专利名称：检测动物鼠疫f1抗原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断技术领域，是一种检测动物鼠疫F1抗 原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒。
背景技术：
鼠疫是我国《传染病防治法》规定的甲类传染病之一，是由鼠疫杆菌引起的一种动 物源性烈性传染病。我国已发现鼠疫自然疫源地12个类型，分布于19个省区、292个县市 旗，面积131万km2。20世纪90年代以来，动物间鼠疫持续处于活跃状态，人间鼠疫连年发 生，鼠疫远距离高速传播的危险性增加。啮齿类是鼠疫的主要宿主动物和传染源，可自然 感染鼠疫动物近200种。我国有专业机构对疫源地内鼠疫进行监测，《全国鼠疫监测方案》 监测动物鼠疫采用分离培养鼠疫菌和反相间接血凝试验检测鼠疫F1抗原；新鲜标本分离 培养鼠疫菌，最快也要24h才能出结果，且分离培养方法只能检测鼠疫菌活菌，不能从使用 过抗菌素、沾染杀菌剂或腐败陈旧的感染过鼠疫的动物标本获得阳性结果；F1抗原是鼠疫 菌的特异性抗原成份，反相间接血凝试验检测鼠疫F1抗原，腐败变质标本常出现非特异性 凝集，有时高滴度非特异性凝集掩盖阳性反应，造成检验结果错误。ELISA间接法检测鼠疫 F1抗原，步骤多，背景显色深。自毙动物是鼠疫监测工作中检测鼠疫菌及其F1抗原的重要 标本，多数己腐败甚至己经干枯，国内外都十分关注检测腐败变质标本中鼠疫F1抗原的准 确、稳定、简便、快速的方法与试剂的研究。
发明内容
本发明提供了一种检测动物鼠疫F1抗原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，克服了 现有鼠疫监测与诊断技术中存在的问题，本发明是通过应用酶联免疫吸附试验夹心法(以 下简称ELISA夹心法)检测各种动物血液、器官、脏器组织浸液中的鼠疫菌的F1抗原的方 法，经多次改进，现己制成具体有效的检测动物鼠疫F1抗原的ELISA夹心法试剂盒，为动物 鼠疫监测和诊断提供了准确、稳定、简便、快速的检测试剂与器具。本发明的技术方案是通过以下措施来实现的一种检测动物鼠疫F1抗原的ELISA 夹心法试剂盒，其包括酶标记抗体1支，抗体包被板1块，甘油.PB液2ml，10 X PBS. T20ml, 鼠疫F1抗原阳性对照2ml，阴性对照2ml，抑制用鼠疫F1抗体1支，显色液A液6ml，显色 液B液6ml，显色终止液6ml ；硫柳汞2ml ；所述酶标记抗体是冻干的用辣根过氧化物酶 标记的鼠疫F1抗体即HRP-FlAb，所述抗体包被板是用鼠疫F1抗体包被酶标板即FlAb板。对上述本发明的技术方案可进一步进行如下的选择或/和优化
上述冻干的用辣根过氧化物酶标记的鼠疫F1抗体即HRP-FlAb按下述方法得到 (1)辣根过氧化物酶的RZ彡3.0即HRP，称取HRP5mg，装入12mmX 120mm试管，加 入蒸溜水1ml，摇动使HRP溶解；加入新鲜配制的1. 3%过碘酸钠水溶液0. 5ml，混勻置 4-10°C30min ；加入浓度按容量/容量的1 %的乙二醇水溶液0. 5ml，室温20_37°C放置30min ；加入纯化的5mg/ml鼠疫F1抗体溶液1ml，混勻；
(2)把试管内的液体装入透析袋，置4-10°C，用0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液透析 12-16h，将0. 5%硼氢化钠溶液0. 2ml加入透析袋，混勻，4_10°C冰箱中静置2h ；
(3)将透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS中透析6_12h，其间换PBS2
次；
(4)将透析袋内的液体移入离心管，3000Xg离心lOmin，上清液为辣根过氧化物酶标 记鼠疫F1抗体即HRP-FlAb溶液原液；取上清液，用酶联免疫吸附试验夹心法测定效价应在 1 6000以上；用浓度按容量/容量的含50%新生小牛血清PBS稀释，分装，冻干，-20°C保 存；
在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。上述鼠疫F1抗体包被板即FlAb板按下述方法得到
(1)包被用试剂包被缓冲液0. 05mol/LpH9. 6的碳酸盐缓冲液； 鼠疫F1抗体包被液包被缓冲液1000ml，加鼠疫F1抗体0. 1-0. 5mg ； 饱和包被液包被缓冲液1000ml，加牛血清白蛋白0. lg或新生小牛血清20ml ； PBS. T :10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 液稀释 10 倍。(2)鼠疫F1抗体包被酶标板测定包被液适用鼠疫F1抗体浓度，每管加包被液 200 u 1 (即微升)，28-37°C 湿盒放置 4h，4_10°C 放置 4_16h ；
(3)饱和包被甩弃酶标板管内的包被液，每管加饱和包被液200iU(即微升)，28-37°C 湿盒放置3h ；甩弃酶标板管内饱和包被液，在吸水纸上拍去管中水珠；
(4)每管加PBS.T200 u 1 (即微升)浸洗，28-37°C湿盒放置3h ；甩弃PBS. T，流水冲洗5 次，在吸水纸上用力拍打酶标板，直到酶标板管内外无可见水珠；
(5)酶标板直立放入37°C温箱，每30min鼓风或开门通风1次，6_12h干燥后取出，酶 标板经上述处理后即为鼠疫F1抗体包被酶标板；
(6)将鼠疫F1抗体板装入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存； 在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。本发明的有益效果是被测物是鼠疫F1抗原而不是鼠疫活菌，被测物可用杀菌剂 杀菌后检测，检测过程安全；被测鼠疫F1抗原经包被抗体和酶标抗体2次特异性选择结合， 提高了检测的特异性；减少了酶标第二抗体反应步骤，降低了非特异性显色，用酶标仪检测 结果，有定量的意义，目测判定结果，为在无电源的野外现场应用创造了方便条件；增加了 抑制试验程序，提高了检测结果的准确性。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可依据本发明的技术方案和实际情况来确定具体 的实施方式。下述实施例中，无特别说明均为常规方法；溶液浓度除注明外均为重量/容量。实施例1 检测动物鼠疫抗原的ELISA夹心法试剂盒制备 一、检测动物鼠疫抗原的ELISA夹心法试剂盒制备
(一)检测动物鼠疫抗原的ELISA夹心法试剂盒的组成8X12管板 冻干
2ml 20ml 2ml 2ml 冻干
A液6mll支B液6mll支 6ml 2ml
块支u瓶uuu 支u 111 11
1.鼠疫F1抗体包被板即FlAb板
2.辣根过氧化物酶标记鼠疫F1抗体即HRP-FlAb
3.甘油 PB
4.10XPBS. T
5.鼠疫F1抗原阳性对照
6.阴性对照
7.抑制用鼠疫F1抗体
8.TMB显色液
9.显色终止液即10%H2S04
10.硫柳汞 (二)各组分的制备方法
1.鼠疫F1抗体包被板(FlAb板)制备
(1)包被用试剂包被缓冲液0. 05mol/LpH9. 6的碳酸盐缓冲液； 鼠疫F1抗体包被液包被缓冲液1000ml，加鼠疫F1抗体0. 1-0. 5mg ； 饱和包被液包被缓冲液1000ml，加牛血清白蛋白0. lg或新生小牛血清20ml ； PBS. T :10XPBS. T 用 0. 9% NaCl 液稀释 10 倍。(2)鼠疫F1抗体包被酶标板测定包被液适用鼠疫F1抗体浓度，每管加包被液 200 u 1 (即微升)，28-37°C 湿盒放置 4h，4_10°C 放置 4_16h ；
(3)饱和包被甩弃酶标板管内的包被液，每管加饱和包被液200iU(即微升)，28-37°C 湿盒放置3h ；甩弃酶标板管内饱和包被液，在吸水纸上拍去管中水珠；
(4)每管加PBS.T200 u 1 (即微升)浸洗，28-37°C湿盒放置3h ；甩弃PBS. T，流水冲洗5 次，在吸水纸上用力拍打酶标板，直到酶标板管内外无可见水珠；
(5)酶标板直立放入37°C温箱，每30min鼓风或开门通风1次，6_12h干燥后取出，酶 标板经上述处理后即为鼠疫F1抗体包被酶标板；
(6)将鼠疫F1抗体板装入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存； 在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
2.制备辣根过氧化物酶标记鼠疫F1抗体(HRP-FlAb)
(1)辣根过氧化物酶的RZ彡3.0即HRP，称取HRP5mg，装入12mmX120mm试管，加 入蒸溜水1ml，摇动使HRP溶解；加入新鲜配制的1. 3%过碘酸钠水溶液0. 5ml，混勻置 4-10°C30min ；加入浓度按容量/容量的1 %的乙二醇水溶液0. 5ml，室温20_37°C放置 30min ；加入纯化的5mg/ml鼠疫F1抗体溶液1ml，混勻；
(2)把试管内的液体装入透析袋，置4-10°C，用0.05mol/LpH9. 6碳酸盐缓冲液透析 12-16h，将0. 5%硼氢化钠溶液0. 2ml加入透析袋，混勻，4_10°C冰箱中静置2h ；
(3)将透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS中透析6_12h，其间换PBS2
次；
(4)将透析袋内的液体移入离心管，3000Xg离心lOmin，上清液为辣根过氧化物酶标 记鼠疫F1抗体即HRP-FlAb溶液原液；取上清液，用酶联免疫吸附试验夹心法测定效价应在 1 6000以上；用浓度按容量/容量的含50%新生小牛血清PBS稀释，分装，冻干，-20°C保存；
在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
3.甘油.PB制备0. lmol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液与等量丙三醇混合。4. 10XPBS. T 制备0. lmol/LNa2HP048 份和 0. lmol/LNaH2P042 份混合，每 900ml，加 吐温-200. 5ml，新生小牛血清100ml，硫柳汞0. lg。5.鼠疫F1抗原阳性对照制备0. 01mol/LpH7. 2PBS100ml，加新生小牛血清2ml，加 硫柳汞0. 05g，加鼠疫F1抗原0. 2mg。6.鼠疫F1抗原阴性对照制备0. 01mol/LpH7. 2PBS100ml，加新生小牛血清2ml，加 硫柳汞0. 05g。7. TMB显色液制备A液0. 2mol/LNa2HP04与0. lmol/L柠檬酸等量混合。B液3. 3-5. 5-四甲基联苯胺50mg，无水乙醇20ml，加水180ml。8.显色终止液制备蒸馏水90ml加硫酸10ml。9. 硫柳汞蒸馏水100ml，加硫柳汞lg, NaCllg。10.抑制用鼠疫F1抗体0. 01mol/LpH7. 2PBS30ml，新生小牛血清15ml，加滴度为 1 8000的鼠疫F1抗体5ml，加硫柳汞0. lg，混勻，分装，每支0. 2ml，冻干。(三)试剂盒质量标准
按说明书配制试剂，并按ELISA夹心法程序检测，检测0. 0lug/ml鼠疫F1抗原液， 吸光度A45(1值> 0. 2 ；检测阴性标本，吸光度A45(1值< 0. 1。实施例2 检测动物鼠疫抗原的ELISA夹心法试剂盒的应用方法 一、ELISA夹心法检测动物鼠疫F1抗原的试剂配制
1. PBS. T :10XPBS. T 用 0. 85%NaCl 稀释 10 倍。2. HRP-F1抗体贮存液每支HRP-F1抗体(冻干剂)加甘油_PB2ml溶解，混勻，_20°C 保存，保质期6个月。HRP-F1抗体应用液HRP_F1抗体贮存液用PBS. T稀释30倍，4°C保存10天。3. F1抗原阳性对照每支F1抗原阳性对照(冻干剂)用PBS. T2ml溶解混勻。4.阴性对照每支阴性对照(冻干剂)用PBS. T2ml溶解混勻。5.抑制用鼠疫F1抗体用PBS. T5ml溶解混勻。6. TMB显色液显色液A液和B液等量混合，避光保存4h内使用。二、标本准备
1.组织块新鲜、腐败或干枯的脏器、肌肉组织块，放入乳钵内剪碎，研磨成糊状，按组 织块重量的2倍加生理盐水，继续研磨制成混悬液。2.骨头用纱布包裹骨头，用剪刀或骨钳剪断骨头的两端，采取红色骨髓；如骨髓 干枯，可剪断骨头的一端，用注射器注入少量生理盐水，30min后，反复吹吸数次后吸出，或 将另一端打开，直接冲入试管内；也可用纱布包裹骨头，砸碎骨头红髓丰富的部位，2倍容 量的生理盐水中浸泡30min，反复冲洗，收集混悬液。3.混悬液、浸出液、心血混悬液2000Xg离心5min或静置后取上清液，按1ml加 硫柳汞或升汞盐水0.1ml混勻。紧急情况下，可用注射器针头插入棉球抽滤。4.试管封口后，用消毒液浸泡消毒试管外部。
三、ELISA夹心法检测鼠疫F1抗原初筛(定性)试验
1.排列FlAb板小管条(兰头)根据标本和阳性、阴性对照的数量，把小管安装在编号 的酶标板支架上，每管加PBS. T50 ill。2.按登记编号位置每管加1份标本50 U 1 (即微升)，防止标本相互污染，置于湿 盒或塑料袋内。适宜温度为28°C，静置90min。(20_40°C均可进行，低于28°C时，温度每降低1°C延 长反应时间2min，可获得与适宜温度基本相同的结果。)甩去酶标板管内的液体。3.流水冲洗酶标板使每管都注满水，甩去水，再注满水，再甩去水，如此反复冲洗 5次；管口向下，在吸水纸、滤纸上拍去酶标板表面水珠。(野外可用水壶、洗瓶装煮沸冷却 澄清的泉水、河水冲洗酶标板。)
4.每小管加HRP-FlAb应用液lOOyl (即微升)，酶标板置于湿盒或塑料袋内；反应温 度同三.2，反应时间60min。冲洗方法同3。5.显色每小管加TMB显色液的A液和B液各50 yl，反应15min，阳性反应呈兰 色，阴性反应为无色或显色很淡。6.终止显色加终止液(10% H2S04) 50 yl，TMB显色液兰色变为黄色，阴性仍为无 色或颜色很淡。7.记录试验结果目测平持酶标板，距白色背景150_200mm，从板的正上方向下 观察。阴性(一)无色或颜色很淡；阳性(+ )颜色明显可见，(++)浅黄色，(+++)与阳性 对照颜色相同，(++++)深黄色比阳性对照颜色深。酶标仪测定TMB显色液测0DA45(1值，阴性标本为对照，标本0D值> 0. 20为阳性。8.登记检验结果
四、复试(ELISA夹心法检测鼠疫抗原酶标滴度(定量)试验与抑制试验) 检测鼠疫F1抗原初筛显色(+ )、(++)、(+++)、(++++)标本，全部要做检测反应滴度试验 和抑制试验。(一 )检测鼠疫抗原反应滴度(定量)试验
1.初筛阳性标本，按(+ )、(++)、(+++)、(++++)分别排列，并详细记录。排列小管根据 标本数和反应强弱排列小管，每管加PBS. T100 u 1 (即微升)；一般(+)，(++)用4个小管， (+++)用6-8个小管，(++++)用8-12个小管。(++++)的标本可稀释16倍或32倍再复试。2.稀释标本每排首管加1份待检标本100 yl (即微升)，吹吸3次，移入第2管， 如此连续2倍稀释到最末管；阳性对照标本同步稀释，置于湿盒或塑料袋内。3-8.操作步骤同初筛试验。(二)检测鼠疫抗原抑制试验
初筛阳性标本，都要做抑制试验，抑制试验和测反应滴度试验同步进行。抑制试验与测 反应滴度试验的不同之处为PBS. T含滴度为1 :64-1 128鼠疫F1抗体。(三)观测登记检验结果 1.观测登记检验结果
目测阳性(+ )颜色明显可见的最高稀释度为阳性反应滴度终点。酶标仪测定标本0D值> 0. 20的最高稀释度为阳性反应滴度终点。2.检测滴度试验、抑制试验阳性反应滴度，用1 :n表示，n为标本阳性反应的稀释倍数。 3.抑制试验反应滴度比检测滴度试验阳性反应滴度低2个或2个以上滴度为检测 鼠疫F1抗原试验阳性。
权利要求
一种检测动物鼠疫F1抗原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，其特征在于包括酶标记抗体1支，抗体包被板1块，甘油.PB液2ml，10×PBS.T 20ml，鼠疫F1抗原阳性对照2 ml，阴性对照2 ml，抑制用鼠疫F1抗体1支，显色液A液6 ml，显色液B液6 ml，显色终止液6 ml；1％硫柳汞2 ml；所述酶标记抗体是冻干的用辣根过氧化物酶标记的鼠疫F1抗体即HRP-F1Ab，所述抗体包被板是用鼠疫F1抗体包被酶标板即F1Ab板。
2.根据权利要求1所述的检测动物鼠疫Fl抗原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，其 特征在于用辣根过氧化物酶标记的鼠疫Fl抗体即HRP-FlAb按下述方法得到(1)辣根过氧化物酶的RZ彡3.0即HRP，称取HRP5mg，装入12mmX120mm试管，力口 入蒸溜水1ml，摇动使HRP溶解；加入新鲜配制的1. 3 %过碘酸钠水溶液0. 5ml，混勻置 4-10°C30min ；加入浓度按容量/容量的1 %的乙二醇水溶液0. 5ml，室温20_37°C放置 30min ；加入纯化的5mg/ml鼠疫Fl抗体溶液1ml，混勻；(2)把试管内的液体装入透析袋，置4-10°C，用0.05mol/LpH9. 6碳酸盐缓冲液透析 12-16h，将0. 5%硼氢化钠溶液0. 2ml加入透析袋，混勻，4_10°C冰箱中静置2h ；(3)将透析袋移入0.01mol/LpH7. 2磷酸盐缓冲液即PBS中透析6_12h，其间换PBS2次；(4)将透析袋内的液体移入离心管，3000Xg离心lOmin，上清液为辣根过氧化物酶标 记鼠疫Fl抗体即HRP-FlAb溶液原液；取上清液，用酶联免疫吸附试验夹心法测定效价应在 1 6000以上；用浓度按容量/容量的含50%新生小牛血清PBS稀释，分装，冻干，-20°C保 存；在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
3.根据权利要求1所述的检测动物鼠疫Fl抗原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，其 特征在于鼠疫Fl抗体包被板即FlAb板按下述方法得到(1)包被用试剂包被缓冲液0.05mol/LpH9. 6的碳酸盐缓冲液；鼠疫Fl抗体包被液包被缓冲液1000ml，加鼠疫Fl抗体0. 1-0. 5mg ；饱和包被液包被缓冲液1000ml，加牛血清白蛋白0. Ig或新生小牛血清20ml ；PBS. T 10 X PBS. T 用 0. 9% NaCl 液稀释 10 倍；(2)鼠疫Fl抗体包被酶标板测定包被液适用鼠疫Fl抗体浓度，每管加包被液200微 升，28-37°C 湿盒放置 4h，4-10°C 放置 4_16h ；(3)饱和包被甩弃酶标板管内的包被液，每管加饱和包被液200微升，28-37°C湿盒放 置3h ；甩弃酶标板管内饱和包被液，在吸水纸上拍去管中水珠；(4)每管加PBS.T200微升浸洗，28-37°C湿盒放置3h ；甩弃PBS. T，流水冲洗5次，在吸 水纸上用力拍打酶标板，直到酶标板管内外无可见水珠；(5)酶标板直立放入37°C温箱，每30min鼓风或开门通风1次，6_12h干燥后取出，酶 标板经上述处理后即为鼠疫Fl抗体包被酶标板；(6)将鼠疫Fl抗体板装入塑料袋，封口；4-10°C干燥保存；在上述方法中溶液浓度除注明外均为重量/容量。
全文摘要
本发明涉及动物鼠疫疫情监测与鼠疫诊断技术领域，是一种检测动物鼠疫F1抗原的酶联免疫吸附试验夹心法试剂盒，其包括酶标记抗体1支，抗体包被板1块，甘油.PB液2ml，10×PBS.T20ml，鼠疫F1抗原阳性对照2ml，阴性对照2ml，抑制用鼠疫F1抗体5ml，TMB显色液A液6ml，TMB显色液B液6ml，显色终止液6ml；1％硫柳汞2ml。其有益效果被测物是鼠疫F1抗原，可用杀菌剂杀菌后检测，过程安全；被测鼠疫F1抗原经包被抗体和酶标抗体2次特异性选择结合，提高了检测的特异性；减少了酶标第二抗体酶标步骤，降低了非特异性显色；用酶标仪检测结果，有定量意义；目测判定结果，为无电源的野外现场创造了方便条件；增加了抑制试验程序，提高了检测结果的准确性。
文档编号G01N33/569GK101839915SQ20101020199
公开日2010年9月22日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者唐建国, 徐兵, 热娜.吐尔地, 蒋卫, 闫化奎, 雷刚 申请人:新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心
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