专利名称：肺癌早期血清特异蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种新的肿瘤标志物-肺癌早期血清特异蛋白。本发明还公开了肺癌早期血清特异蛋白在诊断肺癌上的用途。本发明还提供了含肺癌早期血清特异蛋白的诊断试剂盒。
背景技术：
原发性肺支气管癌简称肺癌(Lung cancer)，是原发于各级支气管上皮的常见恶性肿瘤。肺组织细胞在一些因素的刺激下癌变，使肺组织异常增生肿大为其病理特点。咳嗽、胸痛、咯血、胸闷、气急、喘鸣、消瘦及恶病质是其主要临床表现。
肺癌已成为全世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤。据估算，到2002年底，全球将有169400例新增肺癌患者，占所有新增癌症患者的13％；将有154900病人死于肺癌，占所有癌症死亡患者28％，远远高于因乳腺癌、前列腺癌死亡的患者总和。在我国，肺癌的发病率及死亡率同样也逐年呈上升趋势。1963～1965年，上海市市区肺癌标化死亡率男性为28.5/10万，女性为11.1/10万，到1999年男性肺癌标化发病率为53/10万，女性为19/10万。
肺癌包括小细胞癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)(占肺癌的20％左右)、非小细胞癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)(占肺癌的80％左右)和混合型癌。其中，非小细胞癌又分为鳞状上皮细胞癌(Squamous Cell Carcinoma)(25％～30％)、腺癌(Adenocarcinoma)(40％)、大细胞未分化癌(Large-cell UndifferentiatedCarcinoma)(10％～15％)。
外科手术是治疗肺癌的首选方案。但65％的肺癌患者发现并明确诊断时，病情已是晚期，失去了根治手术治疗的时机，约80％的患者在诊断后一年内死亡，因此肺癌的5年生存率仅为16％。这主要是因为目前尚缺乏有效的肺癌早期诊断手段。近年来，随着放射学、病理学及分子生物学技术的蓬勃发展，在肺癌的临床诊断上已取得不少进展。
影像学检测包括X线、电子计算机断层扫描(CT)(包括新发展的CT技术如螺旋CT(Spiral CT，SCT)、高分辨率CT(High Resolution CT，HRCT))、薄层低放射剂量CT(TS-LDSCT)、磁共振断层扫描(MRI)、正电子发射体层扫描(PositronEmission Tomograghy，PET)。
病理学检测包括痰脱落细胞检查、纤维支气管镜检查、经皮肺穿刺活检等。
分子生物学检测根据临床送检标本的不同，所检测的分子生物学指标也有所不同。
胸液标本可检测的分子生物学指标包括水溶性细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、糖链抗原(CA242)、组织多肽抗原(TPA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)。
支气管肺泡灌洗液(BALF)标本可检测的分子生物学指标包括端粒酶及端粒酶hTERT基因表达、p53、p16及K-ras基因的突变情况、T-抗原、组织多肽抗原(TPA)。
痰液脱落细胞标本可检测的分子生物学指标包括痰液脱落细胞p16基因甲基化状态、p16基因外显子2丢失的情况、异质型细胞核核糖核蛋白(heterogeneousnuclear ribonucleoprotein，hnRNP)A2/B1的过表达、hnRNPA2/B1抗体的含量。
组织标本可检测的分子生物学指标包括染色体微卫星标志物的改变、线粒体DNA(mtDNA)突变、脆性组氨酸三联体(FHIT)基因蛋白的表达、死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAP)基因的异常甲基化。
外周血标本可检测的分子生物学指标包括外周血有核细胞角蛋白CK19mRNA的表达水平、LUNX mRNA阳性率。
血清标本可检测的分子生物学指标包括p53抗体、糖类抗原-125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、血清人绒毛膜促性腺激素(HCG)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、甲状腺转录因子(TTF1)、硫酸粘多糖片段(LTA)。
但是，到目前为止所有的相关研究都是以肺癌病人为样本，究竟这些检测指标在肺癌高危人群或普通人群的筛查中效果如何还有待进一步的验证。
此外，由于肺癌从细胞发生癌变到形成临床病灶需10年左右时间，如果能够在人体甚至细胞未出现任何病变前诊断出肺癌前兆，将大大提高肺癌患者的生存期。然而，到目前为止仍缺乏令人满意的有效的肺癌早期检测手段。
因此，本领域迫切需要开发新的有效地检测肺癌，尤其是早期检测肺癌的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种有效的肺癌早期检测方法和试剂盒。
本发明的另一目的是提供相关的肺癌早期血清特异蛋白及其抗体。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的肺癌早期血清特异蛋白，它具有以下特征(a)存在于肺癌病人的血清中，(b)用表面加强的激光解析电离化飞行-时间质谱法(SELDI-TOF-MS)检测时，其分子量为4.2±0.1KD或7.7±0.1KD。
在一优选例中，所述的表面加强的激光解析电离化-飞行时间质谱法检测的条件是使用赛弗吉公司的蛋白质生物系统PBSII，设定的最适激光强度为203和激光灵敏度为9。
在另一优选例中，所述的肺癌早期血清特异蛋白具有选自下组的质谱数据(a)分子量为4.2±0.1KD的肺癌早期血清特异蛋白的质谱数据，以道尔顿表示的平均值801.050，832.950，871.010，896.090，911.020，926.130，958.130，1015.070，1025.700，1032.870，1036.140，1077.710，1092.240，1105.330，1118.050，1121.090，1132.540，1142.450，1161.270，1167.180，1193.320，1206.200，1357.820，1372.300，1384.410，1567.390，1640.070，1666.890，1686.240，1695.800，1754.200，1775.640，1793.590，1798.560，1853.670，1995.160，2416.270，2420.620，2437.180，2504.450，2574.510，2708.560，2820.410，2834.670，2875.850，3099.250，3170.980，3259.490，3522.720，4167.200；(b)分子量为7.7±0.1KD的肺癌早期血清特异蛋白的质谱数据，以道尔顿表示的平均值853.250，881.19，903.25，944.33，958.32，1014.22，1111.060，1125.360，1133.430，1175.590，1504.080，1551.940，1571.290，1660.350，1679.060，1692.800，1700.150，1727.270，1733.250，1745.110，1747.590，1752.930，1766.360，1884.610，1897.110，1964.760，1985.290，
1994.790，2003.080，2049.800，2165.470，2187.450，2419.740，2501.490，2669.560，2914.000。
在另一优选例中，所述的肺癌早期血清特异蛋白具有SEQ ID NO1中第85-120位的氨基酸序列，SEQ ID NO2中第163-226位的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种检测样品中是否存在本发明肺癌早期血清特异蛋白的方法，包括步骤(a)取血清样品；(b)用步骤(a)的血清样品制备弱阴离子交换(WCX2)蛋白质芯片；(c)用表面加强的激光解析电离化-飞行时间质谱法检测，获得血清蛋白质组波谱；(d)确定是否存在分子量为4.2±0.1KD和/或7.7±0.1KD的波峰，存在所述波峰就表示存在所述的肺癌早期血清特异蛋白。
在一优选例中，所述的表面加强的激光解析电离化-飞行时间质谱法检测的条件是使用赛弗吉公司的蛋白质生物系统PBSII，设定的最适激光强度为203和激光灵敏度为9。
在另一优选例中，在步骤(d)中还包括步骤与阴性对照的血清样品的蛋白质组波谱比较，从而确定是否存在分子量为4.2±0.1KD和/或7.7±0.1KD的波峰。
在另一优选例中，步骤(c)中使用赛弗吉公司的蛋白质生物系统PBSII。
在本发明的第三方面，提供了一种检测本发明肺癌早期血清特异蛋白的试剂盒，它包括一容器以及装于容器中的抗所述的肺癌早期血清特异蛋白的抗体。
在本发明的第四方面，提供了一种α-1，3(6)-乙基乙酰糖蛋白β-1，6-N-乙酰基氨基葡糖转移酶V和人类SKI致癌基因的编码蛋白的用途，它们被用于制备检测肺癌的试剂。例如从这两种蛋白分别获得本发明的肺癌早期血清特异蛋白，然后用于制备抗体。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了肺癌病人和健康个体的血清的蛋白质组波谱图。
图2显示了α-1，3(6)-乙基乙酰糖蛋白β-1，6-N-乙酰基氨基葡糖转移酶V的氨基酸序列。
图3显示了人类SKI致癌基因的编码蛋白的氨基酸序列。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次鉴别和分离了与肺癌极其相关的血清特异蛋白。在此基础上完成了本发明。由于血清具有取材方便，无创伤性，并可连续检测的优点，因此从血清中检测肺癌早期生物标志物可以将把肺癌的早期诊断提高到一个新的水平，从而提高肺癌的治愈率和降低肺癌的死亡率。
传统上的蛋白质组学研究的核心技术是二维凝胶电泳分离。转移的斑点进行胶上酶解后，再用MADLI-TOF质谱和多级液质联用质谱进行蛋白的后续鉴定。但是，二维凝胶电泳不能分离分子量特别大或特别小的蛋白，由于样品转移的原因，二维凝胶技术也无法分离痕量的蛋白。最重要的是，它的分离时间长，阻碍了蛋白质组学研究的通量。
近年来，随着多维色谱分离技术的出现，蛋白质组学研究又引入了新方法。它抛弃了二维凝胶电泳，而代之以多维色谱在线联接质谱，实现高通量的蛋白质组学分析。四极杆技术由于分析混合物的能力强，所以已经成功地和质谱接合在一起，实现高通量的分析。自从1993年，美国的Bill Hutchens和Tai-Yung Yip提出了改良的表面加强的激光解析电离化—飞行时间质谱(Surface EnhancedLaser Desorption Ionization-time of flight Mass Spectrum，SELDI-TOF-MS)，基于这一技术的蛋白质芯片系统(ProteinChip Biosystem，Ciphergen，CA，USA)在临床检验上有了大量的应用。
SELDI技术的基本原理是基于特殊芯片的表面加强的吸附。芯片表面的基团有两种化学的(如亲水基团、疏水基团、离子基团)或生物的(如金属离子、抗体、受体、配体)。复杂的生物样品(如细胞或体液)中的特定蛋白质通过不同类型芯片表面被吸附在芯片上。在洗脱去弱结合蛋白质后，加上能量吸收分子(Energyabsorbing molecular，EAM)，利用激光脉冲辐射使被结合的蛋白质解析形成荷电离子，根据不同质荷比，这些离子在真空场中飞行的时间长短不一，由此绘制出一张质谱图，可以直接显示样品中各种蛋白质的分子量、含量等信息。若将它与正常人或某种疾病患者的图谱，甚至基因库中的图谱进行对照，既能发现和捕获新的特异性相关蛋白质。SELDI技术的优点在于可以高通量、高效率地对少量未经预处理的样品进行分析。实验重复性好，敏感性高，价格低廉，适用于临床诊断及大规模人群筛查。
以往，有关蛋白质组学的研究多采用色谱分离纯化、二维电泳、光谱、质谱定量定性等分析化学的研究技术。运用这些手段进行研究所必需的技术条件要求高，仪器昂贵，步骤繁琐，耗时冗长，不适应大规模的人群筛查和临床检验。SELDI技术与MALDI技术(基质辅助的激光解析电离化飞行时间技术，(Matrix AssistedLaser Desorption Ionization-time of flight Mass Spectrum，MALDI-TOF-MS)的根本区别在于在SELDI中，蛋白质先和芯片表面物质结合，再加上基质，因此获得的图谱更单一，重复性好，可用于MALDI所不能进行的蛋白质定量分析。另外，SELDI技术分析的样品不需用液相色谱或气相色谱预先纯化，因此可用于分析复杂的生物样品。与2D-PAGE(二维聚丙烯酰胺凝胶电泳)相比，SELDI技术的优点在于第一，SELDI技术可以分析2D-PAGE无法分析的蛋白质，包括疏水性蛋白质，pI值过高或过低的蛋白质，以及低分子量的蛋白质(MW＜25kd)；第二，在未经处理的样品中，许多被掩盖的低浓度蛋白质可以通过SELDI技术被发现，增加了发现生物标志物的机会；第三，SELDI技术只需少量样品，在较短时间内就可以得到结果，且实验重复性好，适合临床诊断及大规模筛选疾病相关生物标志物。
SELDI技术具有相当高的敏感性和微量的定性分析能力，因此对疾病尤其是癌症的早期发现具有重大的意义，比传统的检测技术先进得多。目前，SELDI技术在发现疾病标志物方面取得了一系列突破性发展。例如，用SELDI技术分析卵巢癌病人血清，发现了五个蛋白质特征峰(质/荷比值为534，989，2111，2251和2465)，诊断的灵敏度为100％，特异性为95％，阳性预测值为94％。用SELDI技术结合金属螯合Ni型蛋白质芯片分析乳腺癌患者血清，发现一个28.3kD的蛋白质(命名为NMP66)，诊断准确率100％，特异性96％。用SELDI技术在前列腺癌病人血清中发现5个特异蛋白质峰，联合检测这些峰可使前列腺癌的诊断敏感性上升为82％，特异性上升为83％。用SELDI技术研究转移性膀胱癌(TCC)病人的尿样，发现了5个可能的新的TCC生物标志物及7个蛋白质组群(分子量为3.3～13.3kD)。联用这些生物标志物和蛋白质组群诊断，可使TCC敏感性提高达87％，特异性为66％。用SELDI技术结合SAX2蛋白质芯片研究结肠癌患者、癌前息肉患者的血清，发现一个特异性表达的13.8kD的蛋白质，从而可对结肠癌作出早期筛查。用SELDI技术结合H4芯片研究肾细胞癌(RCC)组织(包括正常组织、外周癌组织和中心癌组织)，发现RCC组织过度表达11951.2Da及12019.9Da蛋白质。用SAX2芯片发现RCC组织过度表达12027Da蛋白质，但低表达10205Da、10953Da及12738Da蛋白质，从而为RCC病人的检测提供方法。
SELDI技术的问世，提供了一个有效的分析手段。不仅可在临床医学领域用于发现和定义生物标志物，研究药理学，观察治疗预后效果。在本发明确定了肺癌早期血清特异蛋白后，便可联用SELDI技术或其他技术来检测这些蛋白，从而成为肺癌早期诊断和疗效监测的有力手段。
如本文所用，术语“肺癌早期血清特异蛋白”指一种在早期肺癌病人的血清中存在的蛋白，并且用表面加强的激光解析电离化飞行-时间质谱法(SELDI-TOF-MS)检测时，其分子量为4.2±0.1KD或7.7±0.1KD。
肺癌早期血清特异蛋白1、肺癌早期血清特异蛋白2和肺癌早期血清特异蛋白3分别指分子量为4.2±0.1KD、6.3±0.1KD和7.7±0.1KD的肺癌早期血清特异蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
在确定了肺癌早期血清特异蛋白之后，技术人员可用常规方法分离这些肺癌早期血清特异蛋白。此外，还可通过重组技术产生这些蛋白。因此，本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。此外，本发明还包括人肺癌早期血清特异蛋白的片段、衍生物和类似物。
另一方面，本发明还涉及肺癌早期血清特异蛋白的编码序列，含有这些编码序列的载体以及含有所述载体的宿主细胞。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链的或是双链的。
本发明的肺癌早期血清特异蛋白的核苷酸全长序列或其片段通�？梢杂肞CR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的eDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的eDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对肺癌早期血清特异蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人肺癌早期血清特异蛋白或片段。较佳地，指那些能与肺癌早期血清特异蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
抗人肺癌早期血清特异蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测血清标本中的人肺癌早期血清特异蛋白。
一种检测样品中是否存在肺癌早期血清特异蛋白的方法是利用肺癌早期血清特异蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将血清样品与肺癌早期血清特异蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在肺癌早期血清特异蛋白。
肺癌早期血清特异蛋白的多核苷酸也可用于肺癌的早期的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用肺癌早期血清特异蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测肺癌早期血清特异蛋白的转录产物。
本发明还提供了一种检测肿瘤的试剂盒，它含有特异性扩增肺癌早期血清特异蛋白的引物对和/或肺癌早期血清特异蛋白特异性抗体。此外，还可含有特异性探针和/或PCR缓冲液等。
本发明的主要优点在于(a)为肺癌的早期发现、早期诊断提供准确、高效的检测方法。
(b)成本低，比传统诊断方法要便宜得多。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1肺癌早期血清特异蛋白的确定1.1血清的制备对临床病理确诊的肺癌患者及健康对照人员，取5ml外周血，4℃冷藏2h后，血清析出。3000g离心15分钟后取血清，分装后-80℃备用。检测时用NaAc结合液稀40倍释后使用。
1.2芯片的制备取美国赛弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.)WCX2芯片，装在8-孔加样器上备用。
芯片的预平衡每孔加200μl NaAc结合液，室温摇床上孵育5分钟。弃去结合液，重复1次。
加样取稀释后的血清，每孔加200μl，室温摇床上孵育1小时。弃去血清。
洗脱每孔加200μl NaAC洗脱液，室温摇床上孵育5分钟。弃去洗脱液，重复1次。每孔加300μl去离子水，快速洗涤后，将芯片从加样器上拆下于室温干燥。
加能量吸收分子(Energy Absorbed Molecular，EAM)按说明书配置新鲜的SPA(Ciphergen Biosystems，Inc.)，每孔加0.5μl，室温干燥后重复1次。
1.3血清蛋白质组波谱分析将制备好芯片置入美国赛弗吉公司(Ciphergen Biosystems，Inc.)蛋白质生物系统PBS II，选取激光强度为203、激光分辨率为9，使出峰最多并且基线稳定，编写单点分析程序及芯片分析程序，读取血清蛋白质组波谱。
1.4肺癌患者特异性蛋白质峰的获得于同一芯片上制备肺癌患者及健康对照人员样品，在相同条件下读取血清蛋白质组波谱。将两者的蛋白质组波谱进行比较。
结果如图1所示，发现肺癌患者特异性表达4.2KD、7.7KD蛋白质峰。
实施例2利用肺癌早期血清特异蛋白检测肺癌的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度和特异度将52例病例血清样品与42例正常血清样品统一编号，采用盲法进行临床筛选试验，出现上述三个特征峰中一个的即判为病例。实验结果如下
据上表，计算灵敏度即真阳性率为84.62％特异度即真阴性率为83.33％阳性预测值为86.27％阴性预测值为81.40％实施例3肺癌早期血清特异蛋白与肺部其他肿瘤及肺部炎性疾患的关系按实施例1相同的方法，检测恶性间皮瘤(MM)、肺结核、大叶性肺炎等肺部疾患病人的血清的蛋白质组波谱，并进行比较。
结果，在上述疾病的患者血清中，尚未发现同时存在以上三种特异性蛋白。
实施例4肺癌早期血清特异蛋白与其他肿瘤的相关性按实施例1相同的方法，检测肾癌、膀胱癌病人的血清的蛋白质组波谱，并进行比较。
结果，在上述疾病的患者血清中，尚未发现同时存在以上三种特异性蛋白。
实施例5肺癌早期血清特异蛋白的分离和纯化(方法1和方法2)5.1用Q柱分离和纯化将1倍体积血清样品和1.5倍体积9M尿素溶液混合后于自动震荡器上4℃混匀10分钟；再加入2.5倍体积1M尿素溶液混合后于自动震荡器上4℃混匀10分钟。
用1M尿素溶液预平衡Q柱，共2次，每次均室温混匀10分钟，然后快速离心除去上清。
取1倍体积Q柱，加入样品，室温混匀30分钟，然后快速离心除去上清。
加入不同pH的洗脱液洗脱，每次均室温混匀10分钟，然后快速离心收集上清。
最后用有机溶液洗脱，室温混匀10分钟，然后快速离心收集上清。
将分离到的组分用NP20芯片检测。每孔上样1ul，立刻加1ul SPA(CiphergenBiosystems，Inc.)吸打几次后，42℃加热使干燥。再加1ul SPA，干燥后读片。
5.2用S柱分离和纯化将用尿素溶液处理过的样品用0.1mM柠檬酸调pH至3-4。
用不含盐的洗脱液预平衡S柱，共2次，每次均室温混匀5分钟，然后快速离心除去上清。
取0.5倍体积S柱，加入样品，室温混匀30分钟，然后快速离心除去上清。
加入不同盐浓度的洗脱液洗脱，每次均室温混匀5分钟，然后快速离心收集上清。
最后用有机溶液洗脱，室温混匀10分钟，然后快速离心收集上清。
将分离到的组分用NP20芯片检测。每孔上样1ul，立刻加1ul SPA吸打几次后，42℃加热使干燥。加5ul dIH2O，1分钟后吸走，再加1ul SPA，干燥后读片。
实施例6肺癌早期血清特异蛋白的分离和制备6.1将20μl的血清用30μl 8M尿素溶液稀释后于自动振荡器上4℃混匀10分钟。
6.2用300μl 1M尿素溶液预平衡Cibacron Blue柱，共3次，每次均以1000g离心30秒。
6.3将稀释后的血清样品加在Cibacron Blue柱上。
6.4加入50μl 8M尿素溶液稀释后于自动振荡器上4℃混匀15分钟，1000g离心30秒，得到组分1(肺癌早期血清特异蛋白1)。
6.5重复步骤6.4两次，得到组分2(肺癌早期血清特异蛋白2)，组分3(肺癌早期血清特异蛋白3)。
将各组分用1M尿素溶液稀释7倍后，于NP20芯片上分析，获得蛋白质波谱图证实了获得了其分子量分别为4.2KD(肺癌早期血清特异蛋白1)、6.3KD(肺癌早期血清特异蛋白2)和7.7KD(肺癌早期血清特异蛋白3)，证实了分离得到了本发明的三种肺癌早期血清特异蛋白。
实施例7肺癌早期血清特异蛋白的氨基酸序列的测定7.1 16％ Tricn凝胶的制备样品真空抽干，加入30ul上样液，再加入1ul 0.5M DTT，80℃变性10’后上样。
电泳80V跑至浓缩胶处，120V电泳2h至标准品中胰岛素B链到达最底端。
固定固定液(40％甲醇，10％乙酸，50％水)，固定0.5h。
染色染色液(55ml H2O+20ml甲醇+20ml Stainer A)，平衡10分钟后，加入Stainer B)，染过夜。
脱色脱色液(10％乙酸)，脱色至条带出现，放在水中终止。
7.2胶内消化用玻璃毛细吸管切下所需条带，包括病人、对照、空白胶，置于EP管中。
加入200ul Buffer A(40％甲醇，10％乙酸，50％水)，轻微震荡0.5h，共2次，至条带颜色无。
加入200ul Buffer C(50％ACN，100mM NH4HCO3)，轻微震荡0.5h或15’2次。
加入200ul Buffer D(100％ACN)，轻微震荡15’。
吸走上清，42℃加热5’，使ACN挥发干净。
快速离心，加入10ul Typrisn，37℃消化过夜。
3. 3Q-STAR检测用NP20芯片检测。每孔上样1ul，立刻加1ul CHCA吸打几次后，42℃加热使干燥。再加1ul CHCA，干燥后上Q-STAR分析。按仪器操作说明进行TOF-MS和MS/MS分析，将获得的质谱图进行SWISSPORT和NCBrI数据库检索。获得肺癌早期血清特异蛋白1和3的氨基酸序列测定结果。
对于肺癌早期血清特异蛋白4.2±0.1KD的结果如下肽质谱数据(Da，平均值)801.050，832.950，871.010，896.090，911.020，926.130，958.130，1015.070，1025.700，1032.870，1036.140，1077.710，1092.240，1105.330，1118.050，1121.090，1132.540，1142.450，1161.270，1167.180，1193.320，1206.200，1357.820，1372.300，1384.410，1567.390，1640.070，1666.890，1686.240，1695.800，1754.200，1775.640，1793.590，1798.560，1853.670，1995.160，2416.270，2420.620，2437.180，2504.450，2574.510，2708.560，2820.410，2834.670，2875.850，3099.250，3170.980，3259.490，3522.720，4167.200。
SWISSPORT和NCBrI数据库检索结果表明，最匹配的蛋白是Alpha-1，3(6)-MannosylGlycoprotein Beta-1，6-N-Acetyl-Glucosaminyl Transferase V(GNT-V)，中文名称是α-1，3(6)-乙基乙酰糖蛋白β-1，6-N-乙酰基氨基葡糖转移酶V。该蛋白的等电点(pI)为8.9，分子量为84.52kDa。4.2Kd的肺癌早期血清特异蛋白事实上极可能是该蛋白的一个片段(见图2的下划线部分)，即SEQ IDNO1中第85-120位。
对于肺癌早期血清特异蛋白7.7±0.1KD的结果如下肽质谱数据(Da，平均值)853.250，881.19，903.25，944.33，958.32，1014.22，1111.060，1125.360，1133.430，1175.590，1504.080，1551.940，1571.290，1660.350，1679.060，1692.800，1700.150，1727.270，1733.250，1745.110，1747.590，1752.930，1766.360，1884.610，1897.110，1964.760，1985.290，1994.790，2003.080，2049.800，2165.470，2187.450，2419.740，2501.490，2669.560，2914.000。
SWISSPORT或NCBrI数据库检索结果表明，最匹配的蛋白是HUMAN SKIONCOGENE(C-SKI)，中文名称是人类SK工致癌基因。该蛋白等电点(pI)是8.3，分子量是79.99kDa。
7.7Kd的肺癌早期血清特异蛋白事实上极可能是该蛋白的一个片段(见图3的下划线部分)，即SEQ ID NO2中第163-226位。
上述测定结果提示，本发明的肺癌早期血清特异蛋白极可能不是一个完整的蛋白，而是完整蛋白的一个片段，并在肺癌发病过程中因种种原因而发生降解，从而形成特异性的、极具检测用途的短肽。利用本发明的肺癌早期血清特异蛋白可以为早期辅助性诊断肺癌提供较为有价值的参考数据。
实施例8肺癌早期血清特异蛋白抗体的制备8.1肺癌早期血清特异蛋白4.2±0.1KD单克隆抗体的制备。
将分离纯化的肺癌早期血清特异蛋白4.2±0.1KD免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细胞。用溶血噬菌斑分析法选择并分离出能分泌所需抗体的单个淋巴细胞。将单个细胞扩增至1×107个以上，用Quick mRNA Purification Kit提取mRNA。以提取的mRNA为模板，合成cDNA链。以此cDNA为模板，加入鼠抗体重链可变区(VH)通用引物，轻链可变区(VL)通用引物，进行聚合酶链反应，获得扩增的VH基因片段和VL基因片段。将扩增产物行15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离。用glassmilk回收扩增的VH基因片段和VL基因片段，与等摩尔浓度的linker primer Mix混合，进行聚合酶链反应，连接VH和VL。扩增产物分离纯化后，获得特异性单链抗体(ScFV)。此ScFV可用于制备检测所需DNA芯片。
将此扩增产物两端加限制性酶切位点，纯化定量后，连接到pUC19载体上。将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10，经蓝白斑筛选及酶切鉴定，筛选出重组质粒。于96孔板形成单克隆抗体。用ELISA法筛选出效价最高的单抗株，大量制备，并从培养上清中提取所需单抗。此单抗可用于制备检测所需试剂盒。
8.2肺癌早期血清特异蛋白7.7±0.1KD单克隆抗体的制备同8.1。
实施例9肺癌检测试剂盒的制备用96孔板做酶联反应。试剂盒提供了3种针对肺癌早期血清特异蛋白的单抗。96孔板上分别包被这三种单抗。将标准品、空白对照和样品加入96孔板与单抗反应。洗涤后加地高辛标记的单抗，再加入偶联有辣根过氧化物酶的羊抗鼠抗体。加入OPD底物进行显色反应，加入2M H2SO4终止反应。可通过标准曲线来定量样品中三种肺癌早期血清特异蛋白的浓度，并设定一预定的阈值进行临床诊断。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海市疾病预防控制中心<120>肺癌早期血清特异蛋白及其应用<130>045132<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>741<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Ala Leu Phe Thr Pro Trp Lys Leu Ser Ser Gln Lys Leu Gly Phe1 5 10 15Phe Leu Val Thr Phe Gly Phe Ile Trp Gly Met Met Leu Leu His Phe20 25 30Thr Ile Gln Gln Arg Thr Gln Pro Glu Ser Ser Ser Met Leu Arg Glu35 40 45Gln Ile Leu Asp Leu Ser Lys Arg Tyr Ile Lys Ala Leu Ala Glu Glu50 55 60Asn Arg Asn Val Val Asp Gly Pro Tyr Ala Gly Val Met Thr Ala Tyr65 70 75 80Asp Leu Lys Lys Thr Leu Ala Val Leu Leu Asp Asn Ile Leu Gln Arg85 90 95Ile Gly Lys Leu Glu Ser Lys Val Asp Asn Leu Val Val Asn Gly Thr100 105 110Gly Thr Asn Ser Thr Asn Ser Thr Thr Ala Val Pro Ser Leu Val Ala115 120 125Leu Glu Lys Ile Asn ValAla Asp Ile Ile Asn Gly Ala Gln Glu Lys130 135 140Cys Val Leu Pro Pro Met Asp Gly Tyr Pro His Cys Glu Gly Lys Ile145 150 155 160Lys Trp Met Lys Asp Met Trp Arg Ser Asp Pro Cys Tyr Ala Asp Tyr165 170 175Gly Val Asp Gly Ser Thr Cys Ser Phe Phe Ile Tyr Leu Ser Glu Val180 185 190Glu Asn Trp Cys Pro His Leu Pro Trp Arg Ala Lys Asn Pro Tyr Glu195 200 205Glu Ala Asp His Asn Ser Leu Ala Glu Ile Arg Thr Asp Phe Asn Ile210 215 220Leu Tyr Ser Met Met Lys Lys His Glu Glu Phe Arg Trp Met Arg Leu225 230 235 240Arg Ile Arg Arg Met Ala Asp Ala Trp Ile Gln Ala Ile Lys Ser Leu245 250 255
Ala Glu Lys Gln Asn Leu Glu Lys Arg Lys Arg Lys Lys Val Leu Val260 265 270His Leu Gly Leu Leu Thr Lys Glu Ser Gly Phe Lys Ile Ala Glu Thr275 280 285Ala Phe Ser Gly Gly Pro Leu Gly Glu Leu Val Gln Trp Ser Asp Leu290 295 300Ile Thr Ser Leu Tyr Leu Leu Gly His Asp Ile Arg Ile Ser Ala Ser305 310315 320Leu Ala Glu Leu Lys Glu Ile Met Lys Lys Val Val Gly Asn Arg Ser325 330 335Gly Cys Pro Thr Val Gly Asp Arg Ile Val Glu Leu Ile Tyr Ile Asp340 345 350Ile Val Gly Leu Ala Gln Phe Lys Lys Thr Leu Gly Pro Ser Trp Val355 360 365His Tyr Gln Cys Met Leu Arg Val Leu Asp Ser Phe Gly Thr Glu Pro370 375 380Glu Phe Asn His Ala Asn Tyr Ala Gln Ser Lys Gly His Lys Thr Pro385 390 395 400Trp Gly Lys Trp Asn Leu Asn Pro Gln Gln Phe Tyr Thr Met Phe Pro405 410 415His Thr Pro Asp Asn Ser Phe Leu Gly Phe Val Val Glu Gln His Leu420 425 430Asn Ser Ser Asp Ile His His Ile Asn Glu Ile Lys Arg Gln Asn Gln435 440 445Ser Leu ValTyr Gly Lys Val Asp Ser Phe Trp Lys Asn Lys Lys Ile450 455 460Tyr Leu Asp Ile Ile His Thr Tyr Met Glu Val His Ala Thr Val Tyr465 470 475 480Gly Ser Ser Thr Lys Asn Ile Pro Ser Tyr Val Lys Asn His GIy Ile485 490 495Leu Ser Gly Arg Asp Leu Gln Phe Leu Leu Thr Glu Thr Lys Leu Phe500 505 510Val Gly Leu Gly Phe Pro Tyr Glu Gly Pro Ala Pro Leu Glu Ala Ile515 520 525Ala Asn Gly Cys Ala Phe Leu Asn Pro Lys Phe Asn Pro Pro Lys Ser530 535 540Ser Lys Asn Thr Asp Phe Phe Ile Gly Lys Pro Thr Leu Arg Glu Leu545 550 555 560Thr Ser Gln His Pro Tyr Ala Glu Val Phe Ile Gly Arg Pro His Val565 570 575Trp Thr Val Asp Leu Asn Asn Gln Glu Glu Val Glu Asp Ala Val Lys580 585 590Ala Ile Leu Asn Gln Lys Ile Glu Pro Tyr Met Pro Tyr Glu Phe Thr595 600 605Cys Glu Gly Met Leu Gln Arg Ile Asn Ala Phe Ile Glu Lys Gln Asp610 615 620Phe Cys His Gly Gln Val Met Trp Pro Pro Leu Ser Ala Leu Gln Val625 630 635 640Lys Leu Ala Glu Pro Gly Gln Ser Cys Lys Gln Val Cys Gln Glu Ser645 650 655Gln Leu Ile Cys Glu Pro Ser Phe Phe Gln His Leu Asn Lys Asp Lys
660 665 670Asp Met Leu Lys Tyr Lys Val Thr Cys Gln Ser Ser Glu Leu Ala Lys675 680 685Asp Ile Leu Val Pro Ser Phe Asp Pro Lys Asn Lys His Cys Val Phe690 695 700Gln Gly Asp Leu Leu Leu Phe Ser Cys Ala Gly Ala His Pro Arg His705 710 715 720Gln Arg Val Cys Pro Cys Arg Asp Phe Ile Lys Gly Gln Val Ala Leu725 730 735Cys Lys Asp Cys Leu740<210>2<211>728<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Glu Ala Ala Ala Gly Gly Arg Gly Cys Phe Gln Pro His Pro Gly1 5 10 15Leu Gln Lys Thr Leu Glu Gln Phe His Leu Ser Ser Met Ser Ser Leu20 25 30Gly Gly Pro Ala Ala Phe Ser Ala Arg Trp Ala Gln Glu Ala Tyr Lys35 40 45Lys Glu Ser Ala Lys Glu Ala Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Pro Val50 55 60Pro Ala Ala Thr Glu Pro Pro Pro Val Leu His Leu Pro Ala Ile Gln65 70 75 80Pro Pro Pro Pro Val Leu Pro Gly Pro Phe Phe Met Pro Ser Asp Arg85 90 95Ser Thr Glu Arg Cys Glu Thr Val Leu Glu Gly Glu Thr Ile Ser Cys100 105 110Phe Val Val Gly Gly Glu Lys Arg Leu Cys Leu Pro Gln Ile Leu Asn115 120 125Ser Val Leu Arg Asp Phe Ser Leu Gln Gln Ile Asn Ala Val Cys Asp130 135 140Glu Leu His Ile Tyr Cys Ser Arg Cys Thr Ala Asp Gln Leu Glu Ile145 150 155 160Leu Lys Val Met Gly Ile Leu Pro Phe Ser Ala Pro Ser Cys Gly Leu165 170 175Ile Thr Lys Thr Asp Ala Glu Arg Leu Cys Asn Ala Leu Leu Tyr Gly180 185 190Gly Ala Tyr Pro Pro Pro Cys Lys Lys Glu Leu Ala Ala Ser Leu Ala195 200 205Leu Gly Leu Glu Leu Ser Glu Arg Ser Val Arg Val Tyr His Glu Cys210 215 220Phe Gly Lys Cys Lys Gly Leu Leu Val Pro Glu Leu Tyr Ser Ser Pro225 230 235 240Ser Ala Ala Cys Ile Gln Cys Leu Asp Cys Arg Leu Met Tyr Pro Pro245 250 255
His Lys Phe Val Val His Ser His Lys Ala Leu Glu Asn Arg Thr Cys260 265 270His Trp Gly Phe Asp Ser Ala Asn Trp Arg Ala Tyr Ile Leu Leu Ser275 280 285Gln Asp Tyr Thr Gly Lys Glu Glu Gln Ala Arg Leu Gly Arg Cys Leu290 295 300Asp Asp Val Lys Glu Lys Phe Asp Tyr Gly Asn Lys Tyr Lys Arg Arg305 310 315 320Val Pro Arg Val Ser Ser Glu Pro Pro Ala Ser Ile Arg Pro Lys Thr325 330 335Asp Asp Thr Ser Ser Gln Ser Pro Ala Pro Ser Glu Lys Asp Lys Pro340 345 350Ser Ser Trp Leu Arg Thr Leu Ala Gly Ser Ser Asn Lys Ser Leu Gly355 360 365Cys Val His Pro Arg Gln Arg Leu Ser Ala Phe Arg Pro Trp Ser Pro370 375 380Ala ValSer Ala Ser Glu Lys Glu Leu Ser Pro His Leu Pro Ala Leu385 390 395 400Ile Arg Asp Ser Phe Tyr Ser Tyr Lys Ser Phe Glu Thr Ala Val Ala405 410 415Pro Asn Val Ala Leu Ala Pro Pro Ala Gln Gln Lys Val Val Ser Ser420 425 430Pro Pro Cys Ala Ala Ala Val Ser Arg Ala Pro Glu Pro Leu Ala Thr435 440 445Cys Thr Gln Pro Arg Lys Arg Lys Leu Thr Val Asp Thr Pro Gly Ala450 455 460Pro Glu Thr Leu Ala Pro Val Ala Ala Pro Glu Glu Asp Lys Asp Ser465 470 475 480Glu Ala Glu Val Glu Val Glu Ser Arg Glu Glu Phe Thr Ser Ser Leu485 490 495Ser Ser Leu Ser Ser Pro Ser Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ala Lys Asp500 505 510Leu Gly Ser Pro Gly Ala Arg Ala Leu Pro Ser Ala Val Pro Asp Ala515 520 525Ala Ala Pro Ala Asp Ala Pro Ser Gly Leu Glu Ala Glu Leu Glu His530 535 540Leu Arg Gln Ala Leu Glu Gly Gly Leu Asp Thr Lys Glu Ala Lys Glu545 550 555 560Lys Phe Leu His Glu Val Val Lys Met Arg Val Lys Gln Glu Glu Lys565 570 575Leu Ser Ala Ala Leu Gln Ala Lys Arg Ser Leu His Gln Glu Leu Glu580 585 590Phe Leu Arg Val Ala Lys Lys Glu Lys Leu Arg Glu Ala Thr Glu Ala595 600 605Lys Arg Asn Leu Arg Lys Glu Ile Glu Arg Leu Arg Ala Glu Asn Glu610 615 620Lys Lys Met Lys Glu Ala Asn Glu Ser Arg Leu Arg Leu Lys Arg Glu625 630 635 640Leu Glu Gln Ala Arg Gln Ala Arg Val Cys Asp Lys Gly Cys Glu Ala645 650 655Gly Arg Leu Arg Ala Lys Tyr Ser Ala Gln Ile Glu Asp Leu Gln Val
660 665 670Lys Leu Gln His Ala Glu Ala Asp Arg Glu Gln Leu Arg Ala Asp Leu675 680 685Leu Arg Glu Arg Glu Ala Arg Glu His Leu Glu Lys Val Val Lys Glu690 695 700Leu Gln Glu Gln Leu Trp Pro Arg Ala Arg Pro Glu Ala Ala Gly Ser705 710 715 720Glu Gly Ala Ala Glu Leu Glu Pro72权利要求
1.分离的肺癌早期血清特异蛋白，其特征在于，它具有以下特征(a)存在于肺癌病人的血清中，(b)用表面加强的激光解析电离化飞行-时间质谱法检测时，其分子量为4.2±0.1KD或7.7±0.1KD。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的表面加强的激光解析电离化-飞行时间质谱法检测的条件是使用赛弗吉公司的蛋白质生物系统PBS II，设定的最适激光强度为203和激光灵敏度为9。
3.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的肺癌早期血清特异蛋白具有选自下组的质谱数据(a)分子量为4.2±0.1KD的肺癌早期血清特异蛋白的质谱数据，以道尔顿表示的平均值801.050，832.950，871.010，896.090，911.020，926.130，958.130，1015.070，1025.700，1032.870，1036.140，1077.710，1092.240，1105.330，1118.050，1121.090，1132.540，1142.450，1161.270，1167.180，1193.320，1206.200，1357.820，1372.300，1384.410，1567.390，1640.070，1666.890，1686.240，1695.800，1754.200，1775.640，1793.590，1798.560，1853.670，1995.160，2416.270，2420.620，2437.180，2504.450，2574.510，2708.560，2820.410，2834.670，2875.850，3099.250，3170.980，3259.490，3522.720，4167.200；(b)分子量为7.7±0.1KD的肺癌早期血清特异蛋白的质谱数据，以道尔顿表示的平均值853.250，881.19，903.25，944.33，958.32，1014.22，1111.060，1125.360，1133.430，1175.590，1504.080，1551.940，1571.290，1660.350，1679.060，1692.800，1700.150，1727.270，1733.250，1745.110，1747.590，1752.930，1766.360，1884.610，1897.110，1964.760，1985.290，1994.790，2003.080，2049.800，2165.470，2187.450，2419.740，2501.490，2669.560，2914.000。
4.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的肺癌早期血清特异蛋白具有SEQ ID NO1中第85-120位的氨基酸序列，SEQ ID NO2中第163-226位的氨基酸序列。
5.一种检测样品中是否存在权利要求1所述的肺癌早期血清特异蛋白的方法，其特征在于，包括步骤(a)取血清样品；(b)用步骤(a)的血清样品制备弱阴离子交换蛋白质芯片；(c)用表面加强的激光解析电离化-飞行时间质谱法检测，获得血清蛋白质组波谱；(d)确定是否存在分子量为4.2±0.1KD和/或7.7±0.1KD的波峰，存在所述波峰就表示存在所述的肺癌早期血清特异蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的表面加强的激光解析电离化-飞行时间质谱法检测的条件是使用赛弗吉公司的蛋白质生物系统PBS II，设定的最适激光强度为203和激光灵敏度为9。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中还包括步骤与阴性对照的血清样品的蛋白质组波谱比较，从而确定是否存在分子量为4.2±0.1KD和/或7.7±0.1KD的波峰。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(c)中使用赛弗吉公司的蛋白质生物系统PBS II。
9.一种检测权利要求1所述的肺癌早期血清特异蛋白的试剂盒，其特征在于，它包括一容器以及装于容器中的抗权利要求1所述的肺癌早期血清特异蛋白的抗体。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗体的单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种新的肿瘤标志物——肺癌早期血清特异蛋白。本发明还公开了所述蛋白在诊断肺癌上的用途。本发明还提供了含肺癌早期血清特异蛋白的诊断试剂盒。本发明可有效地检测肺癌，尤其是早期检测肺癌。
文档编号G01N33/96GK1733803SQ20041005363
公开日2006年2月15日 申请日期2004年8月11日 优先权日2004年8月11日
发明者张胜年, 卢伟, 王文静, 项翠琴, 陆晔 申请人:上海市疾病预防控制中心
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