专利名称：确定慢性肾病分期的方法、其设备和操作所述设备的方法
技术领域：
本发明涉及用于确定慢性肾病的分期的方法和设备，以及用于操作所述设备的方法。
背景技术：
慢性肾病(CKD)是一种进展的疾�。甘旧鏊鹕说姆⑾只蛏龉δ芏窕唤兄瘟� 时长期持续的状态。随着其进展，所述疾病导致晚期肾衰竭，并且如果不进行人工透析或肾 脏移植，生存将变得困难。
晚期肾衰竭在全球范围内增长。为了治疗这种疾�。衔缙谥瘟坪驮缙诩觳猓� 别是在疾病是所谓的“隐藏的慢性肾病”时的检测是重要的。
据称日本目前有大约13，300，000名CKD患者。这表示8名成年人中大约有I人 就是CKD患者。
在透析患者中最常发生的原发病是糖尿病性肾�。涫侨种饕奶悄虿〔⒎⒅� 中的一种。由于糖尿病性肾病是CKDs中的一种，因此患有糖尿病的患者可能患有CKD。按照 2006年的国家健康和营养检查调查(健康、劳动和福利部(Ministry ofHealth, Labor and Welfare))估计糖尿病患者的人数为8，200，000人，包括潜在的糖尿病患者为18，700，000 人。由于假定这些患者中的30%将发展肾衰竭，在将来CKD患者的人数将持续增长。例如， 日本每年用于透析治疗的医疗费用约为5，400，000日元/人，总共为1.5万亿日元。由于 透析患者的人数增长，透析治疗所需要的医疗费用也在增长。因此，减少这些医疗费用的措 施是急需的。由于这一原因，肾损伤的早期检测、防止症状加重的早期治疗、以及最终尽可 能减少导入透析的患者人数在全世界认为是重要的。
CKD按照肾小球滤过率(GFR)分期，肾小球滤过率是肾功能的评价指标。即，按照 GFR(NPLl)，CKD 分成五期。
然而，这样进行的CKD分期的确定是基于血清肌酸酐浓度。由于血清肌酸酐浓度 受肌肉量的强影响，因此，存在问题，如排除这样的影响进行准确的确定是困难的。此外，由 于直到估算的GFR(eGFR)变为50%以下时才观察到血清肌酸酐浓度的增加，因此难以发现 微小的肾损伤。尽管如此，还没有开发出替代前述方法的适当的确定方法。
引用列表
非专利文献
NPLl :2007年5月23日修订的CKD Shinryo Guide [用于慢性肾病的诊断和 治疗的临床实践指南(Clinical Practice Guidebook for Diagnosis and Treatment of Chronic Kidney Disease)]的第 12-13 页，由日本肾脏学会(Japanese Society of Nephrology)编辑,2009 年出版。
发明概述
技术问题
本发明的目的在于提供一种用于确定慢性肾病的分期的方法和设备，以及用于操作所述设备的方法。
问题的方案
经过持续的反复试验，本发明人进行了各个分期之间的CKD患者的透析前血浆和透析前尿液的准确比较，并且努力寻找一种低分子量化合物，所述低分子量化合物的含量认为与分期进展有关系。
经过这样持久的努力，本发明人最终发现存在这样一种低分子量化合物，其含量随着分期进展而增加。此外，本发明人发现存在仅在特定的分期中观察到的低分子量化合物。并且，作为广泛研究的结果，本发明人发现这样的特定的低分子量化合物在血浆中的含量可以用作适当确定慢性肾病的分期的指标。
具体地，本发明如下述
(I)用于确定慢性肾病的分期的方法
[1-1]
一种用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤
(A-1)通过用液相色谱/飞行时间质谱在下文所示的特定条件下处理来自所述受试者的样品，确定至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记的含量，和
(B-1)通过将已经在步骤(A-1)中测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的 含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较，而确定由每个标记指示的分期
液相色谱条件
液相色谱设备=AgilentllOO系列(Agilent)；
柱Cadenza C182xl50mm, 3 μ m (Imtakt)；
前置柱(Pre-column) TCI OPT1-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A :0. 05%甲酸;
移动相B :乙腈；
对于梯度洗脱
0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，
15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和
20-35min :保持100%的移动相B ；
流速0. 2mL/min ;和
测量样品容量5yL。
飞行时间质谱条件
测量范围m/z70至1,000 ；
Orificel 电压10 至 40V, -10 至(-40)V 扫描；
离子导向电压500至2，500V扫描；
检测器2,800V ;和
测量设备Accu TOF JMS-TIOOLC (JEOL)
标记
标记(I):在阳离子测定[M+H]+中具有2. 03±0. 5(min)的保留时间和104. 10±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
标记 257.1OilOmDa
标记 312. 12± IOmDa
标记 232.15±IOmDa
标记 265.12±IOmDa
标记 300.22±IOmDa
标记 211.08±IOmDa
标记 411. 13± IOmDa
标记 263.1OilOmDa
标记 286.13±IOmDa
标记 495.23±IOmDa
标记 529.22±IOmDa
标记 304.13±IOmDa
标记 389.21±IOmDa
标记 197.05±IOmDa
标记 327.09±IOmDa⑵在阳离子测定[Μ+ΗΓ3. 80±0·的精确质量(3):在阳离子测定[M+H]+中具有6. 52±0.的精确质量⑷在阳离子测定[Μ+ΗΓ的精确质量(5):在阳离子测定[Μ+ΗΓ的精确质量 (6):在阳离的精确质量⑵在阴离子测定[Μ-ΗΓ的精确质量⑶在阴 离子测定[Μ-ΗΓ的精确质量(9):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有8. 25±0.的精确质量(10)在阳的精确质量(11):在阳的精确质量(12)在阳的精确质量(13)在阳的精确质量(14)在阳的精确质量(15)在阴的精确质量(16)在阴的精确质量fi/z)的标记fl/z)的标记fl/z)的标记6. 87±0·8. 32±0·n/z)的标记；子测定[Μ+ΗΓ n/z)的标记；fi/z)的标记中具有10. 54±0·6. 57±0·19±0·fi/z)的标记/z)的标记；离子测定[M+H]+中具有2. 26±0./z)的标记；离子测定[M+H]+中具有8. 29±0./z)的标记；离子测定[M+H]+中具有8. 32±0./z)的标记；离子测定[M+H]+中具有8. 64±0./z)的标记；离子测定[M+H]+中具有9. 24±0./z)的标记；离子测定[Μ-ΗΓ中具有3. 93±0./z)的标记；和离子测定[Μ-ΗΓ中具有5. 55±0. /z)5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和5 (min)的保留时间和的标记。
下文中，液相色谱和飞行时间质谱的条件与上述相同，并且，除非另外指明，标记 (1)-(16)是由前述保留时间和精确质量指定的那些。
[1-2]
根据1-1项所述的方法，所述方法还包括下述步骤(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每个标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
[1-3]
根据1-1项或1-2项所述的方法，其中步骤(A-1)中测定的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
[1-4]
一种用于确定患有肾病的受试者中慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步 骤
(A-2)通过用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下处理来自所述受试者的 样品，测定至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记，和
(B-2)当在步骤(A-2)中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性 肾病的分期是严重的。
[1-5]
一种用于确定患有肾病的受试者中慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步 骤
(B-1)通过将至少一种选自由上述标记(1)-(16)组成的组的标记在来自所述受 试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围比较来确定由每种标记指示的 分期，所述至少一种标记的含量已经通过液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下测 定；和
(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中 的慢性肾病处于所述分期。
[1-6]
根据1-5项所述的方法，其中步骤(B-1)中的目的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
(II)用于确定慢性肾病的分期的设备和用于操作所述设备的方法。
[I1-1]
—种用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括
(A-1)用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下测定至少一种选自由上文所 示的标记(1)-(16)组成的组的标记在来自所述受试者的样品中的含量的装置，
(B-1)通过将已经通过装置(A-1)测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的 含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期的装置， 和
(C-1)当已经通过装置(B-1)确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中 的慢性肾病处于所述分期的装置。
[I1-2]
根据I1-1项所述的设备，其中通过装置(A-1)测定的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
[I1-3]
一种用于确定患有设备的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括
(A-2)用液相色谱/飞行时间质谱在前述特定条件下测定至少一种选自由上文所 示的标记(10)-(16)组成的组的标记的装置，和
(B-2)当通过装置(A-2)检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性 肾病的分期是严重的装置。
[I1-4]
一种用于操作I1-1项的设备的方法，所述方法包括下述步骤
(a-Ι)操作装置(A-1)来测定至少一种选自由标记(1)-(16)组成的组的标记在提 取自受试者的样品中的含量，
(b-Ι)操作装置(B-1)通过将在步骤(a-Ι)中测定的含量与在每个分期中确定的 参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期，和
(c-Ι)操作装置(C-1)，当已经在步骤(b-Ι)中确定每种标记指示同一分期时，确 定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
[I1-5]
一种用于操作I1-2项的设备的方法，所述方法包括下述步骤
(a-Ι)操作装置(A-1)来测定至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记在提 取自受试者的样品中的含量，
(b-Ι)操作装置(B-1)通过将在步骤(a-Ι)中测定的含量与在每个分期中确定的 参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期，和
(c-Ι)操作装置(C-1)，当已经在步骤(b-Ι)中确定每种标记指示同一分期时，确 定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
[I1-6]
一种用于操作I1-3项的设备的方法，所述方法包括下述步骤
(a-2)操作装置(A-2)来测定在提取自受试者的样品中的至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记，和
(b-2)操作装置(B-2)，当在步骤(a-2)中在所述样品中检测到所述至少一种标记 时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
(III)用于确定慢性肾病的分期的试剂盒
[II1-1]
一种用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括用液相色谱/飞行时间 质谱在前述特定条件下检测至少一种选自由上文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记所 需要的材料。
[II1-2]
一种用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括用液相色谱/飞行时间 质谱在前述特定条件下检测至少一种选自由上文所示的标记(1)-(9)组成的组的标记所 需要的材料。
[II1-3]
一种用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括用液相色谱/飞行时间 质谱在前述特定条件下检测至少一种选自由上文所示的标记(10)-(16)组成的组的标记 所需要的材料。
发明的有益效果
按照本发明，应用新标记确保比应用常规方法更适当的确定慢性肾病分期。
特别地，按照本发明，可以以低成本在短时间内容易地确定慢性肾病的分期。
此外，通过应用本发明确定慢性肾病的分期，预计许多患有肾病的患者以及涉及 肾病的诊断、治疗等的医疗机构将得到多种益处。
附图简述
[
图1]图1显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化(SN>20)的图 表。[图2]图2显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化(SN> 20)的图表。[图3]图3显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化(SN> 20)的图表。[图4]图4显示表明每个分期中每种标记(ESI-负)的成分变化(SN> 20)的图表。[图5]图5显示表明每个分期中每种标记(ESI-正)的成分变化的图表。[图6]图6显不表明每个分期中每种标记(ESI-负)的成分变化的图表。实施方案描述I.用于确定慢性肾病的分期的方法本发明所述的确定慢性肾病的分期的第一实施方案(方法(1))包括下述步骤(A-1)评估至少一种标记在来自受试者的样品中的含量，所述至少一种标记选自 由标记(1)_(16)组成的组，其中保留时间和精确质量(m/z)如下文在下述条件下进行的液 相色谱/飞行时间质谱测定中定义液相色谱条件液相色谱设备Agilentll00系列(Agilent)；柱CadenzaC182xl50mm, 3 u m(Imtakt)；前置柱TCIOPT I-GUARD Fit ODS(TCI)；移动相A :0. 05%甲酸；移动相B:乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和20-35min :保持 100% 的移动相 B ；流速0.2mL/min ;和测量样品容量5 ii L。飞行时间质谱条件测量范围m/z70至 1，000 ；Orificel 电压10to40V，-10to (-40) V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V;和测量设备AccuT0F JMS-T100LC (JE0L)。(1):在阳离子测定[M+H].中具有2. 03±0. 5(min)的保留时间和104. 10±10mDa 的精确质量(m/z)的标记；(2):在阳离子测定[M+H].中具有3. 80±0. 5(min)的保留时间和257. 10±10mDa 的精确质量(m/z)的标记；(3):在阳离子测定[M+H]+中具有6. 52±0. 5(min)的保留时间和312. 12±10mDa的精确质量(m/z)的标记；
(4):在阳离子测定[M+H]+中具有6. 87±0. 5(min)的保留时间和232. 15± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(5):在阳离子测定[M+H]+中具有8. 32±0. 5(min)的保留时间和265. 12± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(6):在阳离子测定[M+H]+中具有10. 54±0. 5(min)的保留时间和300. 22± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(7):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有6. 57±0. 5(min)的保留时间和211.1OilOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(8):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有7. 19±0. 5(min)的保留时间和411. 13± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(9):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有8. 25±0. 5(min)的保留时间和263.1OilOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(10):在阳离子测定[M+H]+中具有2. 26±0. 5(min)的保留时间和286. 13± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(11):在阳离子测定[M+H]+中具有8. 29±0. 5(min)的保留时间和495. 23± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(12):在阳离子测定[M+H]+中具有8. 32±0. 5(min)的保留时间和529. 22± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(13):在阳离子测定[M+H]+中具有8. 64±0. 5(min)的保留时间和304. 13± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(14):在阳离子测定[M+H]+中具有9. 24±0. 5(min)的保留时间和389. 21 ± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(15):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有3. 93±0. 5(min)的保留时间和197. 05± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；和
(16):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有5. 55±0. 5(min)的保留时间和327. 09± IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；
(B-1)通过将已经在步骤(A-1)中测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确 定的参照含量范围进行比较来确定由每种标记指示的分期，和
(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
本发明所述的确定慢性肾病的分期的第二实施方案(方法(2))包括下述步骤
(A-2)评估至少一种标记在来自受试者的样品中的含量，所述至少一种标记选自由标记(10)-(16)组成的组，其中保留时间和精确质量(m/z)如下文在下述条件下进行的液相色谱/飞行时间质谱测定中所示
液相色谱条件
液相色谱设备Agilentll00系列(Agilent)；
柱CadenzaC182xl50mm, 3 μ m(Imtakt)；
前置柱TCIOPT1-GUARD Fit ODS(TCI)；
移动相A :0. 05%甲酸；移动相B:乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和20-35min :保持 100% 的移动相 B ；流速0.2mL/min ;和测量样品容量5li L。飞行时间质谱条件测量范围m/z70至 1，000 ；Orificel 电压10 至 40V, -10 至(_40)V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V;和测量设备AccuTOF JMS-T100LC (JE0L)。(10):在阳离子测定[M+H]+中具有2. 26±0. 5(min)的保留时间和286. 13±10mDa 的精确质量(m/z)的标记；(11):在阳离子测定[M+H]+中具有8. 29±0. 5(min)的保留时间和495. 23±10mDa 的精确质量(m/z)的标记；(12):在阳离子测定[M+H]+中具有8. 32±0. 5(min)的保留时间和529. 22±10mDa 的精确质量(m/z)的标记；(13):在阳离子测定[M+H]+中具有8. 64±0. 5(min)的保留时间和304. 13±10mDa 的精确质量(m/z)的标记；(14):在阳离子测定[M+H]+中具有9. 24±0. 5(min)的保留时间和389. 21 ± lOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(15):在阴离子测定[M-H]_中具有3. 93±0. 5(min)的保留时间和197. 06± lOmDa 的精确质量(m/z)的标记；和(16):在阴离子测定[M-H]_中具有5. 55±0. 5(min)的保留时间和327. 09± lOmDa 的精确质量(m/z)的标记；和(B-2)当在步骤(A-2)中证实存在所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢 性肾病的分期是严重的。本发明所述的用于确定慢性肾病的分期的方法⑴和⑵是检验来自受试者的样 品来确定每名受试者属于何种分期的方法。关于分期，例如，可以应用基于肾小球滤过率(GFR)分期，肾小球滤过率(GFR) 是肾功能的评价指标。具体地，如表1所示，可以无需修正应用依据GFR量的五个分期 (2007年5月23日修订的CKD Shinryo Guide [用于慢性肾病的诊断和治疗的临床实践指 南(Clinical Practice Guidebook for Diagnosis and Treatment of Chronic Kidney Disease)]的第 12-13 页，由日本肾脏学会(Japanese Society ofNephrology)编辑，2009 年出版)。GFR的量可以由估算等式估算，其中基于血清肌酸酐水平。这种估算的GFR的量 称为 “eGFR”。
表I
权利要求
1.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤 (A-1)通过用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下处理来自所述受试者的样品，测定至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记的含量液相色谱条件液相色谱设备=AgilentllOO系列(Agilent)；柱Cadenza C182xl50mm, 3 μ m (Imtakt)；前置柱TCI OPT1-GUARD Fit ODS(TCI)；移动相A :0. 05%甲酸;移动相B :乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和 20-35min :保持100%的移动相B ；流速0. 2mL/min ;和测量样品容量5 μ L ;飞行时间质谱条件测量范围m/z70至1,000 ；Orificel 电压10 至 40V, -10 至(-40)V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V ;和测量设备Accu TOF JMS-TIOOLC (JEOL)；标记(1):在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5(min)的保留时间和104.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(2):在阳离子测定[M+H]确质量(m/z)的标记；(3):在阳离子测定[M+H]确质量(m/z)的标记；(4):在阳离子测定[M+H]确质量(m/z)的标记；(5):在阳离子测定[M+H]确质量(m/z)的标记；(6):在阳离子测定[M+H]精确质量(m/z)的标记；(7):在阴离子测定[M-H]确质量(m/z)的标记；(8):在阴离子测定[M-H]确质量(m/z)的标记；(9):在阴离子测定[M-H]中具有3. 80±0. 5(min)的保留时间和257.1OilOmDa的精中具有6. 52±0. 5(min)的保留时间和312. 12± IOmDa的精中具有6. 87±0. 5(min)的保留时间和232. 15± IOmDa的精中具有8. 32±0. 5(min)的保留时间和265. 12± IOmDa的精中具有10. 54±0. 5(min)的保留时间和300. 22 ± IOmDa的中具有6. 57±0. 5(min)的保留时间和211. 08± IOmDa的精中具有7. 19±0.5(min)的保留时间和411. 13± IOmDa的精中具有8. 25±0. 5(min)的保留时间和263.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(10):在阳离子测定[M+H] +中具有2.26±0·5 (min)的保留时间和286.13±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(11):在阳离子测定[M+H] +中具有8.29±0·5 (min)的保留时间和495.23±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(12):在阳离子测定[M+H] +中具有8.32±0·5 (min)的保留时间和529.22±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(13):在阳离子测定[M+H] +中具有8.64±0·5 (min)的保留时间和304.13±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(14):在阳离子测定[M+H] +中具有9.24±0·5 (min)的保留时间和389.21±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(15):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有3.93±0·5 (min)的保留时间和197.05 + IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；和(16):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有5.55±0·5 (min)的保留时间和327.09 + IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(B-1)通过将已经在步骤(A-1)中测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较，而确定由每个标记指示的分期；和(C-1)当已经在步骤(A-1)中测定的每个标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(A-1)中测定的所述标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
3.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤 (B-1)通过将至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记 的含量与在每个分期中确定的参照含量范围比较来确定由每种标记指示的分期，所述至少一种标记的含量已经通过用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下处理来自所述受试者的样品而测液相色谱条件液相色谱设备=AgilentllOO系列(Agilent)；柱Cadenza C182xl50mm, 3 μ m (Imtakt)；前置柱TCI OPT1-GUARD Fit ODS(TCI)；移动相A :0. 05%甲酸;移动相B :乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度， 15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和 20-35min :保持100%的移动相B ；流速0. 2mL/min ;和测量样品容量5 μ L ;飞行时间质谱条件测量范围m/z70至1,000 ；Orificel 电压10 至 40V, -10 至(-40)V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V ;和测量设备Accu TOF JMS-TIOOLC (JEOL)；标记(1):在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5 (min)的保留时间和104.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(2):在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0. 5(min)的保留时间和257.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(3):在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5 (min)的保留时间和312. 12± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(4):在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5 (min)的保留时间和232. 15± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(5):在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5 (min)的保留时间和265. 12± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(6):在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±0. 5(min)的保留时间和300. 22± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(7):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有6.57±0.5 (min)的保留时间和211. 08± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(8):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411. 13± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(9):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有8.25 ±0.5 (min)的保留时间和263.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(10):在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0. 5(min)的保留时间和286. 13± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(11):在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0. 5(min)的保留时间和495. 23± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(12):在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0. 5(min)的保留时间和529. 22± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(13):在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0. 5(min)的保留时间和304. 13± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(14):在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0. 5(min)的保留时间和389. 21 ± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(15):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有3.93±0. 5(min)的保留时间和197. 05± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；和(16):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有5.55±0. 5(min)的保留时间和327. 09± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；和(C-1)当已经在步骤(B-1)中确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期。
4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(B-1)中的目的标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
5.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤 (A-2)通过用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下处理来自所述受试者的样品而测定至少一种选自由下文所示的标记(10)-(16)组成的组的标记的存在液相色谱条件液相色谱设备=AgilentllOO系列(Agilent)；柱Cadenza C182xl50mm, 3 μ m (Imtakt)；前置柱TCI OPT1-GUARD Fit ODS(TCI)；移动相A :0. 05%甲酸;移动相B :乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和 20-35min :保持100%的移动相B ；流速0. 2mL/min ;和测量样品容量5 μ L ;飞行时间质谱条件测量范围m/z70至1,000 ；Orificel 电压10 至 40V, -10 至(-40)V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V ;和测量设备Accu TOF JMS-TIOOLC (JEOL)；标记(10):在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0. 5(min)的保留时间和286. 12± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(11):在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0. 5(min)的保留时间和495. 26± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(12):在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0. 5(min)的保留时间和529. 28± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(13):在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0. 5(min)的保留时间和304. 15± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(14):在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0. 5(min)的保留时间和389. 24± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(15):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有3.93±0. 5(min)的保留时间和197. 14± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；和(16):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有5.55±0. 5(min)的保留时间和327. 28± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；和(B-2)当在步骤(A-2)中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病的分期是严重的。
6.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括(A-1)应用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下测定至少一种选自由下文所示的标记(1)-(16)组成的组的标记在来自所述受试者的样品中的含量的装置液相色谱条件液相色谱设备=AgilentllOO系列(Agilent)；柱Cadenza C182xl50mm, 3 μ m (Imtakt)；前置柱TCI OPT1-GUARD Fit ODS(TCI)；移动相A :0. 05%甲酸;移动相B :乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和 20-35min :保持100%的移动相B ；流速0. 2mL/min ;和测量样品容量5 μ L ;飞行时间质谱条件测量范围m/z70至1,000 ；Orificel 电压10 至 40V, -10 至(-40)V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V ;和测量设备Accu TOF JMS-TIOOLC (JEOL)；标记(1):在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5 (min)的保留时间和104.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(2):在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0. 5(min)的保留时间和257.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(3):在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5 (min)的保留时间和312. 12± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(4):在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5 (min)的保留时间和232. 15± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(5):在阳离子测定[M±H]+中具有8.32±0. 5(min)的保留时间和265. 12± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(6):在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±O. 5 (min)的保留时间和300. 22 ± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(7):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有6.57±0.5 (min)的保留时间和211. 10± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(8):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411. 13± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(9):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有8. 25 ±0.5 (min)的保留时间和263.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(10):在阳离子测定[M+H] +中具有2.26±0·5 (min)的保留时间和286.13±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(11):在阳离子测定[M+H] +中具有8.29±0·5 (min)的保留时间和495.23±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(12):在阳离子测定[M+H] +中具有8.32±0·5 (min)的保留时间和529.22±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(13):在阳离子测定[M+H] +中具有8.64±0·5 (min)的保留时间和304.13±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(14):在阳离子测定[M+H] +中具有9.24±0·5 (min)的保留时间和389.21±IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(15):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有3.93±0·5 (min)的保留时间和197.05 + IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；和(16):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有5.55±0·5 (min)的保留时间和327.09 + IOmDa 的精确质量(m/z)的标记；(B-1)通过将已经通过装置(A-1)测定的每种标记在来自所述受试者的样品中的含量与在每个分期中确定的参照含量范围进行比较而确定由每种标记指示的分期的装置，和 (C-1)当已经通过装置(B-1)确定每种标记指示同一分期时，确定所述受试者中的慢性肾病处于所述分期的装置。
7.根据权利要求6所述的设备，其中通过装置(A-1)测定的所述标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
8.用于确定患有肾病的受试者中的慢性肾病的分期的设备，所述设备包括(A-2)应用液相色谱/飞行时间质谱在下述条件下测定至少一种选自由下文所示的标记(10)-(16)组成的组的标记的装置液相色谱条件液相色谱设备=AgilentllOO系列(Agilent)；柱Cadenza C182xl50mm, 3 μ m (Imtakt)；前置柱TCI OPT1-GUARD Fit ODS(TCI)；移动相A :0. 05%甲酸;移动相B :乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和 20-35min :保持100%的移动相B ；流速0. 2mL/min ;和测量样品容量5 μ L ;飞行时间质谱条件测量范围m/z70至1,000 ；Orificel 电压10 至 40V, -10 至(_40)V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V ;和测量设备Accu TOF JMS-T100LC (JE0L)；标记(10):在阳离子测定[M+H].中具有2.26±0. 5(min)的保留时间和286. 13±10mDa的 精确质量(m/z)的标记；(11):在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0. 5(min)的保留时间和495. 23± lOmDa的 精确质量(m/z)的标记；(12):在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0. 5(min)的保留时间和529. 22± lOmDa的 精确质量(m/z)的标记；(13):在阳离子测定[M+H].中具有8.64±0. 5(min)的保留时间和304. 13±10mDa的 精确质量(m/z)的标记；(14):在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0. 5(min)的保留时间和389. 21 ± lOmDa的 精确质量(m/z)的标记；(15):在阴离子测定[M-HF中具有3.93±0. 5(min)的保留时间和197. 06±10mDa的 精确质量(m/z)的标记；和(16):在阴离子测定[M-HF中具有5.55±0. 5(min)的保留时间和327. 09± lOmDa的 精确质量(m/z)的标记；和(B-2)当在步骤(A-2)中检测到所述至少一种标记时，确定所述受试者中的慢性肾病 的分期是严重的装置。
9.用于确定慢性肾病的分期的试剂盒，所述试剂盒包括应用液相色谱/飞行时间质谱 在下述条件下检测至少一种选自由下文所示的标记(1)_(16)组成的组的标记所需要的材 料液相色谱条件液相色谱设备AgilentllOO系列(Agilent)；柱Cadenza C182xl50mm, 3 u m (Imtakt)；前置柱TCI OPT I-GUARD Fit ODS(TCI)；移动相A:0. 05%甲酸;移动相B:乙腈；对于梯度洗脱0-15min :移动相A中5%至95%的移动相B的线性梯度，15-20min :移动相A中95%至100%的移动相B的线性梯度，和 20-35min :保持100 %的移动相B ；流速0. 2mL/min ;和 测量样品容量5 ii L ;飞行时间质谱条件 测量范围m/z70至1,000 ；.Orificel 电压10 至 40V, -10 至(-40)V 扫描；离子导向电压500至2，500V扫描；检测器2，800V ;和测量设备Accu TOF JMS-TIOOLC (JEOL)；标记(1):在阳离子测定[M+H]+中具有2.03±0.5 (min)的保留时间和104.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(2):在阳离子测定[M+H]+中具有3.80±0. 5(min)的保留时间和257.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(3):在阳离子测定[M+H]+中具有6.52±0.5 (min)的保留时间和312. 12± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(4):在阳离子测定[M+H]+中具有6.87±0.5 (min)的保留时间和232. 15± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(5):在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0.5 (min)的保留时间和265. 12± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(6):在阳离子测定[M+H]+中具有10.54±O. 5 (min)的保留时间和300. 22 ± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(7):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有6.57±0.5 (min)的保留时间和211. 10± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(8):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有7.19±0.5(min)的保留时间和411. 13± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(9):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有8.25 ±0.5 (min)的保留时间和263.1OilOmDa的精确质量(m/z)的标记；(10):在阳离子测定[M+H]+中具有2.26±0. 5(min)的保留时间和286. 13± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(11):在阳离子测定[M+H]+中具有8.29±0. 5(min)的保留时间和495. 23± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(12):在阳离子测定[M+H]+中具有8.32±0. 5(min)的保留时间和529. 22± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(13):在阳离子测定[M+H]+中具有8.64±0. 5(min)的保留时间和304. 13± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(14):在阳离子测定[M+H]+中具有9.24±0. 5(min)的保留时间和389. 21 ± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；(15):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有3.93±0. 5(min)的保留时间和197. 05± IOmDa的精确质量(m/z)的标记；和(16):在阴离子测定[Μ-ΗΓ中具有5.55±0. 5(min)的保留时间和327. 09± IOmDa的精确质量(m/z)的标记。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述标记是至少一种选自由标记(1)-(9)组成的组的标记。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述标记是至少一种选自由标记(10)-(16)组成的组的标记。
全文摘要
本发明提供一种确定慢性肾病的分期的方法和设备和操作该设备的方法。本发明涉及用于确定患有肾病的受试者中慢性肾病的分期的方法，所述方法包括下述步骤步骤(A-1)测量获自所述受试者的样品中至少一种选自由标记(1)-(16)组成的组的标记的量；步骤(B-1)将在步骤(A-1)中测量的在获自所述受试者的所述样品中所述标记的量与已经为各个分期确定的参照含量范围进行比较，确定由每种标记指示的分期，和步骤(C-1)当各标记指示同一分期时，确定所述受试者处于前述慢性肾病分期。
文档编号G01N27/62GK103026218SQ201180036730
公开日2013年4月3日 申请日期2011年5月30日 优先权日2010年5月31日
发明者田仲纪阳, 河野雅弘, 佐藤惠美子, 藤原功一 申请人:田仲纪阳
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