专利名称：一种发光检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的化学发光检测试剂盒。
背景技术：
肿瘤的发展和转移是多阶段的、复杂的、具有高度选择性的过程，涉及肿瘤细胞与宿主之间错综复杂的关系，其机理尚不甚清楚。近年来关于新的血管生成与肿瘤发展、转移和预后关系的研究进展迅速，证明新的血管生成是肿瘤生成、转移和转移灶生长的必要条件，血管内皮细胞生长因子(VEGF)是调节新血管生成的最重要的细胞因子。研究表明血管 内皮细胞生长因子(VEGF)在血管系统的发育分化中具有不可替代的作用(Ferrara et al.Endocr. Rev. 1997, 18:4-25)。VEGF是一个分子量为45KD的高度糖基化的碱性蛋白，有两个相同亚单位通过二硫键结合形成，等电点为8. 5，有很强的耐热和耐酸能力。人VEGF基因有5种不同的异构体，分别为 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145, VEGF121。VEGF高亲和力结合位点仅位于血管内皮细胞上的3种VEGF受体，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，这3种受体主要分布于血管内皮细胞表面，均是跨膜受体。研究表明，VEGF受体在体外与VEGF有高度的亲和力(Kendall et al. PNAS USA, 1993，90:10705-9)。VEGF是癌症生长、转移所必需的一种因子。目前研究表明，在人类各种恶性肿瘤(即癌症)疾病中，VEGF的分泌增加有着普遍性和广泛性。有大量文献报道，VEGF在正常人和癌症患者中的浓度明显不同，正常人中的VEGF浓度很低或检测不到，而在癌症患者中VEGF浓度很高。因此，检测人血液中的VEGF浓度，能够用于癌症的早期普查诊断。另一方面，VEGF在人体血液中的浓度随肿瘤的消长情况而变化。肿块大、生长快时，VEGF的血液浓度就高；而当肿瘤因化疗或手术“临床治愈”时，VEGF的血液浓度降低。故VEGF得检测可作为疗效观察和预后的指标。VEGF是恶性肿瘤诊断中的一个重要组成部分。另外，血液VEGF水平增高亦见于糖尿病、血管炎症性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。Yeo et al. (Clin. Chem. 1992，38:71)报道了以免疫荧光为基础的检测VEGF的ELISA 方法，但其检测灵敏度较低。Houck et al. (J Biol. Chem. 1992，267:26031)报道了以比色发为基础的检测VEGF的ELISA方法，但其检测敏感度仅为ng/ml。Hanataniet al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995, 59:1985)报道了测定 VEGF 的化学发光ELISA，测定正常人的血清VEGF水平为8_36 ng/Ι。
发明内容
本发明的目的是提供一种化学发光检测人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的检测试剂盒。该试剂盒结果准确稳定、特异性强、灵敏度高、使用方便、便于推广。本发明的另一目的是提供上述检测试剂盒的生产制备及使用方法。
为实现上述目的，本发明提供的试剂盒组成为
I.反应板；2.酶结合物；3.标准品；4.样品稀释液；5.浓缩洗涤液；6.发光底物Α、Β;7·封板胶纸。本发明提供的上述试剂盒的制备方法及操做步骤如下
Ca)以固体反应板为固体支持物，将VEGF受体及单克隆抗体包被于固体支持物上；
(b)用封闭液封闭；
(c)将生物标本与固定于酶联板上的VEGF受体及单克隆抗体接触和保温，生物标本中的VEGF特异地与VEGF受体及单克隆抗体结合；
Cd)从VEGF受体及单克隆抗体上分离生物标本； (e)用辣根过氧化物酶(HRP)标记的VEGF多克隆抗体检测VEGF，所用的发光底物为鲁米诺溶液。本发明试剂盒的独特性在于，它使用VEGF受体及单克隆抗体联合包被酶联板，能够确保较低水平的VEGF能被本试剂盒所检测，能对标本有更准确的测定。本试剂盒检测生物标本中的VEGF，优选来自癌症、血管病病人或其他疾病病人的标本。
具体实施例方式下述实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解为本发明局限于此。实施例I :
本发明的试剂盒举例可以是下列物质
(1)VEGF受体包被反应板；
(2)酶结合物辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子多克隆抗体，I瓶；
(3)VEGF标准品，2支;
(4)样品稀释液0.05%吐温-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二钠，O. 05%硫柳汞，0.4M NaCl，pH6.5，l 瓶;
(5)浓缩洗涤液为137mMNaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 , O. 05% 吐温-20，Ph7. 4, I瓶；
(6)发光底物A、B，其中A液为H2O2溶液，B液为鲁米诺溶液，各I瓶；
(7)封板胶纸2张。本例所述的各种物质量均以反应板为96孔(12条8孔或8条12孔)的例子计算的，如果反应板的孔数多于或少于96孔，则各物质量也相应或多或少。其制备方法
(I)VEGF基因和VEGF受体基因的克隆
以人胎盘cDNA文库为模板进行聚合酶链式反应(PCR)。依据VEGF基因的报道序列设计引物，PCR反应条件94°C变性40秒，52°C退火I分钟，72°C延伸I分钟，30个循环后72°C保温10分钟。依据VEGF受体基因的报道序列设计引物，PCR反应条件94°C变性40秒，52 °C退火I分钟，72 °C延伸2分钟，30个循环后72°C保温10分钟。反应体系ddH2020. 0 μ I IOXBuffer 2. 5 μ IdNTP(IOmM)O. 5 μ I
3 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I
5 primer(lOOng/μ I)O.5 μ I
Taq 酶(5U/μ I)O. 5 μ I
模板 NDAO. 5 μ I
总体积25 μ I
凝胶电泳回收PCR扩增的片段，克隆到载体ΡΜΤ18-Τ中，转化大肠杆菌DH5 α，提取重组质粒进行酶切鉴定。VEGF基因的重组质粒命名为pMT18-l，VEGF受体基因的重组质粒命名 为pMT18-2。DNA序列分析由上海博亚生物工程有限公司完成。(2)昆虫表达载体的构建
用Sal I ,BamH I分别酶切质粒pMT18_l和pMT18_2，分别回收VEGF基因片段和VEGF受体基因片段。同时用Sal I > BamH I酶切质粒pFastBac-HT，回收4.7kb片段。将VEGF基因片段和VEGF受体基因片段分别与4. 7kb片段进行连接，构建载体pFastBac-1和pFastBac-2。用不同的限制性内切酶进行酶切鉴定，表明所构建载体正确。分别将载体pFastBac-Ι和pFastBac-2转化DHlOBac感受态细胞。采用蓝白斑筛�。�24小时后将白斑划到新平板上，确认其是否白斑。将菌落挑到2ml LB培养基中，37°C，250rpm振荡培养12小时。提取培养的菌液中的质粒方法如下
(a)将1.5ml菌液转入离心管中，10，OOOrpm离心30s，弃上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥；
(b)加300 μ I 溶液 I (50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl，IOmM EDTA，pH8. O),在震荡器上振荡混匀；
(c)加300μ I现配的溶液II (O. 2Ν NaOH，1%SDS)，混匀，室温放置5分钟；
(d)加300μ I预冷的溶液IIK5Μ KAc，ρΗ5· 5)，冰浴5分钟；
(e)12, OOOrpm 离心 15 分钟；
Cf)转移上清至一新离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀；
(g)10，000-12，OOOrpm 离心 10 分钟；
(h)用70%和无水乙醇洗涤沉淀；
(i)吹干，溶于50μ I 加 RNase 的 TE (IOmM Tris-HCl ; ImM EDTA, ρΗ8· O)中，于 37°C放置一小时，置于_20°C备用。对提取的质粒进行PCR鉴定，PCR反应依据前述的方法。(3)转染昆虫细胞(以sf9细胞为例，但不仅限于sf9细胞，采用sf21、sf 158、cl27细胞株都可以得到相同的效果，在此不一一叙述)。sf9细胞培养于Grace培养液中，添加15%胎牛血清、青霉素50U/ml、链霉素50ug/ml，转染方法如下
Ca)转染前一天将细胞分到24孔板；
(b)转染前2小时，更换新鲜无血清、无双抗培养液，洗一次，然后加入500 μ I培养液；(C)在50 μ I无血清、无双抗培养液中分别加入2μ I脂质体、5 μ I前述的重组质粒，室温放置5分钟，将质粒加入到脂质体中，室温放置20分钟；(e)将上一步骤的混合物加到细胞中，27°C培养；
(f)转染4小时后，吸掉培养液，加入Iml新鲜有血清、有双抗Grace培养液，27°C培养72小时；
(g)转染72小时后，观察是否有出毒迹象；
(h)将有杆状病毒上清感染新 sf9细胞。(4)昆虫表达蛋白的纯化(Ni柱吸附法)
(a) Ni柱的制备
(I )取Iml Ni-NTA到一离心管中，1500g离心5分钟；
(II)去掉上清，将Ni-NTA用I倍体积的洗涤缓冲液(20mMTris-HCl，500mM KCl，20mM咪唑，2mM巯基乙醇，10%甘油，pH8. 5)重悬；
(III)将重悬液到入柱中，用5-10倍体积的washbuffer平衡。(b)细胞抽提物的准备
(I ) 500g离心5分钟收集50ml细胞；
(II)用裂解缓冲液(50mMTris-HCl，IOOmM KCl，20mM咪唑，5mM巯基乙醇，I mM苯甲基磺酰氟，PH8. 5)重悬细胞；
(III)10, OOOg离心10分钟，将上清液转移到一新管中。(C)蛋白纯化
(I )将上一步骤的上清液加到平衡好的Ni柱中；
(II)用10 倍体积的 buffer A (20mM Tris-HCl，500mM KCl，20mM 咪唑，5mM 巯基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗柱；
(III)用2 倍体积的 buffer B (20mM Tris-HCl，IM KCl，20mM 咪唑，5mM 巯基乙醇，10%甘油，ρΗ8· 5)洗柱；
(IV)用2倍体积的bufferA洗柱；
(V)用5-10 倍 buffer C (20mM Tris-HCl，IOOmM KCl，IOOmM 咪唑，5mM 巯基乙醇，10%甘油，pH8. 5)洗脱，收集洗脱液；
(VI)用SDS-PAGE胶检测所纯化蛋白的浓度与纯度。(5) VEGF单克隆抗体的制备及纯化
以小鼠为免疫动物，重组VEGF165为抗原进行免疫。根据小鼠免疫效价，挑选免疫效价最高的动物，取脾脏进行细胞融合，采用间接ELISA方法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选。挑选有一个细胞团的阳性孔进行有限稀释，一个孔中只有此一个克隆细胞团，中央密集成圆形向四周铺开。待有限稀释的所有的孔皆如此且全部检测为阳性，可认为克隆完成。由其中单一细胞来源的杂交瘤分泌所得到的抗体为单克隆抗体。正辛酸一硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体，纯度在95%以上。(6) VEGF多克隆抗体的制备、纯化及标记
用家兔作为免疫动物，先用5-10mg卡介苗注射刺激动物。一周后，将VEGF蛋白制成弗氏完全佐剂，采用皮下多点注射进行第一次免疫。2周后，进行第二次免疫。2周后，试血并测效价。如效价偏低，则进行加强免疫。采集家兔全血，离心取血清。向血清中加入饱和硫酸铵,血清与硫酸铵的体积比为2:1，使抗体沉淀，离心分离，抗体纯度达98%以上。
采用戊二醛法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到VEGF多克隆抗体上。(7)试剂盒的制备
反应板的包被采用以下步骤受体及单克隆抗体用包被缓冲液稀释一定的倍数，每孔加100 μ I。37°C水浴或温箱中包被2小时，然后放在室温过夜。每孔加满PBST洗涤液，放置30秒左右，甩干。每孔加120 μ I封闭液，室温放置2小时。封闭液配方主要含有BSA、一些盐类等。甩掉封闭液，拍打除去残余封闭液。超净台上吹干。或超净台上吹数小时，然后室温放置过夜。用真空包装机进行包装。实施例2 :试剂盒使用方法
I.从以平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条请密封放回4°C。2.留一孔为空白孔，其他各孔加入样品稀释液100 μ I (或2滴)。
3.除空白孔外，加入标准品稀释液(用标准品稀释8个梯度)、血清标本各100μ I至相应孔中，轻弹混匀。用封板胶纸封住反应孔，37°C 60分钟。4.洗板3次(1)自动洗板机甩尽孔内液体，要求注入的洗涤液为350μ 1，注入与吸出间隔15-30秒，洗板3次。(2)手工洗板甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350 μ 1，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干，洗3次。5.除空白孔外，每孔加酶联物200 μ I (或4滴)，封住板孔，37°C 60分钟。6.洗板 3 次。7.发光反应将发光底物A、B液各100 μ I (或2滴)加到反应孔(包括空白孔)内。8.轻微振荡30秒，室温(18 — 25°C)避光反应5分钟后，用化学发光仪测定各孔发光值。9.以标准品浓度值为横坐标(X轴)，以标准品发光强度值为纵坐标(Y轴)，建立标准曲线，计算测定结果。本发明具有的优点
I.结果特异性强。本发明采用VEGF受体为包被物包被酶联板，因此，检测VEGF的特异性高。2.灵敏度高。检测灵敏度能打到ng/L水平。4.稳定。本发明于4°C保存，有效期达9-12个月。5.方便。本发明操作简便，所需检测仪器(化学发光仪)在各大医院和检测中心普遍使用。
权利要求
1.一种发光检测试剂盒，其组成为 反应板、酶结合物、标准品、样品稀释液、浓缩洗涤液、发光底物A、B和封板胶纸； 其中 反应板为血管内皮细胞生长因子受体及单克隆抗体联合包被的固体反应板； 酶联物为辣根过氧化物酶标记血管内皮生长因子多克隆抗体。
2.权利要求I的试剂盒，其特征在于 标准品为血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉； 样品稀释液为O. 05%吐温-20，1%牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二钠，O. 05%硫柳汞，O. 4M NaCl，pH6. 5;浓缩洗涤液为 137mM NaCl, 2. 7 mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2 mMKH2P04，O. 05% 吐温-20，Ph7. 4 ； 发光底物A、B，其中发光底物A为H2O2溶液，发光底物B为鲁米诺溶液。
3.权利要求I的试剂盒，其特征在于，各物质的量以反应板的孔数为标准。
4.权利要求I的试剂盒，其特征在于，所述反应板为96孔。
5.上述试剂盒的制备和操作方法，主要步骤为 Ca)将血管内皮细胞生长因子受体及单克隆抗体包被于固体支持物固体反应板上； (b)用封闭液封闭； (C)将生物标本加入到预包被的固体反应板反应孔中，生物标本中的血管内皮细胞生长因子特异地与血管内皮细胞生长因子受体及单克隆抗体结合； Cd)用血管内皮细胞生长因子多克隆抗体检测血管内皮细胞生长因子； Ce)发光底物为鲁米诺溶液。
6.权利要求5的方法，其特征在于，步骤a所述的单克隆抗体是用血管内皮细胞生长因子免疫小鼠所得。
7.权利要求5的方法，其特征在于，步骤a所述的基因工程表达的血管内皮细胞生长因子受体用昆虫细胞表达。
8.权利要求7的方法，其特征在于，所述昆虫细胞为sf9、sfl2、sn58或cl27细胞株。
9.权利要求7的方法，其特征在于，所述昆虫细胞表达的血管内皮细胞生长因子受体用Ni柱纯化。
10.权利要求5的方法，其特征在于，步骤c所述的生物标本为癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的血清、血浆、脑脊液、唾液、组织提取液或尿液。
11.权利要求5的方法，其特征在于，步骤d所述的血管内皮细胞生长因子多克隆抗体制备用的血管内皮细胞生长因子用昆虫细胞表达并用Ni柱纯化。
12.权利要求5的方法，其特征在于，步骤d所述的多克隆抗体是用血管内皮细胞生长因子免疫家兔所得。
13.权利要求5的方法，其特征在于，步骤d所述的多克隆抗体用辣根过氧化物酶标记。
全文摘要
一种检测人血管内皮生长因子(VEGF)的化学发光检测试剂盒。试剂盒盒体内包括VEGF受体及单克隆抗体联合包被的发光反应板、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体加保护剂配置的酶结合物、VEGF标准品、样品稀释液、PBST浓缩洗液、鲁米诺配置的发光底物、封板胶纸。本试剂盒可用于癌症、血管病、糖尿病视网膜病及类风湿关节炎的诊断和预后，具有准确、特异、灵敏、稳定、方便等优点。
文档编号G01N33/68GK102830235SQ20121030783
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者邹检平 申请人:邹检平
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
