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专利名称：一次性电化学芯片的制作方法
技术领域：
本实用新型一次性电化学芯片，属于第二代生物芯片，可以用新型纳米材料及生物学分子进行修饰，并可与多通道恒电位仪相连接和测试。在每张电化学芯片上都含有16 个独立分析微孔，电化学芯片集成度高，易于批量生产，性质稳定，非常适合在医院检验科应用。利用此芯片可以直接对临床尿路常见感染病原菌进行鉴定及药敏分析，而不用对病原菌进行培养或基因扩增，临床标本检测量小(3-50 μ L)，准确度高，特异性强，诊断时间短。
背景技术：
尿路感染病原菌检测金标准通过常规细菌培养及药敏实验进行检测，其不足之处是至少需要2-3天的时间才能从临床标本中分离培养出致病菌株以及完成相关药敏测试，而且一些生长缓慢和不易培养的尿路病原菌是无法通过常规药敏试验方法进行检测， 在缺乏快速微生物诊断的情况下，临床医生很可能就会凭经验主义来进行抗生素用药，延误了对病人治疗的最佳时机。以聚合酶链式反应(PCR)为基础的实时荧光定量PCR技术可以从分子生物学水平检测细菌[1_2]。该方法可以直接从临床标本入手，而无须菌株的培养，整个实验过程需要4-6 小时。但是，常规分子生物学方法对每一个测试的抗菌药物，均需要设计相应的分子检测方法，一次只能分析一种细菌ω。基因芯片技术自问世以来[4]，以其基于核酸杂交的检测高度特异性，检测时的高通量以及平行分析的特点[5_8]，1998年被美国科学促进会评为当年十大科技进展之一 [9]，并为临床细菌检测提供了高效、高度特异的诊断技术，也为医学诊断及治疗技术进步做出杰出的贡献，解决传统基因诊断技术所不能解决的系列难题[1°_11]。但是传统的基因芯片技术，无论是微阵列，还是原位合成的寡核苷酸基因芯片，均使用荧光标记探针技术[12_13]，应用时需要昂贵的激光扫描设备[14]，此外，传统技术不能完全消除细菌检测时的阴性信号，阴阳性信噪比对比低，存在人为判断其阴阳性结果.这些因素严重制约了基因芯片技术在临床细菌检测及药敏分析中的广泛应用。参考文献l.ffolff BJ, Thacker WL, Schwartz SB, Winchell JM. Detection of macroIide resistance in Mycoplasma pneumoniae by real-time PCR and high-resolution melt analysis. Antimicrob Agents Ch,2008,52(10) :3542-3549.2. Monleau M, Montavon C, Laurent C, Segondy M, Montes B, Delaporte E, Boilloit F, Peeters M. Evalua-tion of different RNA extraction methods and storage conditions of dried plasma or blood spots for human immunodeficiency virus type 1 RNA quantification and PCR amplification for drug resistance testing. J Clin Microbiol,2009,47(4) :1107-1118.3. Hindiyeh M, Ram D, Mandelboim M, TMeningher T, Hirsh S, Robinov J, LevyV, Orzitzer S, Azar R, Grossman Ζ, Mendelson Ε. Rapid detection ofinfluenza A pandemic (HlNl)2009virus neuraminidase resistance mutation H275Y by real-time RT-PCR. JClin Microbiol,2010,48(5) :1884-1887.4.Fodor SP, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D.Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991,251:767-7735.Pellois JP, Zhou X, Srivannavit 0, Zhou T, Gulari E, Gao X.Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotechnol 2002,20: 922-92266. Schena M, Shalon D, Heller R, Chai A, Brown PO, Davis Rff. Parallelhuman genome analysis :microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Proc Natl Acad Sci USA 1996,93 :10614-106197. Lockhar t DJ, Winzeler EA.Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature, 2000,405 :827-8368. Xiao Y, Segal MR, Yang YH, Yeh RF. A multi-array multi-SNP genotyping algorithm for Affymetrix SNP microarrays. Bioinformatics, 2007, 23 :1459-14679.Breakthrough of the year. The runners-up. Science, 1998, 282 :2157-216110. Gerhold DL, Jensen RV, Gul Ians SR. Bet ter therapeutics through microarrays. Nat Genet,2002, 32 :547-55111.Ragoussis J, Elvidge G.Affymetrix GeneChip system:moving from research to the clinic.Expert Rev Mol Diagn, 2006,6 :145-15212. Shomaker TS, Ward K. Microarray technology inbiomedical research. Hawaii Med，2006，65 :253-25613. Duyk GM. Sharper tools and simpler methods. Nat Genet,2002,32 Suppl 465-46814. Schena M, Shalon D, Davis Rff, Brown P0. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science,1995,270 467-470
发明内容为了克服目前临床尿路病原菌检测及药敏分析耗时长，操作繁琐，检测量低及检测成本高的问题，本实用新型提供了一种一次性电化学芯片。本实用新型解决以上问题所采用的技术方案是(1)在玻璃板上一次性加工上16个微反应孔，每个微孔包括由金纳米导电材料构成的三个微电极工作电极，辅助电极，参比电极。(2)在每个工作电极表面构建烷化巯基自组装分子层，然后再用NHS和EDC对自组装层功能化，并将生物素和亲和素修饰到工作电极上。注工作电极上还可以修饰NH2、C00H、生物素、亲和素、辣根过氧化物酶、抗体。(3)利用生物信息学技术，制作和尿路病原菌16SrRNA特异性保守序列相互补的一抗标记的检测探针与亲和素化的捕获探针，并将亲和化的捕获探针修饰到工作电极表
4面。注16S rRNA为所有细菌所共有，其编码基因兼保守性和变异性于一身，素有细菌的“分子化石”之称。16SrRNA基因的保守性又是相对的，在保守区之间存在着9个或10个变异区(VI V10)，不同科、属、种间都有不同程度的差异，利用Vl-VlO间的变异进行种属特异性探针设计。探针为寡核苷酸探针或肽核酸(PNA)探针。(4)临床标本处理将尿液离心五分钟，然后再加入NaOH、TritonX-100、EDTA、溶解酵素、TRIS-HCL，在室温下孵育5分钟，将检测探针混合液加入到细菌裂解液中孵育和细菌靶16SrRNA特异性保守序列充分杂交，将4 μ L混合液加入到芯片微孔中，等充分孵育，再加入 HRP 和 TMB-H2O2。(5)芯片检测利用特制的电化学芯片读数器和多通道恒电位仪相连接，将芯片上的反应信号，以可读的电信号输出，从而确定细菌种类及进一步药敏分析。该一次性电化学芯片不仅能对临床尿路常见病原菌进行快速检测(45分钟)和快速药敏分析(3. 5小时)，而且和目前常用多通道恒电位仪可以相结合，大大降低了检测成本。

图1是本新型电化学芯片立体图。图2是本电化学芯片的相应读数器立体简图。图3是读数器对电化学芯片进行读数简图。在图中⑴电化学芯片玻璃底板，(2)辅助电极，(3)工作电极，⑷参比电极，(5) 反应微孔，(6)读数器芯片槽，(7)反应信号输出导线，⑶读数器平面图，(9)电化学芯片平面图.
具体实施方案由图1可见，本电化学芯片是以75士 1_Χ25士 1_Χ1士0. 5mm的玻片(1)为固相底板，在上面一次成型构造16个金纳米反应微孔(5)，每个反应微孔都包含有三个电极工作电极(3)，辅助电极O)，参比电极⑷；每个工作电极(3)上都修饰有功能化的纳米材料和生物分子复合层，再在复合层修饰核苷酸或肽核酸捕获探针链，从而建立16SrRNA特异性序列识别层。由图2可见，一个宽80mmX40mmX4mm的电化学芯片读数器，有一个电化学芯片读数槽(6)和两排反应信号输出导线(7)。由图3可见，将电化学芯片(9)放入到读数器(8)芯片槽里面进行读数，并通过输出导线(7)将反应信号输出。
权利要求1.一次性电化学芯片，有一个玻璃底板，其特征在于在玻璃底板上有16个反应微孔和电化学芯片读数器连接。
2.根据权利要求1所述的电化学芯片，其特征在于每个反应微孔都含有三电极体系 辅助电极、参比电极、工作电极；辅助电极和参比电极分别环绕在工作电极周围。
3.根据权利要求2所述的三电极体系，其特征在于辅助电极、参比电极、工作电极均由金纳米导电材料构成。
4.根据权利要求1所述的电化学芯片，其特征是还包括检测探针，性质是DNA或PNA探针。
专利摘要新型第二代生物芯片一次性电化学芯片，可以用新型纳米材料及生物学分子进行修饰，并与多通道恒电位仪相结合。在每张电化学芯片上都含有16个独立分析微孔，电化学芯片集成度高，易于批量生产，性质稳定，非常适合在医院检验科应用。利用此芯片可以直接对临床尿路常见病原菌进行鉴定及药敏分析，而不用对病原菌进行培养或基因扩增，临床标本检测量小(3-50μL)，准确度高，特异性强，诊断时间短，检测成本低。
文档编号G01N27/27GK202220175SQ20112017543
公开日2012年5月16日 申请日期2011年5月27日 优先权日2011年5月27日
发明者甘先云, 谢国明, 赵朝辉 申请人:甘先云, 谢国明, 赵朝辉