 B21-29，ERGFFYTPK(SEQ ID NO:37);胰岛素原 B25_C1，FYTPKTRRE (SEQ ID NO:38);胰岛素原 B27-C5，TPKTRREAEDL (SEQ ID NO:39);胰岛素原 C2(l_28，SLQPLALEG (SEQ ID NO:40);胰岛素原 C25_33，ALEGSLQKR(SEQ ID NO:41);胰岛素原 C29_A5，SLQKRGIVEQ (SEQ ID NO:42);胰岛素原 A1_10，GIVEQCCTSI (SEQ ID NO:43);胰岛素原 A2_10，IVEQCCTSI (SEQ ID NO:44);胰岛素原A12_2。，SLYQLENYC(SEQ ID NO:45)或其组合。在另一些方面中，可以使用与多发性硬化(multiple sclerosis, MS)有关的肽抗原，其包括:MAG287_295，SLLLELEEV(SEQ ID NO:46) ；MAG509^517, LMWAKIGPV (SEQID NO:47) ；MAG556_564, VLFSSDFRI (SEQ ID NO:48) ；MBP110_118, SLSRFSffGA (SEQ ID NO:49) ;M0G114_122，KVEDPFYffV (SEQ ID NO:50) ;M0G166_175，RTFDPHFLRV (SEQ ID NO:51)；MOG172_180, FLRVPCffKI (SEQ ID NO:52) ；M0G179_188, KITLFVIVPV (SEQ ID NO:53);M0G188_196, VLGPLVALI (SEQ ID NO:54) ;M0G181_189, TLFVIVPVL (SEQ ID NO:55) ；MOG205_214,RLAGQFLEEL(SEQ ID NO:56) ;PLP80_88，FLYGALLLA(SEQ ID NO:57)或其组合。在一些方面中，抗原-MHC复合物可以交联(缀合)到本文所述的纳米球上。将纳米球缀合到抗原-MHC复合物上的一种非限制性方法包括(a)使抗原-MHC复合物与缀合剂(conjugating agent)反应，由此形成抗原-MHC-复合物，以及(b)使生物相容性的生物可吸收纳米球与步骤(a)的复合物反应。在一个实施方案中，所述方法包括在进行步骤(b)之前将步骤(a)的复合物浓缩。在另一个实施方案中，所述缀合剂包括异双功能剂(heterobifunctional agent)。在又一个实施方案中，所述缀合剂包括DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚胺基丁酰胺基苄基-D0TA)、SMPT (4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基- α-(2_吡啶二硫代)甲苯_)、磺基-LC-SMPT (磺基琥珀酰亚胺基_6_ ( α -甲基-a -(2-吡啶巯基)苯乙酰胺)己酸酯、Traut试剂(2_亚氨基硫烷盐酸盐)或其任意组合。对将复合物与微米颗粒或纳米颗粒缀合的讨论，请参见美国专利公开20070059775 ；美国专利 N0.4，671，958、4，659，839、4，414，148、4，699，784 ;4，680，338 ;4，569，789 ;4，589,071 ;7，186，814 和 5543391，欧洲专利申请 N0.188，256。自身免疫病可包括但不限于:糖尿病、移植排斥、多发性硬化、卵巢早衰、硬皮病、口眼干燥综合征(Sjogren’s disease)、狼疮、白癜风(vilelego)、秀头症(脱发)、多腺性衰竭、格雷夫斯氏病(Grave’s disease)、甲状腺功能减退、多肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体机能减退、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退和/或类风湿性关节炎。在一些方面中，抗原/MHC/纳米球复合物的肽组分来自或者设计自要检测、通过治疗来调节或减轻的自身免疫应答中所涉及的自身抗原或自身抗原表位或者其模拟物。在某些方面，所述自身抗原是肽、碳水化合物或脂类。在一些方面中，所述自身抗原是对象的某些细胞(例如胰腺β细胞)所表达的蛋白质、碳水化合物或者脂类的片段、表位或肽，包括但不限于IGRP、胰岛素、GAD或ΙΑ-2蛋白的片段。已经鉴定了针对多种自身免疫病的多种这样的蛋白质或表位。所述自身抗原可以是来源于第二内分泌或神经分泌组分(例如胰岛周围施旺氏细胞等)的肽、碳水化合物、脂类等。在本发明的另一些方面中，抗原/MHC/纳米球复合物的MHC组分是经典的或非经典的I类MHC或II类MHC多肽组分。所述I类MHC可包括HLA-A、HLA-B, HLA-C, HLA-E,HLA-F, HLA-G分子的全部或一部分，特别是HLA-A分子的全部或一部分，例如HLA-A *02011类MHC分子。非经典I类MHC组分可包括⑶I样分子。II类MHC组分可包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。在一些方面中，抗原/MHC复合物与基质共价或非共价偶联或结合(抗原/MHC/纳米球复合物)。所述基质通常是生物相容性的生物可吸收纳米球。在一个实施方案中，所述纳米球包含金属，例如铁或铁氧化物。在另一个实施方案中，所述纳米球包含生物相容性的生物可吸收聚合物。在任何一种情况下，所述纳米球在体内发生生物吸收，从而限制了纳米颗粒在体内的积累。本发明的肽可以与基质化学偶联，特别是通过化学或肽接头连接。CDl分子是非经典MHC分子的一个实例。非经典MHC分子的特征在于物种之间是非多态 性的、保守的，并具有窄且深的疏水配体结合口袋。这些结合口袋能够将糖脂和磷脂呈递给自然杀伤T (NKT)细胞。NKT细胞代表了共表达NK细胞标志物和半恒定T细胞受体(TCR)的一个独特的淋巴细胞群体。它们参与与许多种疾病有关的免疫应答的调控。在一些实施方案中，通过该治疗扩增的T细胞已被疾病过程预先活化，并且具有记忆表型。在一个方面中，T细胞来自以低亲合力识别靶表位的自身反应性前体。可以通过四聚体结合测定等来测定亲合力。在另一个方面中，抗原/MHC/纳米球复合物在目的自身免疫性疾病的临床症状出现之前、之后或者之前和之后施用。在又一个方面中，所述方法可包括这样的步骤，其包括在治疗之前和/或之后评估自身免疫病的生物学参数，例如对象血糖水平。本发明的方法还可包括评估对象的自身免疫状态，包括评估任何自身反应性免疫应答。在一些方面中，T细胞是⑶4+或⑶8+T细胞或NK T(NKT)细胞。本发明的另一些实施方案包括扩增抗致病性自身反应性T细胞的方法，其包括以足以刺激抗致病性自身反应性T细胞扩增的量施用抗原/MHC/纳米球复合物。在一些方面中，T细胞是⑶8+或⑶4+T细胞或NKT细胞。在又一些实施方案中，本发明包括为对象细胞(例如胰岛细胞)提供针对自身免疫应答(特别是致病性自身免疫应答)之保护的方法，其包括以足以抑制对细胞或包含该细胞之组织的破坏的量向对象施用抗原/MHC/纳米球复合物，其中所述抗原或其所来源的抗原性分子来自与细胞相关的自身抗原。在又一个实施方案中，本发明包括诊断自身免疫作用的方法，其包括评估作为活跃自身免疫作用指示的抗致病性CD8+或CD4+T细胞应答的治疗诱导扩增。本发明的一些实施方案可包括预防、减轻或治疗同种异体或自身免疫应答对移植组织的排斥，这通过以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量或者足以诱导识别移植组织或器官所表达同种抗原或自身抗原的抗致病性细胞发生扩增的量向对象施用与基质有效偶联的抗原/MHC复合物(即抗原/MHC/纳米球复合物)。
本发明的一些实施方案提供了通过防止或抑制细胞死亡或杀伤来增加或维持哺乳动物中预定类型的功能性细胞(例如胰岛细胞)数量的方法。在一些实施方案中，该方法用于治疗期望发生内源性细胞和/或组织再生的自身免疫病。这些自身免疫病包括但不限于糖尿病、多发性硬化、卵巢早衰、硬皮病、口眼干燥综合征(Sjogren’ s disease)、狼疮、白斑病、秃头症(脱发)、多腺性衰竭、格雷夫斯氏病(Grave’ s disease)、甲状腺功能减退、多肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体机能减退、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎等。本发明的一个方面提供了新的两组分治疗方法，以消除已有的自身免疫反应，同时重新建立(re-educating)免疫系统。在某些方面中，抗原/MHC/纳米球复合物不需要与佐剂一起施用就能诱导免疫应答，例如抗体应答。在某些实施方案中，抗原/MHC/纳米球复合物可以与公知的多克隆和单克隆抗体技术联合使用，以在较少使用或不使用佐剂的情况下产生抗体。
下述附图构成本说明书的一部分，其用于进一步说明本发明的某些方面。可通过参考这些附图中的一幅或多幅结合本文所述的具体实施方案的详细描述而更好地理解本发明。图1A-C.低亲合力自身反应性17.6 α /8.3 β CD8+T细胞是抗致糖尿病的。图1�。�17.6 α/8.3 β-NOD (η = 95)与 17.4 α/8.3 β-NOD 小鼠(η = 598)的糖尿病频率。
IB, Tg小鼠中的胰岛炎得分(17.6 α /8.3 β -NOD η = 6，17.4 α /8.3 β -NOD η = 3)。图 1C，NOD (η=56)与LCMV-NOD (η = 10)中的糖尿病频率。图2A-2B.17.6 α/8.3 PTCR 的发育生物学。图 2Α，在 Tg 小鼠中，17.6 α/8.3 β与17.4 α/8.3 β TCR的发育生物学。上图是代表性的脾细胞⑶4和⑶8点状图。下图是用NRP-V7/Kd四聚体染色的CD8+T细胞的比较。图2B, RAG_2-/_Tg小鼠中17.6 α /8.30 β和17.4 α /8.3 β TCR的发育生物学。上图是代表性的脾细胞⑶4和⑶8点状图。下图是用NRP-V7/Kd四聚体染色的⑶8+T细胞的比较。图 3.17.6 α /8.3 β -NOD.RAG-2-/- (η = 13)和 17.4 α /8.3 β -NOD.RAG-2-/-小鼠(η = 106)中的糖尿病频率。图4A-4B.在 TCR a -/-Tg 小鼠中 17.6 α /8.3 β 和 17.4 α /8.3 β TCR 的发育生物学。图4�。贤际谴硇缘钠⑾赴�4和⑶8点状图。下图是用NRP-V7/Kd四聚体染色的CD8+T 细胞的比较。图 4B, 17.6 α /8.3 β -NOD.TCR α -/- (η = 14)和 17.4 α /8.3 β -NOD.TCRa -/-小鼠(η = 28)中的糖尿病频率。点状图FACS图中的值对应于每个象限中的细胞百分比，柱状图中的值对应于染色阳性的细胞百分比(平均值土SE)。图5A-5J.17.6a/8.3i3CD8+T细胞自发分化为具有调控功能的记忆T细胞。图5�。醋� 17.6 a /8.3 β -NOD.TCR a -/-对 17.4 a /8.3 β -NOD.TCR a -/-小鼠的脾 CD8+T 细胞的代表性 FACS 谱。图 5B，TCR a -/-Tg 小鼠的脾(对于 17.6 a /8.3 β -NOD.TCR a -/-，η = 12 ；对于 17.4 a /8.30 β -NOD.TCRa -/-，η = 9)、PLN (对于 17.6 a /8.3 β -NOD.TCRa -/-，η =9 ;对于 17.4 a /8.3 β -NOD.TCRa -/-，η = 6)和 ΒΜ(对于 17.6 a /8.3 β -NOD.TCRa -/-，η=4 ;对于 17.4 a /8.3 β -NOD.TCRa -/-，η = 3)中 CD44hiCD122+CD8+T 细胞的百分比(平均值土SE)。小鼠是9-18周龄。图5C，来自用NRP-V7/Kd四聚体相对于抗⑶122抗体染色的17.6 a /8.30 β -NOD.TCR a -/-小鼠的脾⑶8+T细胞的代表性FACS谱。值是5次不同实验的平均值土SE。图来自17.6 a /8.3 β -NOD.TCR a -/-小鼠的未刺激(naive )脾CD8+T细胞和记忆脾CD8+T细胞的 表型分析。数据代表针对每个标志物的至少两次实验。图5E，来自TCRa -/-Tg小鼠的⑶8+CD4_胸腺细胞和⑶8+脾细胞中⑶122染色的比较。数据代表四次实验。图5F，来自TCR a+Tg小鼠的脾CD8+T细胞对BrdU的摄入。图5G，上图:来自Tg小鼠的脾CD8+T细胞应答于细胞因子IL-2和IL-15 (均为100ng/ml)增殖的代表性FACS谱。下图:来自17.6 a /8.30 β -NOD.TCR a +小鼠的未刺激⑶8+T细胞和记忆⑶8+T细胞应答于不同浓度IL-2和IL-15的扩增倍数。数据代表至少三次实验。图5H，来自17.4 a /8.3 β -NOD.TCR a +小鼠的脾未刺激CD8+T细胞以及来自17.6 a /8.3 β -NOD.TCR a +小鼠的未刺激及记忆CD8+T细胞应答于I μ g/ml NRP-A7DC脉冲刺激的DC的24和48小时后IFN- Y产生。图51，应答于以I μ g/ml NRP-A7脉冲刺激的DC，6小时后，来自17.4 a/8.3 β-NOD.TCR a +小鼠的脾未刺激⑶8+T细胞相对于来自17.6 a /8.3 β -NOD.TCR a +小鼠的未刺激⑶8+T细胞和记忆⑶8+T细胞的细胞内IFN-Y染色。图5J，在不同时间点，应答于I μ g/mlNRP-A7脉冲刺激的DC，IL-2产生和增殖。图5H和图5J中的数据代表四次实验，图51中的数据代表三次实验。图6.CFSE标记的17.4 a/8.3 β CD8+T细胞的增殖。存在来自于17.6 a /8.3 β -NOD.TCR a +小鼠的未刺激⑶8+T细胞和记忆⑶8+T细胞时(上图)，或者来自17.4 α /8.3 β -NOD和LCMV-NOD小鼠的未刺激CD8+T细胞时(下图)，CFSE标记的17.4 α /8.3 β⑶8+Τ细胞响应于NRP-A7脉冲刺激的DC的增殖。数据代表至少五次实验。图7Α-7Β.记忆17.6 α /8.3 β CD8+T细胞杀伤抗原脉冲刺激的APC。图7�。醋�
17.4 α /8.30 β -NOD.TCR α +小鼠的新分离未刺激CD8+T细胞和来自17.6 α /8.30 β -NOD.TCR α +小鼠的未刺激⑶8+T和记忆⑶8+T细胞抗NRP-A7和TUM脉冲刺激的BM DC的体外细胞毒性。数据代表三次实验。用I μ g/ml NRP-A7或TUM脉冲刺激并用[51Cr]-铬酸钠标记的纯化BM DC。效应细胞:靶标细胞的比例=8: I (40000效应细胞:5000靶细胞)。8小时后收获上清液。图7B，体内细胞毒性测定:以1:1的比例将NRP-A7脉冲刺激的(CFSE1。)或TUM脉冲刺激的(CFSEhi)B细胞(上图)或新分离的脾和LN DC(下图)注射进Tg宿主。使用抗B220或抗CDlIcMACS珠分离B细胞或新DC(来自脾和LN)，用10 μ g/ml肽脉冲刺激2小时，洗涤，用CFSE (TUM:3 μ M CFSE、NRP_A7:0.3 μ M CFSE)在37°C标记3分钟，洗涤三次，将来自每个群体的4-5X IO6个细胞注射进宿主。18小时后，处死小鼠，对脾细胞进行FACS分析。图8描述了与pMHC缀合的PLGA (聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯))纳米球的放大 图像。图9描述了⑶8+T细胞对指示纳米颗粒/孔浓度下的IGRP/Kd-PLGA纳米球复合物的IFNy应答。发明详述应理解，本发明不限于描述的一些具体实施方案，由此，其当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案，而不旨在限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。必须注意，除非上下文明确规定，否则本文和所附权利要求书中没有数量词修饰的指示物包括复数的指示物。因此，例如，提到“赋形剂”包括多种赋形剂。1.定义除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。本文使用的以下术语具有以下含义。本文使用的词语“包含/含有”旨在指组合物和方法包括所列举要素，但不排除
其他要素。当“基本上由......组成”用于限定组合物和方法时，将意指排除关于阐明
目的对组合有任何重要意义的其他要素。因此，如本文定义的基本上由一些要素组成的组合物将不排除实质上不影响所要求保护发明的基本特征和新特征的其他材料或步骤。
“由......组成”将指排除多于痕量的其他成分和实质性方法步骤的要素。由这些连接术
语中的每一个定义的实施方案都在本发明范围内。“生物相容性”意指递送系统的组分不引起组织损伤或对人生物系统的损伤。为了赋予生物相容性，将优先使用在人体中具有安全使用历史或者具有GRAS ( —般认为安全)状态的聚合物和赋形剂。生物相容性意指用于组合物的成分和赋形剂将最终“被生物吸收”或被身体清除，并且对身体没有不利影响。对于生物相容性的并且被认为无毒的组合物，其不可以对细胞产生毒性。类似地，术语“生物可吸收”指由经某一时间段在体内发生生物吸收的材料制得的纳米颗粒，从而避免所述材料在患者中长期积累。在一个优选实施方案中，所述生物相容性纳米颗粒经小于两年，优选小于I年并且甚至更优选小于6个月的时间被吸收。生物吸收的速率与颗粒尺寸、所用材料和本领域技术人员公知的其他因素有关。生物可吸收的生物相容性材料的混合物可用于形成用于本发明的纳米球。在一个实施方案中，可将铁(III)氧化物与生物相容性的生物可吸收聚合物组合。例如，铁(III)氧化物与PGLA可组合形成纳米颗粒。抗原/MHC/纳米球复合物指在表面(如生物相容性的生物可降解纳米球)上呈递肽、碳水化合物、脂质、或者抗原分子或蛋白质(即，自身肽或自身抗原)的其他抗原性区段、片段或表位。本文使用的“抗原”指可在对象中诱导免疫应答或抗致病性细胞扩增的分子的全部、部分、片段或区段。当术语“约”用于数字指示物(例如温度、时间、量和浓度)，包括范围之前时指可有⑴或(_)10%、5%或1%变化的近似值。“杀伤”意为通过凋亡或坏死使得细胞死亡。凋亡或坏死可通过任何细胞死亡途径介导。“自身免疫细胞”包括例如成体脾细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和骨髓来源的细胞，例如哺乳动物的缺陷型抗原呈递细胞，所述细胞针对该自身免疫细胞所来源的生物体具有活性。“模拟物”是给定配体或肽的类似物，其中所述类似物与所述配体基本上类似。“基本上类似”意为所述类似物具有类似于所述配体的结合谱，只是该模拟物具有一个或更多个官能团或修饰，总计占所述配体分子量的少于约50%、少于约40%、少于约30%、少于约20%、少于约10%或少于约5%。“有效量”是足够达到预期目的(例如对T细胞活性或T细胞群的调节)的量。如本文详细所述，有效量或剂量取决于目的和所述抗原，并且其可根据本公开内容来确定。“自身反应性T细胞”是识别“自身抗原”(含有该T细胞的同一个体所产生并含有的分子)的T细胞。自身反应性T细胞可以是⑶8+T细胞或⑶4+T细胞。另外，⑶4+T细胞可被归类为TRl (I型调节性T)细胞。“致病性T细胞”是对含有该T细胞的对象有害的T细胞。而非致病性T细胞对对象无显著�：Γ怪虏⌒訲细胞减少、减轻、抑制或消除致病性T细胞的危害。在权利要求书和/或说明书中使用时，术语“抑制”、“减少”或“防止”或者这些术语的任何变化包括任何可测量的降低或完全抑制，以达到预期结果。在权利要求书和/或说明书中与术语“包括/包含”一起使用时，没有数词修饰的名词可表示“一个”，但是也与“一个或更多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”的意思相同。术语“抗致病性”指对引起疾病具有保护作用的细胞。例如，“抗致病性自身反应性CD8+T细胞”指对TlD具有保护作用的细胞。“抗致病性的自体反应CD8+T细胞”也指对其他自身免疫病(例如名为DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC TARGETS的第V章中列举的那些)具有保护作用的细胞。本文中，“纳米球”意指可施用于对象的小离散颗粒。在一些实施方案中，所述纳米球的形状基本上为球形。本文使用的术语“基本上为球形”意指颗粒的形状不偏离球形大于约10%。本发明的多种已知抗原或肽复合物可用于所述 颗粒。本发明纳米球的尺寸为约IOnm至约150 μ m,优选约IOnm至约I μ m。可通过例如分级分离从而使得较大颗粒在水溶液中沉淀来得到较小纳米尺寸的颗粒。然后回收溶液上层。该上层富含较小尺寸的颗粒。可重复该过程直至产生期望的平均尺寸。本申请通篇中，术语“约”用于表示数值包括用于测定该值的设备或方法之误差的标准差。权利要求书中术语“或”用于表示“和/或”，除非明确说明表示仅仅择一选择或者所述择一选择彼此互斥，尽管本公开内容支持表示仅仅择一选择以及“和/或”的定义。如本文和权利要求中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，来表示数类结构上相关蛋白中的任意种类，其起到动物或受体的免疫应答之一部分的功能，所述蛋白质包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白。本文使用的术语“免疫原性物质”或“免疫原”或“抗原”可互换使用，以描述能够在单独或者与佐剂联合或者在展示载体上施用给受体后诱导针对其自身的免疫应答的分子。本文所使用的“氨基分子”是指本领域中已知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在一些实施方案中，蛋白性分子的残基是连贯的，没有任何非氨基分子插入在氨基分子残基的序列中。在另一些实施·方案中，所述序列可包括一个或更多个非氨基分子部分。在一些具体实施方案中，所述蛋白性分子的残基序列中可插入一个或更多个非氨基分子部分。因此，术语“蛋白性组分”涵盖了包含天然合成蛋白质中20种常见氨基酸中至少之一或者包含至少一个经修饰或非常见氨基酸的氨基分子序列。如本文使用的，术语“治疗”意指患者疾病或病症的任何治疗，其包括:.预防或保护免受疾病或病症，即例如在具有患这种疾病或病症风险的对象中使临床症状不发生，从而基本上避免疾病或病症发�。�.抑制疾病或病症，即阻止或抑制临床症状的发展；和/或.减轻疾病或病症，即引起临床症状的消退。下述详细说明将进一步明确本发明的其他目的、特征和优点。但是，应理解，所述详细说明和具体实施例尽管给出了本发明的一些具体实施方案，但是仅以举例形式给出，这是因为通过此详细说明本发明的精神和范围之内的多种变化和修饰对于本领域技术人员来说是很明显的。目前的观察结论(Han等，2005)认为，想要在自身免疫反应中有效，肽疗法必须靶向多种表位特异性。可溶性肽可诱导肽特异性T细胞耐受，但是不能削弱多特异性自身免疫应答。本发明人认为用肽完成这一任务是非常不实际的，因为仅IGRP就需要每个剂量数毫克的肽。由于在与固定在APC上的MHC分子连接时，肽的致耐受性高得多(即在较低的量时)(Miller等1979)，所以认为全身性递送纳米球上的抗原/MHC复合物例如肽/MHC复合物(不含共刺激分子)可能比单独的肽有更高的致耐受性。这一想法是从最初用于对胰岛炎症进行成像的试剂的可用性演化而来。本发明人寻求特异性递送适于对循环8.3样CD8+T细胞进行磁共振(MR)成像的探针(由NRP-V7/Kd复合物包被的铁氧化物纳米球)(Moore等，2004)。具体地，本发明人考虑将这些纳米球用几种不同的抗原/MHC复合物包被，作为诱导将多种T细胞特异类型的同时清除至TlD发生所需阈值之下的方式。最出乎意料地，发现结合到固相支持物的PMHC复合物通过以表位特异性方式扩增作用于经历自身抗原(autoantigen-experienced)的自身反应性0)8+细胞,从而抑制其他自身抗原特异性的募集。在慢性自身免疫应答的进展中这种治疗途径开发了新模式，该模式能够合理设计能够削弱自身免疫作用并且不影响全身免疫的疾病特异性“纳米疫苗(nanovaccine) ”，这是这些疾病治疗中长久以来广受欢迎的目标。根据上述模式，可以使用疾病中涉及的(数百种中的)任何一种单一表位(PMHC)特异性，当将其作为配体包被到NP上时削弱了复合物自身免疫应答。颗粒/固相支持物组分是必不可少的，原因是多聚体可溶性PMHC不能引发由其NP偶联的对应物诱导的免疫应答类型。颗粒能够使pMHC优先多聚化并且向这些PMHC提供强有力的受体交联特性。因此，能够实现该发现的该模式和治疗途径提供了新一类自身免疫作用治疗的平台。考虑包被有抗原/MHC复合物的纳米球(抗原/MHC/纳米球复合物)将扩增在APL处理小鼠中提供TlD保护的低亲合力抗致病性自身反应性CD8+细胞类型(Han等，2005 ；Maree等，2006)。还考虑这些纳米颗粒将扩增之前已存在的记忆自身反应性⑶8+T细胞池(即它们不从头诱导记忆T细胞)。认为这些之前已存在的细胞池主要(如果不是全部)由低亲合力(非致病性/抗致病性)自身免疫性CD8+克隆型构成。这些T细胞的高亲合力对应物(具有致病活性)在体内不以记忆细胞形式存活，可能(但是不将本发明限于任何特定理论)是因为它们在长期暴露于它们的内源靶标β细胞自身抗原后，发生活化诱导的细胞死亡。认为这些纳米球不需要一定靶向到自身反应性CD8+T细胞的优势群体才能有效:用包被有次要肽/MHC复合物的纳米球获得类似结果。另外，认为此技术不需要设计具有确定亲合力的APL (与使 用肽时不同)，因此有可能容纳任何靶抗原或肽/MHC靶标。考虑此技术将使新诊断出TlD的NOD小鼠恢复正常血糖水平，其恢复速率至少相当于(如果不是更好的话)用抗CD3mAb治疗所获得的结果，所述抗CD3mAb治疗是在临床试验中显示出一些前景的非抗原特异性方法(Herold等,2002 ;Keymeulen等,2005)。认为本发明的组合物可用于扩增之前已存在的记忆自身反应性⑶8+T细胞池(即，它们看来不能够从头诱导记忆T细胞)。这些之前存在的细胞池主要(如果不是全部的话)由低亲合力(抗致病性)自身反应性CD8+克隆型构成。这些T细胞的高亲合力对应物(具有致病活性)在体内不以记忆细胞形式存活，而主要以未刺激T细胞形式存在。还考虑未刺激T细胞没有共刺激的情况下接触自身抗原/MHC/纳米球复合物后，发生细胞死亡，因此本发明既清除未刺激的致病T细胞，又扩增抗致糖尿病记忆T细胞。所述组合物不需要靶向自身反应性CD8+T细胞优势群体才能有效。在某些实施方案中，所述组合物和方法可用于诱导自身反应性T细胞耐受。考虑与包被在不可生物降解的生物不可吸收的固相支持物上的pMHC/抗原复合物相比，生物可降解的生物可吸收纳米球将具有出乎意料且意想不到的结果。这些意想不到的结果包括毒性降低。毒性降低可指纳米球在整个身体的器官和/或组织中的积累减少。毒性降低还可指不期望的生物应答降低，例如炎症降低或整个身体器官的组织损伤降低。炎症和组织损伤是可易于通过已知方法由技术人员测定的评估。还考虑所述生物可降解的生物可吸收纳米球对于身体将更加耐受。这可导致治疗剂量减少或治疗效果增加或更有效。因为治疗效果与自身免疫作用有关，所以其可通过实施例中描述的测定来确定。在本发明的一个实施方案中，生物可降解的生物可吸收材料由专业的临床医生根据预测的纳米球体内半衰期来选择。半衰期可容易地根据纳米球的物理特性(例如所使用材料和纳米球的大小)确定。在一个优选实施方案中，降解速率对应于临床医生测定的实现最大治疗作用的时间范围。因此，考虑所述生物可降解的生物可吸收纳米球将具有改善的且优秀的治疗潜力，原因是选择了将在预测时间范围内降解并且具有最小不利副作用的材料。I1.药物组合物和施用本发明包括预防或减轻自身反应性疾病的方法。由此，本发明考虑在多个实施方案中使用“疫苗”或免疫系统调节剂。提出适用于疫苗的组合物可以由自身反应性分子(包括自身反应性蛋白及其片段)制备。本发明包括可用于诱导或调节针对自身反应性抗原(例如多肽、肽、碳水化合物、脂类或其他分子或分子片段)以及针对这些自身免疫应答所致疾病或病症的免疫应答的组合物。本发明的组合物通常可通过注射胃肠外施用，例如，静脉内、皮下或肌内。适用于其他施用模式的其他制剂包括口服制剂。口服制剂包含通常所用的赋形剂，例如药用级甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液剂、混悬剂、片齐U、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂的形式，并含有约10%至约95%的活性成分，优选约25%至约70%。通常，本发明的组合物在具有治疗有效性和免疫调节性的量，以相容于给药制剂的形式施用。待施用的量取决于待治疗对象。需要施用的活性成分的精确剂量取决于执业医师的判断。但是，合适的剂量从每次施用10纳克至数百纳克级别或者微克级别的抗原/MHC/纳米球复合物。合适的初次施用和加强方案也是多样的，但是通常为初次施用，然后是后续施用。应用的方式可以多种多样。任何施用疫苗的常规方法都可以应用。认为这些包括在固体生理可接受基质上或者在生理可接受分散体系中经口施用，通过注射胃肠外施用，等等。抗原/MHC/纳米球复合物的剂量取决于施用途径，并且可以根据对象的体型大小和健康状况而改变。 在许多情况下，会期望多次施用肽/MHC/纳米球复合物，最多约或者最少约3、4、
5、6、7、8、9、10或更多次。所述施用通常间隔2天至12周，更通常间隔I周至2周。间隔0.5-5年定期加强免疫(通常2年)对于维持免疫系统的状况来说是理想的。施用过程之后可以是对自身反应性免疫应答和T细胞活性的测定。A.组合疗法本发明的组合物和相关方法(特别是抗原/MHC/纳米球复合物的施用)还可联合传统疗法的施用一起应用。它们包括但不限于施用免疫抑制或调节疗法或治疗。在一个方面中，考虑抗原/MHC/纳米球复合物与细胞因子治疗联合使用。或者，抗原/MHC/纳米球复合物施用可以在其他治疗之前或之后进行，其间间隔数分钟到数周。在一些实施方案中，其他药剂和/或抗原/MHC/纳米球复合物分别施用，一般可以确保每次递送之间不会超过一定的间隔，使得所述药剂和抗原/MHC/纳米球复合物仍能够发挥对所述对象的有利联合作用。在这些实例中，设想可以将两种形式彼此在约12-24小时之内施用，更优选地，彼此在约6-12小时之内施用。在一些情况下，可能期望将施用时间段显著延长，但是各次施用间间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。可以利用多种组合，例如抗原/MHC/纳米球复合物施用是“A”，另一药剂是“B”:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A本发明的肽-MHC复合物组合物将按照此类化合物的一般方案施用给患者/对象，并考虑其毒性(如果有的话)。预计按照需要来重复治疗周期。还考虑可以将多种标准疗法例如水化疗法(hydration)与所述疗法联合应用。B.药物组合物在一些实施方案中，将药物组合物施用给对象。本发明的不同方面包括将有效量的抗原/MHC/纳米球复合物组合物施用给对象。另外，这些组合物可以与免疫系统调节剂联合施用。这些组合物一般溶解或分散在可药用载体或水介质中。短语“可药用”指在施用给动物或人时不产生有害的、变应性的或其他不良的反应的分子实体和组合物。如本文所用的，“可药用载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。用于药物活性物质的这些介质和试剂是本领域公知的。除了与所述活性成分不相容的常规介质或试剂之外，均考虑将其用于免疫原性和治疗组合物。本发明的活性化合物可配制成用于胃肠外施用，例如配制成用于通过静脉内、肌内、皮下或者甚至腹膜内途径的注射。在本发明公开的教导下，含有调节对象免疫疾病的抗原/MHC/纳米球复合物的含水组合物的制备是本领域技术人员已知的。通常，这些组合物可被制备成注射剂:液体溶液或混悬液；也可以制备成适用于注射之前通过加入液体而制备溶液或混悬液的固体形式；所述制剂还可以是乳化剂。适用于注射应用 的药 物形式包括:无菌水溶液或分散系；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；以 及用于临时制备无菌注射溶液或混悬液的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是易于注射程度的流体。其还应该是在制备和储存条件下稳定的，并且必须被保护以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。所述组合物可被配制成中性或盐形式。可药用盐包括酸加成盐(与所述蛋白质的游离氨基形成)，它是与无机酸形成的，例如盐酸或磷酸，或者有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。与游离羧基形成的盐可以来自于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等等。载体还可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物，以及植物油。可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持所需粒径(对于分散体系的情况)，以及通过使用表面活性剂，来保持合适的流动性。可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等)来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用吸收吸附剂的组合物例如单硬脂酸铝和明胶来得到注射用组合物的延长吸收。可如下制备无菌注射液:将所需量的活性化合物掺入按照需要具有多种其他上文所列成分的合适溶剂，然后除菌。进行溶液的除菌，以此方式使肽/MHC/纳米球的抗致病性不减少。一般来说，通过将多种已灭菌活性成分加入到含有基础分散介质和选自上文所列的所需其他成分的无菌载体来制备分散体系。若是用于制备无菌注射用溶液的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生所述活性成分的粉末，加上来自其之前除菌溶液的任何其他所需成分。溶液除菌的一种此类方法是无菌过滤，但是，本发明意在包括不显著降低肽/MHC/纳米球复合物的抗致病性的任何除菌方法。涉及强热和压力的除菌方法(例如高压蒸汽灭菌)可破坏复合物的三级结构，进而显著降低肽/MHC/纳米球复合物的抗致病性。本发明组合物的施用通常通过任何常用途径来实现。其包括但不限于正位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或者静脉内注射。在一些实施方案中，疫苗组合物可以被吸入(例如美国专利N0.6，651，655，其通过引用整体并入本文)。根据预定目的确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”指适用于对象的物理上的分散单位，每个单位含有预定量的组合物，其经计算产生上文在论及施用时(即合适的途径和方案)所述的所需作用。由治疗次数和单位剂量决定的待施用量取决于期望的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于执业医师的判断，对于每个个体来说都是特有的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、预定治疗目标(是减轻症状还是治愈)，以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在制备后，溶液以与给药制剂相容的形式以治疗或预防有效量施用。所述制剂以多种给药形式容易地施用，例如上文所述的注射用溶液类型。C.体外或离体施用如本文所述，术语“体外施用”指对从对象中取出的细胞或者位于对象之外的细胞进行操作，包括但不限于培养细胞。术语“离体施用”指已在体外进行过操作的细胞接着被施用给对象。术语“体内施用”包括所有在对象体内进行的操作，包括施用。在本发明的一些方面中，所述组合物可以体外、离体或体内施用。在一些体外实施方案中，自体T细胞与本发明组合物一起孵育。然后所述细胞用于体外分析，或者用于离体施用。II1.MHC 复合物
`
抗原，包括来源于抗原性物质(包括但不限于肽、碳水化合物、脂类或本发明的经典和非经典MHC分子所呈递的其他分子)的区段、片段或其他分子，通常与MHC分子或其衍生物复合或有效偶联。T淋巴细胞对抗原的识别是主要组织相容性复合物(MHC)限制性的。给定T淋巴细胞仅识别与特定MHC分子结合的抗原。一般地，T淋巴细胞仅在自身MHC分子存在时被激活，抗原以与自身MHC分子相结合的抗原片段的形式被识别。MHC限制性在所识别抗原方面以及与其抗原性片段结合的MHC分子方面限定了 T淋巴细胞的特异性。在一些具体方面，一些抗原会与特定MHC分子或来源于其的多肽配对。本文所用的术语“有效连接”或“包被”指在与靶位点(例如免疫细胞)结合之前，各个多肽组分(例如MHC)和抗原性组分(例如肽)组分相结合形成活性复合物。这包括以下情况:在施用给对象之前，在体外合成或重组表达各个多肽复合物组分，然后分离并结合以形成复合物；嵌合或融合多肽(即所述复合物每个独立的蛋白质组分包含在单个多肽链中)合成或重组表达成完整复合物。通常，将多肽复合物添加到纳米球，以形成吸附有或连接有多肽复合物的纳米球，其分子数:纳米球数比约为约、至少约或至多约0.1,0.5、1、10、100、500、1000或更多比1，更常见0.1: I至50: I。可以使用标准技术测定所述纳米球的多肽成分含量。A.MHC 分子
细胞内和细胞外抗原在识别和合适应答方面都给免疫系统带来完全不同的挑战。抗原呈递到T细胞是由两类不同的分子介导的:1类MHC(MHC-1)和II类MHC (MHC-1I)，它们利用不同的抗原加工途径。来自胞内抗原的肽被在几乎所有细胞上表达的I类MHC分子呈递给⑶8+T细胞，而来自胞外抗原的肽被II类MHC分子呈递给⑶4+T细胞。但是，此二分法有一些例外情况。一些研究显示，从被胞吞的颗粒或可溶蛋白产生的肽在巨噬细胞和树突细胞中的MHC-1分子上呈递。在本发明的一些实施方案中，鉴定了来源于自身抗原的特定肽，其在合适的I类或II类MHC多肽背景下在肽/MHC/纳米球复合物中呈递。在一些方面中，可评估对象的遗传组成，以确定将哪种MHC多肽用于特定患者和特定的肽集合。还考虑将非经典MHC分子用于本发明的MHC复合物。非经典MHC分子是在物种之间非多态性的、保守的，并具有窄且深的疏水配体结合口袋。这些结合口袋能够将糖脂和磷脂呈递给自然杀伤T (NKT)细胞。NKT细胞代表一类独特的淋巴细胞群体，其共表达NK细胞标志物和半恒定T细胞受体(TCR)。它们参与与许多种疾病相关的免疫应答的调控。B.抗原性组分本发明的一些方面包括涉及抗原性组合物的方法和组合物,所述抗原性组合物包括多肽、肽、核酸、碳水化合物、脂类和其他引起或诱导抗原应答之分子的区段、片段或表位，一般称其为抗原。特别的，可鉴定通过自身免疫应答导致细胞破坏的自身抗原或这些自身抗原的抗原性区段或片段，并将其用于产生本文所述的MHC/纳米球复合物。这些自身抗原可传递于胰岛或支持胰岛细胞的细胞上。本发明的一些实施方案包括调节针对发挥特定生理功能之特定细胞或细胞群的免疫应答的组合物和方法。1.肽组分和蛋白性组分可以通过多种氨基酸缺失、插入和/或替换来修饰本发明的多肽和肽。在一些特定实施方案中，经修饰的 多肽和/或肽能够调节对象中的免疫应答。如本文所述，“蛋白质”或“多肽”或“肽”指包含至少5个氨基酸残基的分子。在一些实施方案中，利用野生型形式的蛋白质或肽，但是，在本发明的许多实施方案中，利用经修饰的蛋白质或多肽来产生肽/MHC/纳米球复合物。可使用肽/MHC/纳米球复合物来产生免疫应答和/或修饰免疫系统的T细胞群(即重新训练(re-educate)免疫系统)。上文所述术语在本文中可互换使用。“经修饰蛋白质”或“经修饰多肽”或“经修饰肽”指化学结构特别是氨基酸序列相对于野生型蛋白质或多肽发生改变的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，经修饰蛋白质或多肽或肽具有至少一种经修饰的活性或功能(在认可蛋白质或多肽或肽可具有多种活性或功能的情况下)。特别地，考虑在MHC/纳米球复合物的背景下，经修饰的蛋白质或多肽或肽可以在一种活性或功能方面发生变化，但是保留其他方面的野生型活性或功能，例如免疫原性或与免疫系统的其他细胞相互作用的能力。本发明的肽包括任何自身反应性肽。自身反应性肽包括但不限于hInsB10_18 (HLVEALYLV (SEQ ID NO:1))、hIGRP228_236 (LNIDLLWSV (SEQ ID NO:2))、hIGRP265_273 (VLFGLGFAI (SEQ ID NO: 3)) , IGRP206^214 (VYLKTNVFL (SEQ ID N0:4))、hIGRP206_214 (VYLKTNLFL (SEQ ID NO:5))、NRP-A7 (KYNKANAFL (SEQ ID NO:6)),NRP-14(KYNIANVFL(SEQ ID NO:7))、NRP-V7(KYNKANVFL(SEQ ID NO:8))、YAI/Db(FQDENYLYL(SEQ ID NO:9))和 / 或 INS B15_23(LYLVCGERG(SEQ ID NO:10))以及美国专利公开20050202032中公开的肽和蛋白质，其通过引用整体并入本文。其他可在本发明中作为自身反应性肽或作为对照肽的肽包括但不限于INS-19 (LYLVCGERI (SEQ ID NO:11))、TUM(KYQAVTTTL(SEQ ID NO:12))和 G6Pase (KYCLITIFL(SEQ ID NO:13))。在一些方面中，可使用1、2、3、4、5、6或更多种肽。可用于本发明的肽实例还包括表I中给出的那些。这些肽可以与特定的纳米球/MHC分子相结合，或者多个肽可以与共同的纳米球和一个或更多个MHC分子相结合。这些肽组合的施用包括施用一组附着有多种肽的纳米球和/或施用各自附着有一种特定肽的多个纳米球的组，或者这些纳米球的组合，其包括1、2、3、4、5、6或更多种纳米球，其附着有1、2、3、4、5、6或更多种肽。
表IA TlD的I类HLA局限性表位
权利要求
1.诊断、预防或治疗自身免疫病的方法，其包括以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量向对象施用有效偶联到生物相容性生物可吸收纳米球的抗原-MHC复合物。
2.用于在对象中扩增和/或产生抗致病性自身反应性T细胞群体的方法，所述方法包括向所述对象施用自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可降解纳米球复合物，其中所述复合物以足以扩增所述群体的量和频率施用。
3.权利要求2的方法，其中所述自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可降解纳米球复合物中包含多个自身抗原表位。
4.权利要求3的方法，其中所述多个自身抗原表位来源于单个自身抗原。
5.权利要求3的方法，其中所述多个自身抗原表位来源于多个自身抗原。
6.权利要求5的方法，其中所述扩增的抗致病性自身反应性T细胞群体是抗原特异性的，但是以非抗原特异性方式抑制。
7.权利要求2、4或5中任一项的方法，其中所述生物相容性生物可吸收纳米球复合物的施用清除所述同源致病性自身反应性T细胞群体。
8.权利要求2、4或5中任一项的方法，其中所述生物相容性生物可吸收纳米球复合物的施用清除所述非同源致病性自身反应性T细胞群体。
9.自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其包含生物相容性芯核和所述芯核外表面上的生物可降解包衣。
10.权利要求9的自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其中所述生物相容性芯核由铁(III)氧化物构成。
11.权利要求9的自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其中所述生物可降解包衣选自葡聚糖、甘露醇和聚(乙二醇)。
12.权利要求9的自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其中所述纳米球共价结合到所述自身抗原表位-MHC复合物的MHC基团，其中所述结合任选地通过接头。
13.抑制自身免疫病发病的方法，其中所述方法包括以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量向对象施用有效偶联到生物相容性纳米球的抗原-MHC复合物，其中所述MHC分子包括II类MHC分子。
14.权利要求13的方法，其中所述自身反应性T细胞是CD4+TR1细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述⑶4+TR1细胞的特征在于IL-10和IFNy表达。
16.用于治疗自身免疫病之炎症性组分的方法，其中所述方法包括 向患具有炎症性组分之自身免疫病的对象施用有效偶联到生物相容性纳米球的抗原-MHC复合物，其中所述MHC分子包括II类MHC分子并且所述抗原对所述自身免疫病具有特异性，并且其中所述复合物的所述施用的量足以扩增表达IL-10的抗致病性自身反应性TRl细胞群体； 在引起所述自身免疫病之所述炎症性组分减少的条件下，使所述TRl细胞在所述自身免疫病的部位积累，从而使得IL-10在所述部位积累。
17.权利要求16的方法，其中所述MHC分子是II类MHC分子。
18.权利要求16的方法，其中所述自身反应性T细胞是CD4+TR1细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述⑶4+TR1细胞的特征在于IL-10和IFNy表达。
20.权利要求13或16中任一项的方法，其中所述纳米球由一种或更多种生物相容性生物可吸收材料形成。
21.用于在患者中治疗自身免疫病的方法，所述方法以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量向所述患者施用有效偶联到生物相容性纳米球的抗原-MHC复合物，其中所述MHC分子包括I类MHC和II类MHC分子二者。
22.权利要求21的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病。
全文摘要
本发明方法包括使用生物相容性的生物可吸收纳米球根据T细胞的抗原特异性选择性减少或扩增T细胞。因此，本发明可用于减少或清除识别自身抗原的致病性T细胞，例如β细胞特异性T细胞。这样，本发明可用于预防、治疗或减轻自身免疫病例如IDDM。另外，本发明可用于扩增期望的T细胞，例如抗致病性T细胞，以预防、治疗和/或减轻自身免疫病。
文档编号G01N33/564GK103237559SQ201180047463
公开日2013年8月7日 申请日期2011年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者佩德罗·圣玛丽亚 申请人:乌第有限合伙公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
