专利名称：大菱鲆抗体快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型属于水产动物免疫学检测技术领域，具体涉及一种大菱鲆抗体快速检测试纸。
背景技术：
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国引进的海水养殖名贵鱼种，已成为我国北方工厂化养殖的主要种类。然而随着其养殖规模的迅速扩大，养殖密度的不断增加，大菱鲆疾病问题日渐突出，大规模死亡现象频繁发生。目前，在越来越高的环�：褪称方】蛋踩囊笙拢砸呙绲任饕淼男滦筒『Ψ乐问侄蔚玫焦惴悍⒄�。在十一五期间，鳗弧菌基因缺失减毒活疫苗、海水鱼哈维氏弧菌病的重组外膜蛋白疫苗转基因生物安全评价中间试验已获得了农业部的批准，此外还构建了迟缓爱德华氏菌基因缺失减毒活疫苗等。在特定品种大菱鲆的养殖中，鳗弧菌疫苗、 迟缓爱德华氏菌疫苗等已经得到了广泛的研究和应用。如今，在以雷霁霖院士为首席科学家的“全国鲆鲽类产业技术体系”支持下，大菱鲆弧菌相关疫苗有望被国家批准成为新型防治药物。这种情况下，对抗体的检测就显得越来越必要。通过对抗体水平的检测，不仅可以对疾病进行早期预警，防治其暴发和流行，也可以实时监测动物接种疫苗后体内抗体的应答变化，对其免疫效果进行评定，及时制定有效的免疫程序，提高疫苗应用效率，降低病害损失。但是，现有的鱼类抗体检测方法诸如凝集试验、琼脂扩散试验、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、免疫荧光等，不仅成本高、费时费力且需专业人员操作，不易推广普及，难以解决现场快速检测问题。因此，亟需建立大菱鲆特异性抗体的快速灵敏、简便易行、易于推广应用的现场快速检测方法。
发明内容本发明的目的是提供一种大菱鲆抗体快速检测试纸，即一种可以快速、准确的进行现场检测大菱鲆特异性抗体的试纸，以弥补现有技术的不足。本实用新型的试纸，包括有底座、试纸芯和覆盖试纸芯的面板，其中试纸芯安装在底座的固定槽内，面板上设有加样孔和结果显示窗，试纸芯由样品垫、带有金标抗体的金标物结合垫、反应膜和吸水垫依次相互搭接粘贴在衬板上制成；且样品垫的位置对应着面板的加样孔，反应膜对应着面板的结果显示窗。其中样品垫为玻璃纤维棉，金标物结合垫为吸附金标抗体的玻璃纤维棉，反应膜为印制有隐形的检测线和对照线的硝酸纤维素膜，检测线和对照线平行排列，且检测线靠近面板的加样孔侧；吸水垫为吸水能力较强的吸水滤纸，衬板为硬质塑胶条。金标物结合垫上的金标抗体为胶体金标记的兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗，反应膜上的检测线印记的是牛血清白蛋白(BSA)，反应膜上的对照线印记的是葡萄球菌A蛋白 (SPA)，对照线和检测线平行排列，相距0. 5cm。检测线，靠近加样孔侧，面板上印有字母T ； 对照线，在远离加样孔侧，面板上印有字母C。[0008]本实用新型的试纸制作简单，特异性强，敏感性高，与ELISA检测水平相当，使用本实用新型的试纸，无需其它试剂和仪器，可现场操作；5分钟内即可肉眼判定结果，简单、 快速、形象、直观、时效性强，有效的节省了检测费用，适用范围广，易于推广应用。另外，以某种抗原替换试纸中的BSA即可制备成相应的抗体检测试纸。
图1 本实用新型试纸芯各部分组装侧面结构示意图。图2 本实用新型试纸芯组装后侧视结构示意图。图3 本实用新型试纸芯俯视结构示意图。图4 本实用新型的检测试纸面板结构俯视图。图5 本实用新型的检测试纸底座结构示意图。其中1、衬板2、样品垫3、金标物结合垫4、金标抗体5、检测线6、对照线7、反应膜8、吸水垫9、加样孔10、结果显示窗11、面板12、底座13、固定槽
具体实施方式
制备本实用新型的大菱鲆特异性抗体快速检测试纸之前，已根据需要分离纯化了大菱鲆血清免疫球蛋白，然后制备其多克隆抗体(多抗)，并以胶体金标记多抗；然后将金标多抗与市售BSA、SPA分别组装到试纸芯的各个部位，并安装到塑料壳底座的固定槽中， 最后和面板嵌合在一起制成本实用新型的试纸，下面进行具体描述一、本实用新型的试纸结构及制备过程1、底座12和面板11的加工用软塑或其他合适的材料来制备底座12，其长度为5 10cm，宽为2 3cm，在底座12上有一个固定槽13，用于安装固定试纸芯(图5)。面板11用来覆盖住底座12和试纸芯，其上设有加样孔9和结果显示窗10，在使用的时候为了更好的确定检测线5和对照线6的位置，在结果显示窗10的两边分别印有字母 T和C，其中T靠近检测线5端；C靠近对照线6 —侧(图4)。2、试纸芯的制作试纸芯由样品垫2、带有金标抗体4的金标物结合垫3、反应膜7和吸水垫8依次相互搭接粘贴在衬板1上制成；且样品垫2位置对应着面板11的加样孔9，反应膜7对应着面板11的结果显示窗10。下面分别对试纸芯的各个组分的制备进行描述(图1-3)1)金标物结合垫3的制备采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，其颗粒直径为20nm，用0. lmol/L K2CO3调胶体金溶液的PH值为8.5，置2-8°C保存备用。按照ImL胶体金溶液中加入0.3mg多抗的比例， 进行标记Ih后，加入猪血清IgG至终浓度为10 %，在4°C、15000rpm/min条件下离心30min， 用20mM四硼酸钠溶解沉淀，获得胶体金标记的金标抗体4。然后将玻璃纤维棉用正常兔血清完全浸润以降低其非特异吸附性，43°C干燥3h 后，在干燥器内室温保存备用。将胶体金标记的金标抗体4用X-only单向喷点仪均勻喷洒于已处理过的玻璃纤维棉上，43°C干燥3h后，加入干燥剂密封保存于干燥的室温环境，即制成带有金标抗体4的金标物结合垫3。[0025]2)反应膜7的制备将硝酸纤维素膜放于X-only单向喷点仪平台上，将BSA(4mg/mL)放于贮存池A， SPA (0. 8mg/mL)放于贮存池B。将硝酸纤维素膜展平，并放上压条，开机后将BSA和SPA分别点射于硝酸纤维素膜上形成检测线5与对照线6，两线相距0. 5cm，位于膜的中间，距膜的边距分别为0. 75cm。置室温自然干燥后，密封室温保存备用，即制成了带有检测线5和对照线6的反应膜7。3、试纸的组装将反应膜7、金标物结合垫3、样品垫2及吸水垫8按照从左至右的顺序组装在不干胶衬板1上。将组装的半成品试纸放入CM4000切割机槽内，进行切割制成试纸芯，然后将试纸芯固定在底座12的固定槽13内，再用面板11包装后制备成品试纸，注明生产日期， 与干燥剂一起密封，保存备用(图1-3)。本实用新型的金标物结合垫3上的金标抗4体为胶体金标记的兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗，反应膜7上的抗原检测线5为牛血清白蛋白(BSA)，反应膜7上的对照线6为葡萄球菌A蛋白(SPA)。另外，以某种抗原替换试纸中的BSA即可制备成相应的抗体检测试纸。下面对兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗的制备过程进行描述。1)大菱鲆血清免疫球蛋白的分离纯化取正常大菱鲆50尾，尾静脉采血，室温放置Ih后，4°C过夜，次日离心(5000r/min， 30min,4°C )分离血清，分装并保存于-70°C冰箱待用。盐析法对大菱鲆血清免疫球蛋白(IgM)进行粗提，具体操作步骤如下大菱鲆血清以等体积0. 01mol/L(pH = 7. 4)磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后，在0. 01mol/L(pH = 5. 4) 磷酸缓冲液(PB)中4°C透析，离心(3000r/min，30min，4°C )收集沉淀后，将沉淀溶解于 0. lmol/L(pH = 5. 4)PB中后继续按上述方法透析，再次离心收集沉淀后并将其溶解于 0. lmol/L (pH = 8. 6) PB 中，过 S印hadex-200 凝胶柱(80cmX 1.5cm)进一步纯化，以 0. Imol/ L(pH = 8. 6) PB为洗脱缓冲液，SDS-PAGE检验，收集纯度较高的样品。S印hadex-200凝胶柱分离的样品合并浓缩后，再过POROS 20HQ(AppliedBiosystems, USA)阴离子交换柱(100mmX4. 6mm)，以 0. 05mol/L(pH = 8. 5) Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，NaCl浓度梯度为0至0. 5mol/L,流速度为5mL/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰，浓缩后以SDS-PAGE检验，收集纯度高的样品，测定蛋白质含量 (Nano Drop, ND-1000Spectrophotometer, USA)后于 _20°C保存备用。2)大菱鲆免疫球蛋白多抗的制备将纯化的大菱鲆血清IgM与等体积的弗氏完全佐剂(Pierce，USA)混勻乳化后，对新西兰白兔背部皮下多点注射，每只兔子注射ImL(含0. Img IgM)(首免)。首免21d后， 将IgM与弗氏不完全佐剂(Pierce，USA)等比混勻乳化后，进行加强免疫，每只兔子注射 ImL(含0.2mg IgM) (二免)。二免21d后以相同剂量和方法再次加强免疫(三免)。三免 21d后，以2mL(含0.3mg IgM)的量再次加强免疫(四免)。四免21d后通过心脏取血，并分离血清，保存于-70°C冰箱待用。采用辛酸-硫酸铵盐析法纯化获得的多抗，即兔IgG，透析后测定其效价水平及蛋白质含量，分装并-20°C冻存备用。二、试纸工作原理、程序及结果判定[0038]应用试纸进行检测时，将待检样品滴入样品垫2区，在毛细作用下，滴入的样品会沿着试纸芯一直迁移扩散到吸水垫8处。当检测样品为阳性时(含抗BSA的IgMjP BSA-IgM)，待检测的BSA-IgM会与金标物结合垫3上的金标抗体4 (兔抗IgM)结合形成胶体金抗体复合物，此复合物会与反应膜7上检测线5的BSA结合并在检测线5区形成肉眼可见的胶体金红色条带。如果检测线5不显红色，则说明检测样品为阴性。无论检测样品是阳性还是阴性，金标抗体4都会与反应膜上对照线6处的SPA结合并显红色条带；对照线 6如果不显色，说明试纸无效。下面对本实用新型试纸的使用过程及检测特异性进行描述试纸检测特异性分析将制备的大菱鲆抗BSA血清以生理盐水10倍稀释后作为阳性血清，正常大菱鲆血清以生理盐水10倍稀释后作为阴性血清，生理盐水作为对照。取 100 μ L样品滴加在试纸的加样孔9内，5min内可肉眼观察结果，同时用BioDot-TSR 3000 读条仪对检测线5进行读值，量化结果(表1)。结果表明，以组装后的试纸条检验所制备的大菱鲆抗BSA血清，从大菱鲆免疫第四周开始试纸检测出现阳性反应，且试纸条的颜色反应随着大菱鲆免疫时间的延长而显色逐渐加深，其变化趋势与间接ELISA法检测结果一致；其中第十周的显色与第九周比较略弱，这与ELISA法检测时第十周的显色相对光密度读值与第九周比较略低的结果相一致。试纸条与正常大菱鲆血清和生理盐水均呈阴性反应。试纸检测灵敏度分析将大菱鲆抗BSA血清(免疫后第9周样品)从1 100开始以生理盐水倍比稀释检验试纸的检测灵敏度，正常大菱鲆血清以生理盐水100倍稀释后作为阴性血清，生理盐水作为对照。取100 μ L样品滴加在试纸的加样孔9内，5min内可肉眼观察结果，同时用BioDot-TSR 3000读条仪对检测线5进行读值，量化结果(表1)。结果表明组装后的试纸条与1 100开始倍比稀释的大菱鲆抗BSA血清反应，随着稀释倍数的增加，肉眼可见试纸条的颜色反应逐渐减弱。以大菱鲆免疫后第九周血清为例，当血清稀释到1 25600时显色为弱阳性，继续稀释则无肉眼可见显色反应，试纸条检测结果与间接 ELISA法检测结果相当。试纸条与正常大菱鲆血清和生理盐水均呈阴性反应。表1检测不同样品后试纸条检测线的相对光密度值
6各免疫周血清 Serum in different week相对光密度值 ROD第9周血清稀释 Dilution of serum in week 9相对光密度值 RODWO0.821/100120.48Wl0.861/200103.98W20.791/400101.05W36.111/80063.57W418.041/160053.81W559.321/320045.98W6107.831/640039.68W7122.241/1280019.98W8142.391/2560010.97W9176.331/512006.22WlO152.65阴性血清1.39对照组0.77对照组0.93 检测结果表明本实用新型制备检测试纸的特异性和敏感性与ELISA法相当。
权利要求1.一种大菱鲆抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的试纸包括有底座(12)、试纸芯和覆盖试纸芯的面板(11)，其中试纸芯安装在底座(12)的固定槽(13)内，面板(11)上设有加样孔(9)和结果显示窗(10)，试纸芯由样品垫(2)、带有金标抗体(4)的金标物结合垫 (3)、反应膜(7)和吸水垫(8)依次相互搭接粘贴在衬板(1)上制成；且样品垫(2)的位置对应着面板(11)的加样孔(9)，反应膜(7)对应着面板(11)的结果显示窗(10)。
2.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于上述样品垫(2)为玻璃纤维棉。
3.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于上述的金标物结合垫(3)为玻璃纤维棉。
4.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于上述的反应膜(7)为印制有隐形的检测线(5)和对照线(6)的硝酸纤维素膜。
5.如权利要求4所述的检测试纸，其特征在于上述的检测线(5)和对照线(6)平行排列，且检测线(5)靠近面板(11)的加样孔(9)侧。
6.如权利要求4或5所述的检测试纸，其特征在于上述的检测线(5)为牛血清白蛋白BSA。
7.如权利要求4或5所述的检测试纸，其特征在于上述的对照线(6)为葡萄球菌A蛋白 SPA。
8.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于上述的金标抗体(4)为胶体金标记的兔抗大菱鲆免疫球蛋白多抗。
9.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于上述的吸水垫(8)为吸水滤纸。
10.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于上述的衬板(1)为硬质塑胶条。
专利摘要本实用新型涉及一种大菱鲆抗体快速检测试纸，包括有底座、试纸芯和覆盖试纸芯的面板，其中试纸芯安装在底座的固定槽内，面板上设有加样孔和结果显示窗，试纸芯由样品垫、带有金标抗体的金标物结合垫、反应膜和吸水垫依次相互搭接粘贴在衬板上制成；且样品垫的位置对应着面板的加样孔，反应膜对应着面板的结果显示窗。本实用新型的试纸制作简单，特异性强，敏感性高，与ELISA检测水平相当，使用本实用新型的试纸，无需其它试剂和仪器，可现场操作；5分钟内即可肉眼判定结果，简单、快速、形象、直观、时效性强，有效的节省了检测费用，适用范围广，易于推广应用。另外，以某种抗原替换试纸中的BSA即可制备成相应的抗体检测试纸。
文档编号G01N33/558GK202033366SQ20112013159
公开日2011年11月9日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者刘滨, 孟振, 张改平, 李青梅, 王蔚芳, 郭军庆, 雷霁霖 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所
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