专利名称：：用于去污过程验证的共价连接的热稳定激酶的制作方法用于去污过程验证的共价连接的热稳定激酶本发明涉及生物指示物领域，特别是涉及用于验证设计用来降低样品中污染物的量或活性的处理过程的生物指示物。本发明还涉及制备这些指示物的方法以及其用途。已知各种各样的生物指示物用于验证净化和去污过程。这些指示物范围从相对基础的指示物——例如，使用简单的“视觉评分”以评定过程是否是有效的那些——到依靠热稳定激酶作为报道酶(W02005/093085)的更高级的指示物。这些激酶基指示物是生物指示物领域中重要的发展，这提供了快速和灵敏的过程验证的工具。W02005/093085详细描述以上提到的激酶基指示物的生产和应用。概括地说，一般的指示物通过吸附热稳定激酶于固体载体如指示条或浸渍片之上进行制备。指示物然后与待处理的样品(包含污染物)一起被包括，而加上样品的指示物经历处理过程。通过处理的指示物激酶的活性的降低然后与污染物的量或活性的减少相关联。当确定已知与污染物中的可接受减少相关联的活性水平时，处理然后被认为有效的。现在已经发现这些激酶基指示物的性能通过共价交联热稳定激酶到生物成分可以被显著地改善，其中生物成分是污染物的模拟/替代。这使得指示物更准确地反映污染物对于处理过程的反应，其又导致改善的指示物准确性/灵敏性，和因此更少的“假”过程验证。有利地，生物成分可以是生物基质或者混合物的一部分，例如，商业可获得的测试污染物(Browne污染物、Edinburgh污染物等)、血液、神经组织、食品、去杂的动物材料、血清、卵、粘液、或者配制以满足使用者特定要求的测试污染物。这样，激酶的量/活性的降低是基质的不同性能的函数，其进一步提高指示物的准确性/灵敏性。这种类型的指示物也能够监测基质或者混合物的特定成分的去除/失活。有利地，指示物可以被设计，使得热稳定激酶与基质的最“困难”的成分连接以去除/失活(例如，在血液基质中，血纤蛋白比血红蛋白要难以去除得多)。这提供了处理过程的非常严格地验证。以上描述的指示物也具有提供快速、一步过程验证的优点。这是与某些已知的验证指示物相比而言的，已知的验证指示物需要多个步骤用于验证并因此需要投入更长的时间和更大的努力。作为实例，WOOO/65344描述了使用酵母朊病毒作为朊病毒去污过程的生物指示物。在该过程的结束，操作员必须在进一步的步骤中，测定酵母朊病毒的破坏以便验证该过程。相比之下，以上描述的指示物被设计为具有与模拟相关污染物(例如，朊病毒)的生物成分直接连接的指示物激酶，使得该成分的破坏与激酶活性的丧失是紧密联系的。这样，这些指示物能够提供快速、一步的过程功效的指示。因此，本发明解决了提供可选的/改进的激酶基生物指示物的问题。生物过程指示物在本发明的第一个方面，提供用于验证处理过程的生物过程指示物，在该处理过程中样品中的污染物的量或者活性被降低，其中该指示物包括与生物成分共价连接的热稳定激酶，条件是生物成分不是抗体。5在一个实施方式中，生物成分是污染物的模拟物或替代，因此对于处理过程以与污染物基本相同方式进行反应。在另一个实施方式中，对于在该说明书中公开的每种污染物和生物成分，生物成分可以与待进行处理过程的样品中的污染物相同、但是物理上与待进行处理过程的样品中的污染物不同，例如，如果污染物是蛋白质，那么生物成分也可以是蛋白质；如果污染物是血液蛋白质，那么生物成分也是血液蛋白质；如果污染物是DNA分子，那么生物成分也是DNA分子；如果污染物是RNA分子，那么污染物也是RNA，等等。在进一步的实施方式中，生物成分可以不同于污染物。可以在本发明的指示物中使用的的生物成分的实例包括蛋白质、核酸、糖类和脂类。在一个实施方式中，生物成分包括选自血液蛋白质、细菌蛋白质、病毒蛋白质、真菌蛋白质、和自聚集或淀粉状形成蛋白质的蛋白质。在进一步的实施方式中，血液蛋白质选自凝血蛋白(例如，凝血因子I、血纤蛋白肽、血纤蛋白、转谷氨酰胺酶底物、凝血酶)、血清蛋白(例如，清蛋白和球蛋白)、血小板蛋白、血细胞糖蛋白和血红蛋白。在另一个实施方式中，细菌蛋白选自细菌菌毛蛋白(fimbrialprotein)(例如，来自大肠杆菌的CgsA和来自沙门氏菌的AgfA)、细菌毒素蛋白(toxinprotein)(例如，来自炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、肉毒杆菌(Clostridiumbotulium)的毒素)、细菌细胞表面蛋白(例如，肽聚糖、脂蛋白)和细菌芽孢蛋白(例如，来自革兰氏阳性细菌并具有与Clostridumtaeniosporam中的形成带状附器(ribbonappendage)的蛋白质、chaplin蛋白、rodlin蛋白类似的序列或者总体结构)。在还另一个实施方式中，病毒蛋白选自病毒包膜蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒核心蛋白。合适地，病毒蛋白来自噬菌体病毒(例如，MS2和PP7蛋白)、诺瓦克病毒(例如，衣壳蛋白)、轮状病毒(例如，VP2、VP6和VP7蛋白)、冠状病毒(例如，SARSS、E和M蛋白)、蓝舌病毒(例如，VP2蛋白)、人乳头状瘤病毒(例如，病毒主结构蛋白，Li)、乙型肝炎病毒(例如，小的包膜蛋白HBsAg)、丙型肝炎病毒(例如，核心蛋白、El和E2蛋白)、流感病毒(例如，神经氨酸酶和血细胞凝集素以及基质蛋白)、脊髓灰质炎病毒(例如，衣壳VPO、1和3蛋白)、HIV(例如，Pr55gag、包膜蛋白)和登革热B病毒(例如，包膜和预膜(premembnme)/膜(prM/M)。在另一个实施方式中，真菌蛋白选自疏水蛋白(例如，来自裂褶菌的SC3、来自烟曲霉(Aspergillusfomigate)的RodA/B和来自酵母的等效蛋白质)、真菌芽孢蛋白、菌丝蛋白、真菌毒素和真菌朊病毒(例如，Sup35、HetS>URE2,Rnql,Newl)。在还另一个实施方式中，自聚集蛋白选自朊病毒(例如，PrPSe*PrPe、Sup35、HetS>Ure2,Rnql、New1)、朊病毒模拟蛋白、淀粉样原纤维、来自活性淤泥中的絮凝物形成和丝状细菌的细胞表面黏附素、β淀粉样蛋白、Tau蛋白、多腺茄碱结合蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白B、肺表面活性蛋白C、来自大肠杆菌的CsgA蛋白、来自沙门氏菌属某种的AgfA蛋白、细菌菌毛蛋白、脱脂载脂蛋白(例如，脱脂载脂蛋白Al)、来自真菌属某种的疏水蛋白(例如，来自裂褶菌的SC3、来自烟曲霉(Aspergillusfumigates)的RodA/B)、chaplins(例如，来自链霉菌属某些种的ChpsA-H)、rodlins(例如，来自链霉菌属某些种的RdlA和RdlB)、革兰氏阳性芽孢外壳蛋白(例如，P29a、P29b、GP85和SpoVM类似物)和藤壶胶样蛋白(例如，来自白脊藤壶(Balanusalbicostatus)的19kDa蛋白质，和来自红巨藤壶(megabalanusrosa)的20kDa蛋白质和来自白脊藤壶的新方解石依赖胶样蛋白质)。在另一个实施方式中，核酸选自DNA分子和RNA分子。在进一步的实施方式中，核酸选自单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链RNA(dsRNA)。在一个实施方式中，核酸源自神经组织。在另一个实施方式中，糖类选自外泌多糖、脂多糖(EPS/LPS，有时称为内毒素)(例如，来自军团杆菌属某种(Legionellaspecies)、大肠杆菌、葡萄球菌属某禾中(Staphylococcusspecies)、链球菌属某禾中(Streptococcusspecies)、单胞菌属某种(Pseudomonasspecies)、不云力杆菌属某种(Acinetobactorspecies)、弯曲杆菌属某种(Campylobactorspecies)和芽孢杆菌属某种(Bacillusspecies))、肽聚糖、植物、真菌和酵母的细胞壁成分(例如，壳多糖、木质素、葡聚糖)、黏蛋白制备物、糖脂(特别是脑源糖脂)、糖蛋白(例如，细胞表面糖蛋白，Eaplp)、芽孢提取物(例如，来自芽孢杆菌属某些种、梭菌属某些种(Clostridalspp)和其它芽孢前体)、来自酵母被膜的多糖和无脊椎动物分泌物(例如，来自软体动物凝胶(molluscangels))。在另一个实施方式中，脂类选自糖脂(例如，脑源糖脂)、神经节苷脂(例如，神经元细胞神经节苷脂如GTlb、GTla和更普遍的细胞源的神经节苷脂如GM1)和植物油和脂。在进一步的实施方式中，生物组分是生物基质的一部分。在一个实施方式中，指示物与生物基质共价连接。生物基质可以是待被处理样品的模拟物。在一个实施方式中，生物基质包括选自蛋白质、脂类、核酸和糖类的一种或多种成分、或者其片段或衍生物。在另一个实施方式中，生物基质可以包括蛋白质的混合物。在进一步的实施方式中，生物基质可以包括选自血液、血清、清蛋白、粘液、卵、神经组织、食物、去杂的动物材料和商业可获得的测试污染物的一种或多种成分。在本发明的还另一个实施方式中，生物基质包括选自凝血因子I、凝血酶、因子VIII、CaCl2和任选地清蛋白和/或血红蛋白的一种或多种成分。在本发明的一个实施方式中，热稳定激酶与生物成分共价连接。在另一个实施方式中，热稳定激酶被基因或化学交联到生物成分。在进一步的实施方式中，生物成分以融合蛋白形式与热稳定激酶连接。本发明的指示物可以用于验证设计去除/失活污染物的处理过程，所述污染物选自蛋白质、脂类、糖类和核酸。本发明的生物过程指示物还可以包括稳定激酶的剂，例如金属离子、糖、糖醇或者凝胶形成剂。本发明的指示物(包括任何生物基质)也可以通过用70%乙醇或异丙醇处理进行“固定”。为了实现这点，指示物/基质在70%异丙醇中室温温育30分钟。这模拟了可以增加外科手术器械上的污染材料耐性的一种最常遇到的过程，并且因此提供监测这些材料去除的有效方式的指示物。本发明的生物过程指示物可以被固定在固体载体中或者固定在固体载体上。在一个实施方式中，生物过程指示物通过化学交联或吸附固定在固体载体中，或者固定在7固体载体上。指示物可以通过热稳定激酶或者通过生物成分与固体载体连接。在一个实施方式中，固体载体是指示条、浸渍片、或者珠子，并且任选地，进一步包括连接固体载体到表面的工具(例如，用于利用螺丝钉、螺母和螺栓、或者夹子连接固体载体到表面的突出物、凹口或孔)。在进一步的实施方式中，固体载体是基质并且指示物分散在基质内。在本发明的一个实施方式中，用于形成生物过程指示物的酶不是地衣酶、木聚糖酶、木糖苷酶、转甲酰酶(formiltransferase)、Taq聚合酶、α-淀粉酶或β-葡糖苷酶。在本发明的还另一个实施方式中，提供包括以上描述的指示物的试验污染物。生物指示物的制备本发明的生物指示物可以通过共价连接热稳定酶到合适的生物成分进行制备。可以使用现有技术中已知的共价连接的任何合适的方法。在一个实施方式中，热稳定激酶被基因或化学交联到生物成分，和在一个实施方式中，指示物作为融合蛋白制备。使用通常用于交联蛋白质生成酶交联物或其它相关目的的一系列同双功能试剂和异双功能试剂可以实现化学交联。例如，在包括血纤蛋白作为生物成分的指示物中，血纤蛋白和热稳定激酶可以加入SPDP(Perbio)到伯胺基进行衍生化。热稳定激酶然后可以被还原以生成活性巯基，并且然后其与血纤蛋白混合以产生共价的血纤蛋白-热稳定激酶键。在用偏高碘酸盐处理目标糖后，使用异双功能试剂也可以将激酶化学交联到糖类、脂类或其它复合糖。交联可以使用如在实施例23中略述的多种化学实现。可选地，指示物可以作为融合蛋白制备。这通过将编码合适的热稳定激酶的合成基因(例如，编码来自嗜酸热硫化叶菌或新阿波罗栖热袍菌(Thermatoganeopolitana)的AK的基因)与编码合适的生物成分的基因融合来实现。制备融合蛋白指示物的详细方案在实施例中给出(参见例如，实施例10和13)。在生物指示物中使用的激酶在本发明的指示物中使用的激酶能够生成在非�？矸段诳杉觳獾男藕�。一般而言，使用包括转化为ATP的ADP的底物检测激酶，ATP自身用于产生光，例如，使用萤光素/萤光素酶，使用发光计进行检测。当激酶保持可检测时——甚至在量/活性降低多个对数级后，宽范围使得指示物特别适合于验证。对于无菌性，多数国家研究所认为在无菌性可以被验证(确认)之前，根据需要，污染物的量或者活性降低6个对数级(61ogreduction)。本发明的指示物中使用的激酶提供了验证污染物的量或活性降低远超过6个对数级到8个对数级和更高的潜能。任何合适的激酶都可以被用作为本发明中的报道激酶。在一个实施方式中，报道激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶、或它们的组合。在本发明中使用的报道激酶可以具有多种识别的三级结构，例如，激酶可以是三聚体或单体激酶。这些三级结构可能与激酶针对条件的提高的稳定性相关，所述条件例如，诸如，温度、pH、化学变性剂或者蛋白酶。在一个实施方式中，报道激酶是源于选自以下生物的微生物激酶激烈热球菌(Pyrococcusfuriousus)>P.abyssi、掘越氏热球菌(Rhorikoshii)、沃氏热球菌(Rwoesii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)、芝田硫化叶菌(S.shibatae)、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermusmarinus)、极端嗜热细菌(Thermococcuslitoralis)、海栖热袍菌(Thermatogamaritima)、新阿波罗栖热袍菌(Thermatoganeapolitana)禾口甲烧球菌属某些种(Methanococcusspp.)。在另一个实施方式中，激酶是硫化叶菌属某种激酶或热袍菌属(Thermotoga)某种激酶。在还另一个实施方式中，激酶是酸热脂环酸芽孢杆菌(A.acidocaldarius)激酶、闪烁古生球菌(A.fulgidus)激酶、嗜热泉生古细菌(敏捷气热菌，A.pemix)激酶、嗜火产液菌(A.pyrophilus)激酶、热坚芽孢杆菌(B.Caldotenax)BTl激酶、芽孢杆菌属某种PS3激酶、嗜热脂肪杆菌芽孢(B.stearothermophilus)11057激酶、嗜热脂肪杆菌芽孢12001激酶、热链形芽孢杆菌(B.thermocatenulatus)激酶、粪堆梭菌(C.stercocorarium)激酶、甲烷球菌某属些种激酶、红色曲霉(M.raber)激酶、Rabyssi激酶、激烈热球菌(Rfuriosus)激酶、掘越氏热球菌(Rhorikoshii)激酶、沃氏热球菌激酶、海洋红嗜热盐菌(R.marinus)激酶、嗜酸热硫化叶菌激酶、芝田硫化叶菌激酶、硫磺矿硫化叶菌(S.solfataricus)激酶、产乙醇热厌氧杆菌(T.ethanolicus)激酶、T.thermosulfurogenes激酶、速生栖热分枝菌(T.celere)激酶、极端嗜热细菌(T.litoralis)激酶、水生栖热菌(T.aquaticus)YTl激酶、热坚栖热菌(T.caldophilus)GK24激酶、嗜热栖热菌(T.thermophilus)HB8激酶、海栖热袍菌(T.maritima)激酶或新阿波罗栖热袍菌CTneapolitana)激酶。在又另一个实施方式中，激酶是极端嗜热细菌激酶、海栖热袍菌激酶、或新阿波罗栖热袍菌激酶。在一个实施方式中，报道激酶是热稳定的。也对高温具有耐性，也发现热稳定激酶对通常损伤或破坏蛋白质或使它们失活的其它生物化学和物理过程也具有耐性，例如暴露于某些化学品例如离液剂、自由基损伤、去污剂、极端的pH、暴露于蛋白酶、蛋白交联、非渗透性或者半渗透性膜或聚合物内的包囊作用、或者不可逆固定于表面之上。(参见例如DanielRM,CowanDA,MorganHW,CurranMP,"Acorrelationbetweenproteinthermostabilityandresistancetoproteolysis"，BiochemJ.1982207641-4；ReesDC，RobertsonAD,“Somethermodynamicimplicationsforthethermostabilityofproteins"，ProteinSci.2001101187-94；BurdetteDS，TchernajenckoVV，ZeikusJG.”EffectofthermalandchemicaldenaturantsonThermoanaerobacterethanolicussecondary-alcoholdehydrogenasestabilityandactivity”,EnzymeMicrobTechnol.200027:11-18;ScandurraR，ConsalviV，ChiaraluceR,PolitiL，EngelPC.,"Proteinthermostabilityinextremophiles",Biochimie.l998Nov；80(11)933—41;禾口LiaoHH.,“ThermostablemutantsofkanamycinnucleotidyltransferasearealsomorestabletoproteinaseK,urea,detergents,andwater-miscibleorganicsolvents"，EnzymeMicrobTechnol.l993Apr；15(4)286-92，所有这些通过引用以整体并入本文)。适合于在本发明中使用的激酶的实例在以下的SEQIDNO.1-32中展示。在一个实施方式中，在本发明中使用的激酶与SEQIDNO.1-32具有至少70%、80%,85%,90%,95%,99%或100%的同一性。合适的报道激酶的其它实例可以在WOOO/46357和W02005/093085中发现，它们通过引用以整体并入本文。在本发明的一个实施方式中，激酶活性使用ATP生物发光检测系统进行检测。9标准的萤光素_萤光素酶检测方法可以检测少至10_15摩尔的ATP。通过将酶扩增与生物发光检测方法相结合，检测少至10_2°摩尔的激酶是可能的。生物指示物的稳定对于增加酶例如激酶对热失活的稳定性的制剂的许多添加剂和改变，是本领域技术人员已知的。添加稳定剂——如高达4M浓度的山梨醇，或高达2M浓度的其它多元醇如乙二醇、甘油或甘露醇——可以改进酶的热稳定性。其它添加剂如木聚糖、海藻糖、明胶也可以单独或组合地提供附加的稳定效应。添加一定范围的二价金属离子——最显著地是Ca2+、Mg2+或Mn2+——也可以改进酶的稳定性。也可以用对酶的化学修饰来改进它们的热稳定性。用乙醛酸对表面暴露的氨基的还原性烷基化(例如，Melik-Nubarov(1987)BiotechIetts9725-730)、向蛋白质表面加入糖类(例如，Klibanov(1979)Anal.Biochem.931-25)和酰胺化(例如，Klibanov(1983)Adv.Appl.Microbiol.291-28)均可以增加酶的稳定性。用于酶固定的其它方法-包括应用化学交联剂和应用多种聚合物载体(support)-也是增加酶的热稳定性的相关方法(在Gupta(1991)Biotech.Appl.Biochem.l41-11中综述)。相似的修饰也与指示物对其它灭菌方法如过氧化氢或臭氧的稳定相关。特别地，其中气相杀菌剂向酶接近受到例如具有添加剂的合适聚合物或制剂中的包封的限制以降低气体渗透的方法，将在需要时为增加酶的稳定性提供有用方法。有效增强酶的热稳定性的许多处理也与对抗蛋白酶处理的稳定相关，例如，用于开发通过蛋白酶处理有效失活TSE因子的指示物。一般而言，表现出高水平热稳定性的蛋白质也可能对降解过程如变性或蛋白酶处理表现出高度的稳定性(参见，例如，DanielRM,CowanDA,MorganHW,CurranMP,"Acorrelationbetweenproteinthermostabilityandresistancetoproteolysis“，BiochemJ.1982207641-4；ReesDC,RobertsonAD,"Somethermodynamicimplicationsforthethermostabilityofproteins“，ProteinSci.2001101187-94；BurdetteDS,TchernajenckoVV,ZeikusJG.'EffectofthermalandchemicaldenaturantsonThermoanaerobacterethanolicussecondary-alcoholdehydrogenasestabilityandactivity",EnzymeMicrobTechnol.20002711-18;ScandurraR,ConsalviV，ChiaraluceR,PolitiL,EngelPC,"Proteinthermostabilityinextremophiles"，Biochimie.1998Nov;80(11)933-41;和LiaoHH.，“ThermostablemutantsofkanamycinnucleotidyltransferasearealsomorestabletoproteinaseK,urea,detergents,andwater-miscibleorganicsolvents“，EnzymeMicrobTechnol.1993Apr；15(4)286-92)。因此，与可能等效的嗜温性激酶相比，热稳定激酶通常表现出对设计用来失活TSE因子的蛋白酶处理作用的更高程度的稳定性。根据应用的方法的类型，也可以选择激酶，以便支持方法的其它特性。因此，对于碱性pH下的蛋白酶处理，方案趋向于应用来自中度嗜碱生物如激烈热球菌的热稳定激酶，而在酸性pH下的蛋白酶处理可应用来自嗜酸性生物如嗜酸热硫化叶菌或硫磺矿硫化叶菌的激酶。如果需要改进激酶指示物对蛋白酶处理的稳定性，存在许多其它选择。这些选择中的许多与上述针对热处理稳定酶的那些相同。例如，包含山梨醇、甘露醇或其它复合聚合物的制剂降低指示物表面上酶的失活水平。此外，特异降低蛋白酶底物降解速率的处理与此应用特别相关。例如，在包含作为可选的蛋白酶底物起作用的、高达约lOmg/ml(比优选的指示物浓度过量10倍)的合适的载体蛋白如酪蛋白或清蛋白的溶液中的激酶制剂，将特异地降低激酶指示物的消化速率。类似地，向制剂中加入游离氨基酸如甘氨酸、酪氨酸、色氨酸或二肽将提供底物水平的酶抑制方法并降低激酶指示物的局部失活。通过在细菌中重组表达产生的热稳定激酶也可以在本发明中使用。已经显示，酶的遗传修饰提供热稳定性的显著增加，通过类比，这样的突变也可能显著增强指示物酶在其它过程，如蛋白酶处理或气相“灭菌”中的稳定性。采用三聚体(古细菌)AKs的已经确定的3-D结构(Vonrheinetal(1998)J.MoI.Biol.282167-179和Criswelletal(2003)J.MoI.Biol.3301087-1099)，激酶热稳定性的比较已经鉴定出影响酶稳定性的氨基酸。示出改进热稳定性的激酶的基因工程变体也在本发明中被使用，并且可以通过许多方式产生。必要地，这些涉及认为形成三聚体分子的中央核心堆积区(centralcorepackingregion)的氨基酸的特异性位点定向诱变和随机“定向进化”方法，其中整个分子经历随后的数轮诱变和对具有改进性质分子的选择/筛选。特异性修饰的酶在SEQIDNO17-19(几种变体被每一参考符号所包含)中提出。这些列出的修饰基于杂交方法，其中根据结构相关分子之间观察到的差异，应用基于共有序列的方法，确定出可能影响酶的热稳定性的区域。随后是确定将与最佳热稳定性相关的氨基酸引入的变化，或者确定在确定为热稳定性所必须的位置处引入每一可能氨基酸的随机置换。通过增加基质中的生物成分的浓度、或通过增加交联的程度，可以改进与作为基质一部分的生物成分结合的指示物的稳定性/耐性。作为实例，本发明的指示物之一应用血纤蛋白-活性肽-激酶指示物以实现交联入包含血纤蛋白例如血纤蛋白膜的生物基质。通过改变血纤蛋白膜，例如，增加血纤蛋白的浓度，或者通过增加其交联程度，有可能显著增加指示物对特定过程的耐性。包含生物成分如Sup35的指示物的耐性可以通过促进指示物的纤维化作用(fibrilisation)进行增加。这提供具有更大物理稳定性的分子，并且可以与监测因子如朊病毒蛋白的灭活相关，其被认为本质上是多聚体的。在一个实施方式中，指示物被配制在选自蔗糖(例如，在多至下)、黏蛋白(例如，在多至0.5%w/v下)和清蛋白(例如，在多至lmg/ml下)的载体中。固体载体本发明的生物指示物可以连接到多种固体载体。载体可以具有或不具有化学修饰，并且可以包括多种制剂中的一种或多种指示物，这取决于，例如，待验证过程的需要。在一种形式中，载体是塑料、木材、陶瓷、玻璃、纺织品、钢或其它金属或聚合物表面，作为固定的手段，指示物在其上被干燥/交联。载体可以是聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯条或浸渍片，任选地具有平坦表面，指示物被施加在该表面上。带有用于连接指示物的多孔表面的其它类型的载体作为气相过程的指示物也是特别有用的。塑料、木材、金属或陶瓷珠子也可以为固体载体提供有价值的形式，这也与监测气相过程特定相关。对于某些应用，这类载体具有优势，因为它们为连接指示物提供了明显增加的表面积。在进一步的实施方式中，固体载体是基质并且指示物分散在基质内。在还另一个实施方式中，基质是复合生物基质。11将生物指示物固定在固体载体上使用现有技术已知的各种各样的方法可以将本发明的指示物结合于固体载体上。在本发明的一个实施方式中，指示物通过如下概述的标准蛋白吸附方法结合于固体载体上。在固体载体上结合指示物可以通过将蛋白质连接到表面应用的常规方法实现，例如，将蛋白质在约pH9.6的0.1M碳酸氢钠缓冲液中，室温下温育约1小时。可选地，用本领域技术人员已知的宽范围的偶联化学制品的任意方法，将蛋白质与表面共价连接。例如，用SPDP(Piercechemicals;采用制造商的说明书)衍生化、用DTT还原以提供用于交联的游离巯基的腺苷酸激酶融合蛋白(例如，到Sup35)，被共价连接到带有马来酰亚胺表面的聚苯乙烯载体。带有这样的巯基结合表面的塑料表面在文献中充分描述。这种连接方法的增加的益处是，如果需要，可以将酶从载体切割出来，例如，通过用DTT或MESNA还原，以使得对任何指示物载体单独进行分析。本申请中描述的指示物具有如下性质它们在衍生并与这类载体交联后保持活性。可选地，应用聚苯乙烯或聚碳酸酯载体上的胺活性表面，利用双功能交联剂如单体戊二醛，通过蛋白质上的游离胺基提供激酶指示物的直接的不可切割交联。也可以应用紫外线(UV)处理直接将指示物连接到合适的载体。可以用与塑料表面相似的方式处理钢表面，以介导指示物的共价连接。宽范围的蛋白交联剂可以从公司如Piercechemicalcompany(Perbio)获得。对巯基、氨基、羟基和羧基有活性的试剂被设计，用于偶联蛋白质，但是它们可以被平等地用于将蛋白质交联到天然反应性的或包被的固体载体如塑料、其它聚合物、玻璃和金属。也可以利用将酶与糖交联的活性化学制品。例如，可以用试剂ΒΜΡΗ((Ν-[β_马来酰亚胺基丙酸]酰胼·TFA)、KMUH((N-[k_马来酰亚胺基十一酸]酰胼)和MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸盐酸酰胼)(4-(4-N-Maleimidophenyl)butyricacidhydrazidehydrochloride)将包含半胱氨酸残基形式的游离巯基或还原产生巯基活性基团的化学衍生蛋白质的指示物与糖交联。这对于固体载体特别重要，所述载体是复合糖(例如纸、纤维素基的膜、凝胶或树脂)或者可用糖溶液包被或处理，以产生适当的活性表面。对于每种类型的载体，指示物可以在增强结合和/或稳定结合蛋白质的溶液中配制。这样的制剂包括包含多至10%(w/v)蔗糖、山梨醇、甘露糖、纤维素或聚乙二醇(PEG)的溶液。此外，指示物可以被配制为施加在合适载体的表面或腔内的凝胶的一部分。实例包括藻酸盐、琼脂或聚丙烯酰胺基质。指示物也可以包括稳定指示物的剂，并且合适的稳定剂选择金属离子、糖、糖醇和凝胶形成剂。为了便于指示物的应用，指示物还可以包括将固体载体连接到表面的工具，例如，通过螺丝钉、螺母和螺栓、或者夹子连接载体到表面的突出物、凹口或孔。包含生物指示物的试剂盒在本发明的第二方面，提供了试剂盒，用于验证其中样品中的污染物的量或活性被降低的处理过程，所述试剂盒包含12⑴根据本发明第一方面的生物过程指示物，和()热稳定激酶的底物。为了对激酶量/活性进行测定，试剂盒可以包括检测ATP的工具，例如萤光素/萤光素酶和任选的发光计。在一个实施方式中，热稳定激酶的底物是ADP。从前面的对已知污染物的试验中，可以得出将污染物的量或活性的降低程度与激酶活性相关联的数据，试剂盒从而也可以包括将激酶活性与一系列指定的污染物的量或活性的降低程度相关联的一个或多个查询表(look-uptables)。在一个实施方式中，试剂盒用于检测TSE失活。在进一步实施方式中，试剂盒用于监测诺罗病毒(noroviras)失活。生物指示物的用途在第三方面，本发明提供使用与生物成分共价连接的热稳定激酶作为生物过程指示物，用于验证降低样品中的污染物的量或活性的处理过程。在一个实施方式中，生物过程指示物根据本发明的第一方面进行配制。在本发明的具体用途中，根据本发明第一方面的指示物是指示在清洗或失活步骤后污染物(例如感染因子)可能存在的方法中的报道分子。首先，包含指示物的样品被暴露于清洗/灭活步骤(例如，选定的温度、pH或蛋白酶浓度的一种或多种)。接着的步骤是通过热处理去除任何污染酶活性，例如在60°C至80°C下至少10分钟(即，在不显著影响热稳定激酶的条件下)。指示物然后在30°C至70°C之间的温度下与底物(例如，ADP)反应，以使生成ATP。ATP的形成可以通过使用萤光素/萤光素酶和合适发光计的生物发光检测，在20°C-30°C下测量10分钟至1小时。从发光计读出的光输出给出残留激酶活性的读数，即，在暴露于清洗/灭活处理后的激酶活性。基于先前源于单独试验的数据，通过将残留激酶活性与处理样品内的污染物的可能存在相关联，完成该方法。在一个实施方式中，样品中的污染酶活性或ATP可以通过开始的处理步骤去除(例如，选定的温度、pH或蛋白酶浓度)，然后加入指示物。现在描述应用本发明指示物监测/验证多种过程。在一个实施方式中，应用指示物验证生物洗涤制备物在洗涤循环中的性能。虽然洗涤循环的验证将潜在地在家庭环境下应用，但其最有优势的用途将是在卫生保健、药物或食品制备环境中，例如，用于验证与遭受或暴露于感染因子(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或诺瓦克病毒/诺沃克类病毒发作)的患者相关的床上用品、外衣或其它物品的去污。在本文中，本发明的指示物的优势是，它与生物材料如血液或其它体液相关。为了验证洗涤循环，指示物可被交联在柔性棒(flexiblewand)、布条(stripofcloth)或适于包含在循环中的其它材料上。将指示物放入具有加载物的剩余物的洗涤器中。在一个实施方式中，可以将指示物固定在洗涤器内部上合适的储存器中，以便于其回收。随后进行洗涤循环，并且在对加载物进行任意的进一步操作或处理之前，去除指示物并评价指示物，其中应用已被校准“读数器(reader)”，以表示指示物中可接受水平的残余激酶活性——可接受水平来自对过程中的合适洗涤性能的在前校准和评定。这种评定可能包括污染物的总水平和微生物的可生存数，如应用暴露于技术人员已知的合适的模型生物所评定的。根据校准的读数，加载物被进行进一步处理，或重复洗涤循环。在第二种实施方式中，应用指示物验证失活病毒的过程。环境中活病毒分离物的检测是成问题的，特别是在与对速度和精确性要求严格的紧急情况相关时。本发明提供了开发使能够基本上实时监测去污步骤的指示系统的可能性。这对于在病毒因子爆发(例如，诺沃克类病毒)或蓄意释放(如天花)后，卫生保健和相关设备的表面去污是特别有价值的。验证病毒失活过程的指示物可以采取多种不同形式，例如，用于监测喷洒或浸渍有杀病毒剂的区域的棒或浸渍片，或者用于监测气相去污过程的悬浮指示物。可选地，指示物可以在去污之前被喷洒在表面上，随后通过擦拭该表面评定残余激酶活性水平。在本发明的进一步的实施方式中，应用指示物验证细菌蛋白毒素、植物毒素如蓖麻毒蛋白和其它毒性蛋白质、肽或肽类似物的蛋白酶降解。蛋白酶表现出降解宽范围蛋白毒素的潜能，所述蛋白毒素是潜在的生物战/生物恐怖袭击制剂，包括肉毒杆菌毒素、炭疽毒素和蓖麻毒蛋白。它们也具有失活宽范围的其它潜在毒性或有害蛋白或肽制剂的潜能，使得能够对表面/设备去污或对物质进行安全处理。在本文中，本发明的指示物与待去污的表面/物质一起接受蛋白酶去污过程。在该过程的最后，根据本发明方法评定指示物的残余激酶活性。随后将残余激酶活性水平与特定蛋白毒素或毒素组的失活指数相关联。假定活性水平等于或低于限定的指数值，则物质可以被安全地处理或者表面/设备被返回使用。在一个实施方式中，将合适的安全极限设置在失活指数的校准中，以允许过程性能的任何变化。本发明中应用的酶的附加稳定性使其比宽范围的其它酶指示物更确定地和更大动态范围地进行，所述其它酶指示物包括来自“热稳定”生物如嗜热脂肪杆菌芽孢的指示物，如显示来自嗜热性生物的AKs的相对热稳定性的数据所示(图1，实施例2)。也可以用指示物验证洗净药物生产设备的蛋白酶去污过程。各种各样的药物产品应用来自人或动物的材料，所述材料可能受到各种各样因子的污染，包括脘病毒(TSE)因子和病毒(例如，西尼罗病毒、肝炎病毒、HIV)。当材料来源是动物源(例如胎牛血清、马免疫球蛋白)和中间处理阶段可带有增加特定样品中未鉴定病原体浓度的风险时，风险可被加重。在制造批次之间应用蛋白酶洗净制造设备和装置(例如，色谱柱、容器、管)的可能性有降低或消除这种风险的潜能，这甚至在污染物没有被正式鉴定时。这对脘病毒因子是特别可靠的，例如，具有将感染因子积累和携带进最终产物的显著风险的血液分馏设备中的脘病毒因子。为了验证这种类型的过程，本发明的指示物理想地被配制为待浸入蛋白酶处理液的浸渍片，或者与待清洁设备排列连接的药筒(cartridge)。通过在处理后评定指示物器件中残余激酶活性水平，并将其与可接受的清洁水平相关联，可以开发快速和性能可靠的监测器。在本发明的另一实施方式中，应用指示物验证污染物如TSE的气相失活。臭氧或其它气相杀菌剂失活这种污染物的潜能被大量的出版物和文章所建议，14但是，没有方法明确表现出是有效的。为了支持此气相技术的开发和引入卫生保健中，将需要验证该技术的性能的方法。由于因子如TSE已经表现出远比传统的病毒或细菌因子对这种形式的失活更具耐性，目前可利用的验证气相失活的方法未必合适。本发明解决此问题。对于这种类型的验证，通过任何适当方法将指示物连接在固体载体上，例如，普通吸附和通过酰胺、肽、羰基或半胱氨酸键的化学交联。例如，对于臭氧灭菌，可以应用刚性的聚氯乙烯(PVC)、玻璃、钢、聚酰胺或聚丙烯载体，指示物通过以前描述的任一化学方法偶联于载体。随后将指示物包含在待灭菌的一批材料/器械中，暴露于臭氧，并针对设计用来评价怀疑因子相应失活的适当校准的失活指数进行评定。成功的失活使得能够继续加工或使用该材料/器械。指示物可以可选地被连接于管的内表面或相当的内部空间，以便气体渗透受到限制。这提供了监测器，其适于评定气体渗透入带有腔的器械的相当空间、或渗透通过填塞的材料装载物。可选地，可以将指示物连接于多孔材料如聚苯乙烯珠子，或者可以将其固定在凝胶或树脂中。在本发明的进一步的实施方式中，应用指示物验证液体化学灭菌系统(例如，Endoclens)，如用于内窥镜和相关器械的处理。宽范围的内窥镜常规用于医疗中，是医学诊断和治疗的重要部分。这些器械极度敏感并且对于常规清洁和消毒具有非常显著的问题。传统地，和在目前的实践中仍然存在的，在用低温方法去污之前手工清洁内窥镜。已经开发出一些化学消毒剂和自动再处理装置以解决对器械如内窥镜的敏感部件去污的具体问题，在这里传统的高压灭菌是不可能的。这些方法有助于降低难于清洁器械上的污染水平，该污染水平与宽范围的病毒和细菌病原体的医源性传播相关。目前验证这种过程的方法是，监测洗涤溶液的流速和温度。本发明的指示物提供了验证的进一步方法，所述方法提供了内窥镜腔内实际清洁效率的读数。对于这种类型的验证，指示物被连接于管的内表面，该管被设计为具有和内窥镜管相似的总内径。此指示装置被串联连接于自动再处理装置上的内窥镜。随后用通常的方式处理内窥镜。在处理最后，优选地在将内窥镜从装置中移去之前，分离指示物并评定残余的激酶活性水平。可以将活性水平与先前限定的该过程的可接受性能的阈值相关联，并根据该评定结果，可以将内窥镜转移用于额外的清洁或去污，或准备应用。如果性能水平不足，则可以用如前述连接的新的指示物再次处理该器械(用相同和更严格的条件)。指示装置也适于验证内窥镜和/或任何其它带有腔的器械的手工清洁。在本发明的进一步实施方式中，使用指示物监测洗涤器-消毒器中的常规清洁性能，如在医院中应用的那些洗涤器-消毒器。在本发明的另一实施方式中，应用指示物监测戊二醛或邻苯二醛(ortho-phthaldehyde)(OPA)处理。多年来，戊二醛和甲醛已经被广泛用作杀菌剂。化学消毒剂通过以非特异性方式多重交联蛋白质，以破坏其功能而起作用。近来，邻苯二醛(OPA)作为此家族的新的消毒剂出现，并且由于它避免了与戊二醛相关的一些毒性问题而被广泛应用。本发明的指示物适于监测所有这种类型的化学消毒剂，原因是激酶对这种类型的非特异性交联敏感。指示物可被共价连接于合适的表面并与待灭菌的其它物品一起暴露于化学杀菌剂。该过程的效率通过测定指示物的残余酶活性来评定。将此活性与表明该过程正确性能的限定阈值相比较。不同类型激酶的应用可以为该过程提供附加的灵敏度或敏感性，如不同应用中可能所需要的。本说明书中描述的热稳定腺苷酸激酶可以根据其分子结构被广义地归为两类。因此，来自硫化叶菌属某种的酶是具有含中心疏水核心的三聚结构的酶的例子，所述中心疏水核心是维持其在高温下活性的主要决定因素。第二类酶是单体酶，由来自热袍菌属(Thermotoga)某种的腺苷酸激酶示例，但是其具有略长的多肽链，所述多肽链带有影响活性部位的附加的“盖(lid)”结构域。这些不同类型的热稳定酶将对这类化学杀菌剂表现出不同的敏感性，这是由于在酶作用期间它们的肽链的可变柔性。对于任何特定的杀菌剂和/或浓度，经验筛选将鉴定出具有适当敏感性的酶，用于监测和验证这些类型的化学制品。在本发明的进一步实施方式中，应用指示物作为环氧乙烷、过氧化氢或其它气相过程的超高速读出监测器(ultra-rapidread-outmonitor)。目前，宽范围的气相杀菌剂被许多制造商用于细菌和病毒因子的常规消毒。目前方法利用气体的氧化性质破坏肽键。因此，本发明的激酶，由于它们的坚韧的理化性质，对提供非�？焖俚氖Щ疃脸鍪抢硐氲�。本实例中的指示物与先前描述的那些指示物相似，例如，与因子如TSE的臭氧失活相关的指示物。杀菌和除污染过程的特别有挑战性的问题是验证大量液体无菌的能力，如在制造多种药品或其它药物产品中可能是必需的。虽然目前的方法监测特定过程的温度、时间、和/或压力参数(根据其精确性质)，但验证大量液体中的实际杀菌情况的可利用方法极少——如果存在这类方法的话。这在甚至约1升体积内是困难的，而在更大体积下几乎是不可能的。本发明提供了许多解决此问题的可能方案。在其最简单的形式中，可以将指示物加入待灭菌的液体中，指示物的浓度适于在过程最后测定激酶失活的限定水平和使该水平等同于灭菌水平。虽然这在某些类型的过程中可能不是所希望的，但激酶的惰性性质和等效酶活性在所有生物中的普遍存在，使其可以接受。可接受性可以通过下列事实得到改进许多热稳定酶是高度凝聚的，因此在接种到动物中之后具有非常低的免疫原性。当这种直接添加不可接受时，可以将指示物加入到透析袋中大量液体、多孔容器中、或固定在合适的载体上，使得没有指示物部分被释放到大量液体中，但是灭菌条件以对全部样品相同的方式在指示物上起作用。包含或固定蛋白质、以允许液体样品全面扩散但是限制指示物样品移动的宽范围的可能方法，是本领域技术人员已知的。可能的实例包括但不限于透析膜、Visking管(Viskingtubing)、多孔膜、蛋白结合树脂、刚性凝胶或固体载体，如对所论述的其它指示物所描述的。可以用前述任一方法，将指示物连接于表面，或仅包封在合适的膜中而不连接，使得可以在过程完成时将指示物简单地从大量液体中移出。验证处理过程的方法在第四方面，本发明提供验证用于降低样品中污染物的量或活性的处理过程的方法，包括以下步骤16(a)获得包含或者怀疑包含污染物的样品；(b)在限定量的与生物成分共价连接的热稳定激酶存在的情况下，进行样品处理过程；(c)测定残余的激酶活性和任选地计算激酶活性的降低程度；和(d)将所述残余激酶活性与预先确定的激酶活性相比较，或者将激酶活性的降低程度与预先确定的激酶活性降低程度相比较，其中所述预先确定的激酶活性或预先确定的激酶活性降低程度相应于在相同处理条件下所述污染物量或活性的确认的降低程度。有可能在步骤(a)中的样品可以根本不包含任何污染物。在进行处理后，验证的点是，确认可能存在的任何因子已经被去除/失活至可接受的程度。然而，一般而言，已知样品包含或者怀疑包含污染物。在一个实施方式中，方法的步骤(b)中使用的热稳定激酶被配制为根据本发明第一方面的指示物。在另一实施方式中，步骤(C)中的残余激酶活性通过加入包含ADP的底物到残余激酶并测量ATP形成进行测量。ATP形成可以通过使用萤光素/萤光素酶和合适发光计的生物发光检测进行测量。典型地，操作者在处理样品之前和处理样品之后测定激酶活性。污染的激酶，通常是嗜温性激酶，可以在激酶活性分析之前进入样品也是可能的。因此，在本发明的一个实施方式中，分析包括失活嗜温性激酶的步骤，如在测定残余激酶活性之前，在70°C处理样品至少30分钟、或在80°C至少10分钟。在一个实施方式中，在萤光素/萤光素酶存在的情况下用发光计检测时，激酶在处理之前的活性是每毫克激酶至少10,000,000相对光单位(RLU)，或者每毫克激酶至少8,000,0(K)RLU，或者每毫克激酶至少5,000,0(K)RLU，或者每毫克激酶至少3,000,000RLU,或者每毫克激酶至少1,000,000RLU，或者每毫克激酶至少500,000RLU。在本发明的另一个实施方式中，预先确定的激酶活性小于每毫克激酶10,000RLU,或者小于每毫克激酶1000RLU，或者小于每毫克激酶500RLU，或者小于每毫克激酶250RLU，或者小于每毫克激酶100RLU，或者小于每毫克激酶10RLU，或者小于每毫克激酶1RLU，或者是每毫克激酶0RLU。在本发明的进一步的实施方式中，预先确定的激酶活性降低程度等于或大于激酶活性1个对数级的降低(llogreduction)，或者2个对数级的降低，或者3个对数级的级降低，或者4个对数级的降低，或者5个对数级的降低，或者6个对数级的降低，或者7个对数级的降低，或者8个对数级的降低，或者9个对数级的降低。在另一个实施方式中，预先确定的激酶活性降低程度相应于激酶的量或浓度3个对数级的降低，或者6个对数级的降低，或者7个对数级的降低，或者8个对数级的降低，或者9个对数级的降低。在进一步的实施方式中，预先确定的激酶活性降低程度相应于RLU降低至少800,000，或至少900,000，或至少950,000，或至少990,000，或至少999,000，或至少999,900，或至少999,990，或至少999,999RLU。在本发明的还另一个实施方式中，样品中污染物量或活性的确认降低程度是至少3个对数级(log)、6个对数级、优选地至少7个对数级、更优选地至少8个对数级、最优选地至少9个对数级。在本发明的另一个实施方式中，持续处理直至残余的激酶活性或激酶活性降低程度相应于至少3个对数级、至少6个对数级、或至少7个对数级、或至少8个对数级、或至少9个对数级的污染物量或活性的确认降低程度。在发明的一个实施方式中，方法还包括在合适的数据载体上记录在步骤(C)中获得的数据的步骤。相关联的方法在第五方面，本发明提供将样品中污染物的量或活性的降低程度与根据本发明第一方面描述的生物过程指示物的激酶活性相关联的方法。该方法包括⑴制备包含限定量的污染物的样品和包含限定量的根据本发明的第一方面的指示物的样品，或者制备包含限定量的污染物和限定量的根据本发明的第一方面的指示物的单一样品；()进行一个或多个样品的处理；(iii)测定残余的指示物激酶活性，和任选地计算激酶活性的降低程度；(iv)测定污染物的残余量或残余活性，和任选地计算污染物的量或活性的降低程度；(ν)重复步骤⑴至(v)，其中改变至少一个处理参数。在一个实施方式中，处理参数包括时间、温度、pH、压力、蛋白酶浓度、和杀菌剂或去污剂浓度中的一种或多种。在一个特定的实施方式中，处理包括在50-140°C、或80-100°C、或134-138°C下加热样品(一种或多种)；处理参数是时间；和使样品(一种或多种)经历所述处理1、5、10、20、40和60分钟时段，重复步骤(i)至(iv)。在进一步的实施方式中，处理包括将样品(一种或多种)暴露于pH9_14或pH12或更高、或约pH12;处理参数是时间；和使样品(一种或多种)经历所述处理1、5、10、20、40和60分钟时段，重复步骤(i)至(iv)。在另一个实施方式中，处理包括将样品(一种或多种)暴露于浓度为0.5-2mg/ml、或约lmg/ml、或约2mg/ml的蛋白酶；处理参数是时间；和使样品(一种或多种)经历所述处理1、5、10、20、40和60分钟时段，重复步骤(i)至(W)。上述方法使得能够制备校准数据，以用于对包含或怀疑包含污染物的样品的处理进行验证的指示物的将来应用。许多处理过程的校准在W02005/093085中描述。定义部分术语“污染物”包括源于生物源的感染因子和非感染因子。污染物的实例包含细菌、病毒、真菌、脘病毒、毒素、变应原、芽孢、以上列出作为生物成分的任一的因子(剂)、和任一前述的片段和衍生物。在本发明的情况中，污染物也可以称为污染生物因子(剂)。术语“交联”指通过一个或多个共价键连接两个实体。交联可以是化学的或者基因的。基因交联包括制备为融合蛋白的指示物。术语“样品”包括任何物品、器械、表面、流体或材料。实例包括但不限于临床样品(例如全血，血清，口腔样品如唾液，脓，阴道样品，大便样品，呕吐物)、环境样品(如水、土壤、空气样品)、外科器械和医疗器械、微孔板、浸渍片、侧流式设备、医院衣物、大量液体、去杂的动物材料、药品、工作台、墙壁和地板、生物基质(biologicalmatrices)。术语“处理(treatment)”或“处理过程(treatmentprocess)”包括设计用来降低样品中污染物的量或活性的任何过程。合适的处理包括下列中的一种或多种选择的pH(例如，低于pHl、2、3、4、5、6或7，或高于pH7、8、9、10或11，或约pH12)、温度(例如，至少40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C、100°C>110°C、120°C>130°C>140°C>I5OO或160°C，或在5O-I2OO之间)或压力(例如，至少50kPa、70kPa、lOOkPa、150kPa>200kPa或250kPa)，将样品暴露于蛋白酶或其它水解酶，将样品暴露于去污剂、化学杀菌剂、辐射、自由基或气相杀菌剂。在一个实施方式中，将处理设计为降低感染性生物污染物如TSE的感染活性(也称为感染性(传染性))。术语“处理”或“处理过程”也包括清洁和失活过程，如利用湿或干蒸气的高温高压灭菌、臭氧灭菌、H2O2灭菌、精炼(rendering)或设计用于消除或失活污染物的其它方法。在本发明的另一个实施方式中，指示物和污染物都直接暴露于处理过程，即，在指示物/污染物和处理过程之间没有密封或屏障。指示物和污染物因此都与处理过程直接接触，和经受相同的处理条件。术语“生物成分”包括可以与激酶共价连接的任何生物分子。生物成分可以选自蛋白质、核酸、脂类或糖类。生物成分合适地是待处理的样品中的污染物的模拟或替代，并且因此以与污染物基本相同的方式对处理过程反应。在一个实施方式中，对于在本说明书中公开的每一种污染物和生物成分，生物成分可以与经受处理过程的样品中的污染物相同，但是与其物理上不同，例如，如果污染物是蛋白质，那么生物成分也是蛋白质；如果污染物是血液蛋白质，那么生物成分也是血液蛋白质；如果污染物是DNA分子，那么生物成分也是DNA分子；如果污染物是RNA分子，那么生物成分也是RNA分子，等等。在另一个实施方式中，生物成分不同于污染物。在本发明的一个实施方式中，生物成分不是肽、蛋白质、或多肽。在本发明的进一步的实施方式中，生物成分不是寡核苷酸(对HPV16特异的寡核苷酸探针)。在本发明的还另一个实施方式中，生物成分不是凝集素、生长因子、DNA/RNA适配体、噬菌体或者对分析物特异性的结合因子。术语“蛋白质”包括任何含有蛋白质或肽的分子。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本说明书中可以互换使用。术语“血液蛋白”包括在血液中存在的任何蛋白质。特定的实例包括凝血蛋白(例如，凝血因子I、血纤蛋白肽、血纤蛋白、转谷氨酰胺酶底物、凝血酶)、血清蛋白(例如，清蛋白和球蛋白)、血小板、血细胞糖蛋白和血红蛋白。术语“细菌蛋白”包括源于细菌的任何蛋白质。具体实例包括细菌菌毛蛋白(例如，来自大肠杆菌的CgsA和来自沙门氏菌的AgfA)、细菌毒素蛋白(例如，来自炭疽杆菌、白喉棒状杆菌、肉毒杆菌的毒素)、细菌细胞表面蛋白(例如，来自活性淤泥中的絮凝物形成和丝状细菌的细胞表面黏附素、肽聚糖、脂蛋白)和细菌芽孢蛋白(例如，来自革兰氏阳性细菌并具有与Clostridumtaeniosporum中的形成带状附器的蛋白质、来自链霉菌属某些种的chaplin蛋白A-H以及rodlin蛋白RdlA和RdlB类似的序列或者总体结构)。19术语“病毒蛋白”包括源于病毒的任何蛋白质。具体实例包括病毒外壳蛋白、病毒包膜蛋白、病毒衣壳蛋白和病毒核心蛋白。在一个实施方式中，病毒蛋白来自于噬菌体病毒(例如，MS2和PP7外壳蛋白)、诺瓦克病毒(例如，衣壳蛋白)、轮状病毒(例如，VP2、VP6和VP7蛋白)、冠状病毒(例如，SARSS、E和M蛋白)、蓝舌病毒(例如，VP2蛋白)、人乳头状瘤病毒(例如，病毒主结构蛋白，Li)、乙型肝炎病毒(例如，小包膜蛋白HBsAg)、丙型肝炎病毒(例如，核心蛋白，El和E2蛋白)、流感病毒(例如，神经氨酸酶和血细胞凝集素以及基质蛋白)、脊髓灰质炎病毒(例如，衣壳VPO、1和3蛋白)、HIV(例如，Pr55gag，包膜蛋白)和登革热B(例如，包膜和预膜/膜(prM/M)。术语“真菌蛋白”包括源于真菌的任何蛋白质。具体实例包括疏水蛋白(例如，来自裂褶菌的SC3、来自烟曲霉的RodA/B和来自酵母的等效蛋白质)、真菌芽孢蛋白、菌丝蛋白、真菌毒素和真菌朊病毒(例如，Sup35、HetS>Ure2、RnqUNewl)。术语“自-聚集蛋白质”包括能够自聚集或自组装成淀粉样原纤维或表面活性生物膜的任何蛋白质。具体实例包括朊病毒(例如，PrP和PrP\HetS、Ure2、RnqUNew1),阮病毒模拟蛋白、淀粉样原纤维、来自活性淤泥中的絮凝物形成和丝状细菌的细胞表面黏附素、β淀粉样蛋白、Tau蛋白、多腺茄碱结合蛋白、肺表面活性蛋白C、来自大肠杆菌的CsgA蛋白、来自沙门氏菌属某种的AgfA蛋白、细菌菌毛蛋白、脱脂载脂蛋白(例如，脱脂载脂蛋白Al)、来自真菌属某种的疏水蛋白(例如，来自裂褶菌的SC3、来自烟曲霉的RodA/B)、chaplins(例如，来自链霉菌属某些种的ChpsA_H)、r0dlinS(例如，来自链霉菌属某些种的RdlA和RdlB)、革兰氏阳性芽孢外壳蛋白(例如，P29a、P29b、GP85和SpoVM类似物)和藤壶胶样蛋白(例如，来自白脊藤壶的19kDa蛋白、和来自红巨藤壶的20kDa蛋白以及来自白脊藤壶的新方解石依赖的胶样蛋白质)。术语“核酸”包括任意长度或组成的核苷酸聚合物。具体实例包括DNA分子和RNA分子。在一个实施方式中，核酸选自单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链DNA(dsDNA)或双链RNA(dsRNA)。在另一个实施方式中，所述分子源自神经组织。术语“糖类(糖)”包括任何包含糖的分子。具体实例包括外泌多糖、脂多糖(EPS/LPS,有时称为内毒素)(例如，来自军团杆菌属、大肠杆菌、葡萄球菌属某种、链球菌属某种、假单胞菌属某种、不动杆菌属某种、弯曲杆菌属某种和芽孢杆菌属某种)、肽聚糖、植物、真菌和酵母的细胞壁成分(例如，壳多糖、木质素、葡聚糖)、黏蛋白制备物、糖脂(特别是脑源性糖脂)、糖蛋白(例如，细胞表面糖蛋白，Eaplp)、芽孢提取物(例如，来自芽孢杆菌属某些种、梭菌属某些种和其它芽孢前体)、来自酵母被膜的多糖和无脊椎动物分泌物(例如，来自软体动物凝胶)。术语“脂类”包括任何包含脂的分子。具体实例包括糖脂(例如，脑源糖脂)、神经节苷脂(例如，GTlb、GTla和GM1)和植物油和脂。“转谷氨酰胺酶底物”是为转谷氨酰胺酶底物的任何分子。转谷氨酰胺酶是催化在游离胺基(例如，结合蛋白质或肽的赖氨酸)和结合蛋白质或肽的谷氨酰胺的Y-酰胺基(carboxamidgroup)之间形成共价键的酶家族(EC2.3.2.13)。这类酶的实例包括因子VIII、角质形成细胞转谷氨酰胺酶和组织转谷氨酰胺酶。血纤蛋白是转谷氨酰胺酶底物的一个实例，其通过因子VIII作用。“生物基质或混合物”可以包括选自蛋白质、脂类、核酸和糖类的一种或多种成分。在一个实施方式中，它可以是蛋白质的混合物，或可以包括血液、血清、粘液、卵、神经组织、食品或者去杂的动物材料中的一种或多种。生物基质或混合物也可以是商业可得的测试污染物，如Browne污染物或者Edinburgh污染物。在一个实施方式中，生物基质/混合物具有与其中污染物存在的基质/混合物类似的组成。在本发明的情况中，生物基质也可以称为测试污染物。作为污染物的“模拟(模拟物)”或“替代(替代物)”的生物成分是以与污染物非常类似(或者基本相同)方式对处理过程进行反应的成分。类似地，作为样品的“模拟”或“替代”的生物基质是具有与样品类似组成的基质，并且其以基本相同方式对处理过程进行反应。术语“抗体”包括全长免疫球蛋白和其所有的片段及衍生物，例如免疫球蛋白的重链、轻链、恒定区、可变区、Fab区、Fc区等。术语“血纤蛋白”包括所有的血纤蛋白-衍生的肽。这包括全长血纤蛋白肽和其所有的片段及衍生物。它包括所有具有血纤蛋白活性的肽，例如，通过因子VIII作用以形成凝块的肽。术语血纤蛋白或血纤蛋白肽在整个本说明书中与术语“转谷氨酰胺酶底物”可以互换使用。术语“光输出”指通过ATP与生物发光试剂反应发出的光。该光输出可以使用完全常规技术进行检测，例如标准的发光计(例如，BertholdOrion96-孔微孔板发光计，或手持发光计)。术语“报道激酶”指在被测试样品中不固有存在的激酶，即，激酶对于样品是外源的。报道激酶作为单独的试剂加入样品，例如，作为分离的激酶。在一个实施方式中，报道激酶是热稳定的。术语“热稳定激酶”指在暴露于热之后仍保留活性的激酶，即，其相对不受高温影响。在本发明的一个实施方式中，在暴露于50-120°C之间的温度后，热稳定激酶保留至少70%活性(或80%活性、90%活性、95%活性、或100%活性)。在另一个实施方式中，在暴露于40°C30分钟后、或暴露于50°C30分钟后、或暴露于60°C30分钟后、或暴露于70°C30分钟后、或暴露于80°C20分钟后、或暴露于90°C10分钟后、或暴露于120°C3分钟后，热稳定激酶保留至少70%活性(或80%活性、90%活性、95%活性、或100%活性)。热稳定激酶对于一系列常规损伤或破坏蛋白质或使它们失活的其它生化和物理过程也可以比非热稳定激酶更有耐性，例如，暴露于某些化学制品，如离液剂、自由基损伤、去污剂、极端pH、暴露于蛋白酶、蛋白交联、非渗透性或者半渗透性膜或聚合物内的包囊作用、或者不可逆固定于表面之上。在特定的实施方式中，在暴露于以上描述的生化和物理过程中的一种或多种之后，热稳定激酶保留至少70%活性(或80%活性、90%活性、95%活性、或100%活性)。在所有的情况中，该“保留活性”可以使用常规检测容易地确认。简单地说，激酶在给定处理条件下与ADP—起温育给定量的时间，然后通过使用萤光素/萤光素酶和发光计检测ATP生成来分析残留的活性。根据这个，处理后保留的激酶活性％可以被测定。术语“激酶”和“激酶活性”在该整个说明书中可互换使用。术语“生物发光试剂”指能够与ATP反应产生光的任何物质或者物质的混合物，例如，萤光素和萤光素酶的混合物。术语“RLU”意味着相对光单位(RelativeLightUnit)。相对光单位是相对的，不是绝对的测定值。说明书中给出的图涉及用带有进样系统的BertholdOrion96孔微孔板发光计，用“闪光型(flash)”光测定法取得的测定值，该测定值在加入萤光素/萤光素酶试剂后2秒钟立刻测得(光电倍增管的技术规范测定在波长300-650nm发射的光)。为了解决此问题，制造商生成了用于RLU“因数”的数据，这使得能够针对校准过的标准品对给定发光计产生的数据进行标准化。因此，可以在不同器械间进行比较。BertholdOrion96孔微孔板发光计的RLU因数是1。因此，本说明书给出的RLU值可以被认为是标准化的/归一化的RLU值。关于绝对值，RLU值可以与使用方法中描述的试剂给出所述值所需的ATP浓度相关。作为近似的转化，和给出RLU值和ATP浓度之间的线性关系，可以应用下列值权利要求1.验证处理过程的生物过程指示物，在所述处理过程中样品中的污染物的量或者活性降低，其中所述指示物包括与生物成分共价连接的热稳定激酶，条件是所述生物成分不是抗体。2.根据权利要求1所述的生物过程指示物，其中所述生物成分选自蛋白质、核酸、脂和糖。3.根据权利要求2所述的生物过程指示物，其中所述蛋白质选自血液蛋白质、细菌蛋白质、病毒蛋白质、真菌蛋白质、和自聚集蛋白质。4.根据权利要求3所述的生物过程指示物，其中所述血液蛋白质选自凝血蛋白、血清蛋白、血小板蛋白、血细胞糖蛋白和血红蛋白。5.根据权利要求4所述的生物过程指示物，其中所述凝血蛋白选自血纤蛋白、凝血因子I和转谷氨酰胺酶底物。6.根据权利要求3所述的生物过程指示物，其中所述细菌蛋白选自细菌菌毛蛋白、细菌毒素蛋白、细菌细胞表面蛋白和细菌芽孢蛋白。7.根据权利要求3所述的生物过程指示物，其中所述病毒蛋白选自病毒衣壳蛋白、病毒包膜蛋白和病毒核心蛋白。8.根据权利要求7所述的生物过程指示物，其中所述病毒蛋白来自噬菌体病毒、诺瓦克病毒、轮状病毒、冠状病毒、蓝舌病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎或丙型肝炎病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、HIV病毒和登革热B病毒。9.根据权利要求3所述的生物过程指示物，其中所述真菌蛋白选自疏水蛋白、真菌芽孢蛋白、菌丝蛋白、真菌毒素和真菌朊病毒。10.根据权利要求3所述的生物过程指示物，所述自聚集蛋白选自朊病毒、朊病毒模拟蛋白、淀粉样原纤维、来自活性淤泥中的絮凝物形成和丝状细菌的细胞表面黏附素、β淀粉样蛋白、Tau蛋白、多腺茄碱结合蛋白、单纯疱疹病毒糖蛋白B、肺表面活性蛋白C、细菌菌毛蛋白、脱脂载脂蛋白、疏水蛋白、chaplins、rodlins、革兰氏阳性芽孢外壳蛋白和藤壶胶样蛋白。11.根据权利要求2所述的生物过程指示物，其中所述核酸选自DNA分子或RNA分子。12.根据权利要求2所述的生物过程指示物，其中所述糖选自外泌多糖、脂多糖、肽聚糖、壳多糖、葡聚糖、木质素、黏蛋白、糖脂、糖蛋白、芽孢提取物、来自酵母被膜的多糖和无脊椎动物分泌物。13.根据权利要求2所述的生物过程指示物，其中所述脂选自糖脂和神经节苷脂。14.根据任何前述权利要求所述的生物过程指示物，其中所述指示物是生物基质的部分。15.根据权利要求14所述的生物过程指示物，其中所述生物基质是所述样品的模拟。16.根据权利要求14或15所述的生物过程指示物，其中所述生物基质包括选自血液、血清、清蛋白、粘液、卵、神经组织、食物、去杂的动物材料和商业可得的测试污染物的一种或多种成分。17.根据任何前述权利要求所述的生物过程指示物，其中所述污染物选自蛋白质、核酸、脂和糖。18.根据任何前述权利要求所述的生物过程指示物，其中所述热稳定激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶。19.根据任何前述权利要求所述的生物过程指示物，其中所述指示物还包括稳定所述激酶的剂。20.根据权利要求19所述的生物过程指示物，其中所述稳定剂选自金属离子、糖、糖醇或者凝胶形成剂。21.根据任何前述权利要求所述的生物过程指示物，其中所述生物成分和所述激酶以融合蛋白的形式连接在一起。22.根据任何前述权利要求所述的生物过程指示物，其中所述生物过程指示物被固定在固体载体中或固体载体上。23.根据权利要求22所述的生物过程指示物，其中所述生物过程指示物通过化学交联或吸附固定在所述固体载体中或所述固体载体上。24.根据权利要求22或23所述的生物过程指示物，其中所述固体载体是指示物条、浸渍片或珠子。25.用于验证其中样品中的污染物的量或者活性降低的处理过程的试剂盒，包括(a)根据权利要求1-24任一项所述的生物过程指示物，和(b)用于热稳定激酶的底物。26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中用于所述热稳定激酶的所述底物是ADP。27.根据权利要求25或26所述的试剂盒，还包括萤光素/萤光素酶。28.根据权利要求25-27任一项所述的试剂盒，还包括将所述指示物的激酶活性与所述污染物的量或活性相关联的查询表。29.与生物成分共价连接的热稳定激酶作为生物过程指示物的用途，其验证降低样品中的污染物的量或活性的处理过程。30.根据权利要求1-24任一项所述的生物指示物的用途，用于验证降低样品中的污染物的量或活性的处理过程。31.验证降低样品中的污染物的量或活性的处理过程的方法，其包括下列步骤a)获得包含或怀疑包含污染物的样品；b)在限定量的包含与生物成分共价连接的热稳定激酶的生物过程指示物存在的情况下，对所述样品进行处理过程；c)测定残余的激酶活性和任选地计算激酶活性的降低程度；和d)将所述残余激酶活性与预先确定的激酶活性比较，或者将所述激酶活性的降低程度与预先确定的激酶活性降低程度比较，其中所述预先确定的激酶活性或所述预先确定的激酶活性的降低程度相应于在相同处理条件下所述污染物的量或活性的确认的降低程度。32.根据权利要求31所述的方法，其中步骤(b)中的所述生物过程指示物是根据权利要求1-24任一项所述的生物过程指示物。33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述预先确定的激酶活性降低程度是至少3个对数级降低、或至少6个对数级降低、或至少7个对数级降低、或至少8个对数级降低。34.根据权利要求31-33任一项所述的方法，其中所述污染物的量或活性的所述确认的降低程度是至少3个对数级降低、或至少6个对数级降低、或至少7个对数级降低、或至少8个对数级降低。35.根据权利要求31-34任一项所述的方法，包括在处理所述样品之前和处理所述样品之后测量激酶活性。36.根据权利要求31-35任一项所述的方法，包括在测量所述激酶的残余活性之前，在80°C下处理所述样品至少10分钟。37.根据权利要求31-36任一项所述的方法，其中测量所述激酶的残余活性包括加入包含ADP的底物到所述残余激酶并测量ATP的形成。38.根据权利要求31-37任一项所述的方法，包括继续所述处理直至所述残余激酶活性或所述激酶活性降低程度相应于至少3个对数级、或至少6个对数级、或至少7个对数级、或至少8个对数级的所述污染物的量或活性的确认的降低程度。39.根据权利要求31-38任一项所述的方法，还包括在合适的数据载体上记录步骤(C)中获得的数据的步骤。全文摘要提供用于验证处理过程的生物过程指示物，在该处理过程中样品中的污染物的量或者活性降低。指示物包括与生物成分共价连接的热稳定激酶，条件是生物成分不是抗体。也提供制备指示物的方法和使用指示物的方法。文档编号G01N33/58GK102016065SQ200980113883公开日2011年4月13日申请日期2009年2月18日优先权日2008年2月20日发明者J·M·萨顿,J·R·赫斯普,M·温古尔斯申请人:健康保护机构
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