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专利名称：一种用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及细菌内毒素的鲎试验检测方法，特别提供了一种用于鲎试验法的调节并指示样品pH的缓冲液。
背景技术：
细菌内毒素(Bacterial Endotoxin)是革兰氏阴性细菌所产生的具有各种生物活性的大分子物质，其主要化学成分为脂多糖(LPS)。内毒素是注射剂药品(原料等)中的主要污染物质。
目前，细菌内毒素的检测方法主要有家兔试验法、鲎试验法。鲎试验法是利用鲎试剂与内毒素发生凝集反应的机理，以定性(凝胶法)或定量(动态浊度法)的方式检测药品及机体血液中感染的细菌内毒素的一种体外检测方法。通常情况下，在一定的pH范围内(6.5-8.5)，鲎试验法可以正常测定，但是一旦超出该范围，测定结果会出现假阳性或假阴性。对于含碳酸氢钠的样品、特别是药品生产过程中的中间产品，往往含有不同种类的缓冲盐，pH往往低于6.5(如醋酸盐)或高于8.5(碳酸盐)，这就需要不断稀释并用无内毒素的酸、碱来调节pH，并用pH试纸或pH计来监测。这种过程非常繁复，并且难以精确控制，特别是容易引入内毒素的污染，因此急需一种用来稀释样品，同时可以调节并指示样品pH的缓冲液。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于细菌内毒素鲎试验检测法，可以用来稀释样品，同时可以调节并指示样品pH的缓冲液。
本发明提供了一种用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，其特征在于所述缓冲液为含有酚红的Tris-HCl缓冲液，酚红的重量浓度为0.005-0.1％。
本发明用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液中，所述Tris-HCl缓冲液，Tris浓度最好为30-500mM，pH在7-8.5。
本发明还提供了上述用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液的制备方法，其特征在于将酚红和Tris盐称重后，在150-200度干烤1-5小时；再加入无内毒素的水，用浓盐酸调节缓冲液的pH至所需要的值(通常为7-8)；高压消毒无菌保存或冷冻保存。
本发明用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，在pH为6.8-8.2的范围呈粉红色，可以稀释样品，同时调节样品的pH值在适当的范围内，以使内毒素的测定在稳定的pH内进行。本发明用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，在鲎试验法测定内毒素的实验中，用于定性法——凝胶法时，对无内毒素的阴性对照的测定无影响，对添加内毒素的阳性对照显现出阳性特有的凝胶反应；用于定量法——动态浊度法时，对无内毒素的阴性对照的测定无影响，对添加内毒素的阳性对照内毒素的回收率在50-200％之间。即 本发明用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，在两种内毒素测定法中对内毒素的测定无影响，均符合鲎试验法测定的规定。
具体实施例方式实施例1.用于内毒素测定的标准曲线在内毒素测定仪上，基于标准曲线LogT(OD0.02)＝a+b Log(c)，采用标准内毒素浓度0.22-100EU/ml，与0.06EU/ml灵敏度的鲎试剂进行试验，得到相应的标准曲线为LogT(OD0.02)＝-0.4129Log(c)+3.2038，其中T(OD0.02)为特征反应时间，c为内毒素浓度。
实施例2.含酚红的Tris-HCl缓冲液的配制1将0.005克酚红、0.363克Tris盐称重后置于干净的玻璃瓶中，干烤200度1小时，以消除其中的内毒素；加入100毫升无内毒素的水，用浓盐酸调节pH至7.0，高压消毒无菌保存或冷冻保存备用。
实施例3.含酚红的Tris-HCl缓冲液的配制2将0.1克酚红、6.05克Tris盐称重后置于玻璃瓶中，干烤150度5小时，以消除其中的内毒素；加入100毫升无内毒素的水，用浓盐酸调节pH至8.5，高压消毒无菌保存或冷冻保存备用。
实施例4.酚红的浓度实验配制250mM pH7.6的Tris-HCl缓冲液，分别含酚红的浓度为0、0.005、0.01、0.05、0.1％，进行内毒素的测定实验。不加内毒素的阴性对照结果皆为阴性。加入相同浓度的内毒素，在内毒素测定仪上测得的内毒素浓度分别为73.0、95.6、89.2、110.2、95.6EU/ml，内毒素的回收率分别为100、131、122、151、131％，符合回收率在50-200％之间的规定。含酚红的缓冲液，用酸碱调节其pH值，当pH小于6.8时，呈黄色；当pH大于8.2时，呈红色；当pH在6.8-8.2之间时，呈橙红色。
实施例5.Tris盐浓度实验配制含酚红浓度为0.01％，pH7.5的Tris-HCl缓冲液，Tris盐浓度分别为30、63、125、250、500mM，进行内毒素的测定实验。不加内毒素的阴性对照结果皆为阴性。分别加入相同浓度的内毒素3.8EU/ml，在内毒素测定仪上测得的内毒素浓度分别为3.8、6.45、4.98、5.35、6.4EU/ml，内毒素的回收率分别为100、170、131、141、168％，符合回收率在50-200％之间的规定。含酚红的缓冲液，用酸碱调节其pH值，当pH小于6.8时，呈黄色；当pH大于8.2时，呈红色；当pH在6.8-8.2之间时，呈橙红色。
实施例6.Tris-HCl缓冲液的pH实验配制含酚红浓度为0.01％，250mM的Tris-HCl缓冲液，pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5，进行内毒素的测定实验。不加内毒素的阴性对照结果皆为阴性。分别加入相同浓度4.2EU/ml的内毒素参照品，在内毒素测定仪上测得的内毒素浓度分别为3.85、5.35、5.76、4.81EU/ml，内毒素的回收率分别为92、139、150、125％，符合回收率在50-200％之间的规定。含酚红的缓冲液，用浓酸碱调节其pH值，当pH小于6.8时，呈黄色；当pH大于8.2时，呈红色；当pH在6.8-8.2之间时，呈橙红色。
实施例7.醋酸缓冲液中内毒素的测定向含0.5％人血清白蛋白的样品(溶解在20mMpH3.8的醋酸缓冲液中)，加入9.81EU/ml的内毒素，采用含酚红浓度为0.01％，150mMpH7.8的Tris-HCl缓冲液进行稀释，稀释4倍后溶液呈橙红色，测得内毒素含量为9.38EU/ml，内毒素的回收率为96％。
实施例8.碳酸氢钠缓冲液中内毒素的测定配制20mMpH10的碳酸氢钠缓冲液，加入10.7EU/ml的内毒素，采用含酚红浓度为0.01％，250mM pH7.7的Tris-HCl缓冲液进行稀释，稀释2倍后，溶液呈橙红色，测得内毒素含量为12.45EU/ml，内毒素的回收率为116％。
实施例9.酚红Tris-HCl缓冲液在凝胶法测定内毒素中的应用采用含酚红浓度为0.01％，250mMpH7.7的Tris-HCl缓冲液，作为被测样品的稀释液，以缓冲液∶被测水样＝1∶1的比例进行被测水样品的稀释，采用凝胶法测定被测水样品中的内毒素含量，同时做阴性、阳性对照实验。结果阴性测定无影响，阳性测定显现出阳性特有的凝胶反应。
权利要求
1.一种用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，其特征在于所述缓冲液为含有酚红的Tris-HCl缓冲液，酚红的重量浓度为0.005-0.1％。
2.按照权利要求1所述用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，其特征在于所述Tris-HCl缓冲液，Tris浓度为30-500mM，pH为7-8.5。
3.一种权利要求1所述用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液的制备方法，其特征在于将酚红和Tris盐称重后，在150-200度干烤1-5小时；再加入无内毒素的水，用浓盐酸调节缓冲液的pH至所需要的值；高压消毒无菌保存或冷冻保存。
全文摘要
一种用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，其特征在于所述缓冲液为含有酚红的Tris－HCl缓冲液，酚红的重量浓度为0.005－0.1％。其制备方法是将酚红和Tris盐称重后，在150－200度干烤1－5小时；再加入无内毒素的水，用浓盐酸调节缓冲液的pH至所需要的值；高压消毒无菌保存或冷冻保存。本发明的缓冲液可以用来稀释被测样品，同时可以调节并指示样品pH。本发明的用于细菌内毒素鲎试验检测法的缓冲液，在两种内毒素测定法中对内毒素的测定无影响，均符合鲎试验法测定的规定。
文档编号G01N33/579GK1621842SQ20031011926
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月26日 优先权日2003年11月26日
发明者李京华, 邵英光, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所