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专利名称：半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒的检测方法，具体地说是半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃 薯X病毒的试剂盒，属于植物病毒检测领域。
背景技术：
马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)是马铃薯上最为重要的病害之一，严重感 病的马铃薯能减产80%以上。马铃薯X病毒粒子为弯曲状，长470-580nm，直径13nm，螺旋 对称结构，为单链RNA病毒。马铃薯X病毒通常具有中等致病性，引起许多单子叶植物和双 子叶植物的系统花叶和环斑症状。在自然条件通过机械接触传播，无已知介体，该病毒容易 通过人工接种传播。单一病毒的寄主范围较窄，马铃薯X病毒仅限于浸染茄科植物。虽然 是马铃薯X病毒单一浸染时症状比较轻微或在温度过高、过低或高肥水条件下极易隐症， 但是当该病毒与其它能协生的病毒复合感染抗耐病差的马铃薯品种时，常导致严重减产现 象，甚至达80%以上。因此，马铃薯X病毒是造成马铃薯病毒性退化的主要病毒之一。目前，检测马铃薯X病毒的方法主要有鉴别寄主接种法、酶联免疫吸附测定 (ELISA)、RT-PCR技术等。电镜技术设备昂贵，检测灵敏度低；ELISA技术操作步骤繁琐、检 测周期长、灵敏度低、易出现假阳性；PCR凝胶电泳技术较ELISA在多个方面有所提高，但易 于造成污染；未见采用实时荧光PCR检测PVX的研究所道。

发明内容
本发明的目的在于，针对上述问题，提出根据PVX外壳蛋白(CP)基因的保守序列， 设计并合成了三条巢式PCR弓I物和一条TaqMan荧光探针，建立了半巢式-RT-Realtime PCR 检测PVX的新方法。该方法有机了结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术在实时荧光PCR 引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物；反链引物分别与两条正链引物 配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。实时荧光PCR技术采用TaqMan 荧光探针信号放大的功能有效提高了检测的灵敏度；三条引物形成的两套PCR体系进行相 互验证，极大地提高了检测的准确性；全封闭的操作系统减少了污染，PCR结果的实时观察 极大缩短了检测周期。该方法检测的准确性、灵敏度等比巢式PCR、Real-time PCR及其它 方法高。本发明的技术方案为半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，包括以下步骤制备而成(I)TaqMAN探针与引物的设计合成，根据核酸数据库中PVX全基因组中CP基因序 列保守区，设计三条引物和一条TaqMan探针；(2)总RNA提取及质量控制，从植物叶片中提取总RNA，测定其OD值；(3)反转录合成cDNA，将提取的植物总RNA进行反转录合成cDNA ；(4)实时荧光PCR检测，包括特异性检测和灵敏度检测；所述的特异性检测方法为从感染PVX病毒及其它的对照植物叶片中提取总RNA，将提取的植物总RNA分别进行反转录合成特异性模板cDNA，将合成的cDNA进行引物探针特 异实时荧光PCR试验；所述的灵敏度检测方法为将上述步骤O)中提取的感染马铃薯X病毒的植物叶 片总RNA梯度稀释，并分别进行反转录合成cDNA，然后进行实时荧光PCR检验。所述的三条引物和一条TaqMan探针序列分别为一条上游引物序列为 5，-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3，；另一条上游引物序列为5，-GGCCAGGGCACAATCCA-3，；下游引 物序列为5，-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3，；探针序列为5，(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGA TGCAG-3， (TAMRA)。所述的反转录合成cDNA的方法为在反应体系中加入缓冲液、反转录酶及其缓冲 液、随机引物、和植物总RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反应条件为37°C、15分钟，85°C、5 秒，合成cDNA。所述的缓冲液为5 PrimeScript Buffer,缓冲液中含有四种dNTP混合物和Mg2+ ； 所述的反转录酶及其缓冲液为I^rimeScript RT Enzyme Mix I，所述的随机引物为Oligo dT Primer 禾口 Random 6 mers。所述的特异性检测，反应体系为分别加入PCR SuperMix-UDG、荧光染料、上游 引物、下游引物、探针和cDNA，补充DEPC水定容；循环条件依次为45-55 V、l-3min ； 90-100°C、l-3min ；90_100°C、10_20s ；55_65°C、25_35s。所述的PCR SuperMix-UDG 为 2XPlatinum 定量 PCR SuperMix-UDG，主要包括 Platinun^iTaq DNA 聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgC12、400yM dGTP、400yM dATP、400yM dCTP、800 μ M dUTP、尿嘧啶DNA转葡糖基酶以及稳定剂。所述的循环条件最佳依次为:50°C、2分钟；95°C、2分钟；95°C、15秒，60°C、30秒， 45个循环。本发明的有益效果为本发明有机了结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术在实 时荧光PCR引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物；反链引物分别与两 条正链引物配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。本发明中设计的三条 引物极高的扩增效率保证了检测的高灵敏度，同时采用实时荧光PCR技术中TaqMan荧光 探针信号放大功能也有效提高了检测的灵敏度；三条引物形成的两套PCR体系进行相互验 证，极大地提高了检测的准确性；能实时观察PCR的扩增过程和结果，无需进行后续大量而 繁琐的工作，简化了操作并缩短了检测周期；全封闭的操作系统减少了污染。与已报道的其 它方法相比较，该方法更简便、快速、准确和灵敏。试验结果表明，本发明方法的检测灵敏度 可达0. 071fg/ μ 1植物总RNA。


图1为套1 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探针特异性试验PCR扩增结果；
图2为套2 (PVXF2/PVXR/PVXP)引物探针特异性试验PCR扩增结果；图3为套1 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探针灵敏度试验PCR扩增结果；图4为套2 (PVXF1/PVXR/PVXP)引物探针灵敏度试验PCR扩增结果；图 5 为套 1 组合(PVXF1/PV)(R/PVXP)和套 2 组合(PVXF2/PV)(R/PVXP)引物探针扩 增效率对比结果；
图1中纵轴为Afo1(荧光信息增加值，下同)，横轴为Cycle number(循环数，下 同)；A 为 PVX，B、C、D、E、F 依次为为 ArMV、PVYn、PBRSV、健康叶(CKl)和 DEPC 水对照(CK2)；图 2 中纵轴为 Δ Rn,横轴为 Cycle number ；A 为 PVX, B、C、D、Ε、F 依次为为 ArMV、 PVYn、PBRSV、健康叶(CKl)和 DEPC 水对照(CK2)；图3 中纵轴为 ΔΙ η，横轴为 Cycle number ；A、B、C、D、Ε、F、G、H、I、J、K 所对应 的 RNA 浓度依次为 7. lng/μ l、710pg/y l、71pg/y 1、7. lpg/μ l、710fg/μ l、71fg/μ 1、 7. lfg/μ 1、0· 71fg/y 1、0· 071fg/y 1、0· 0071fg/y 1、DEPC 水；图4 中纵轴为 Δ Rn，横轴为 Cycle number ；A、B、C、D、Ε、F、G、H、I、J、K 所对应 的 RNA 浓度依次为 7. lng/μ l、710pg/y l、71pg/y 1、7. lpg/μ l、710fg/μ l、71fg/μ 1、 7. lfg/μ 1、0· 71fg/y 1、0· 071fg/y 1、0· 0071fg/y 1、DEPC 水；图 5 中纵轴为 Δ Rn，横轴为 Cycle number ；A 为套 1 组合(PVXF1/PVXR/PVXP)，B 为为套 2 组合(PVXF2/PV)(R/PVXP)。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。1原料及来源1. 1 材料马铃薯X病毒(PVX)、南芥菜花叶病毒(ArMV)、马铃薯黑环斑病毒(PBRSV)、马铃薯 Y病毒脉坏死株系(PVYn)毒源由中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所提供。1.2主要的仪器及试剂1. 2. 1主要仪器1. 2. 1. 1实时荧光PCR基因扩增仪为ABI Prism 7000 (美国ABI公司)；1. 2. 1. 2核酸蛋白分析仪为BioPhotometer (德国印pendorf公司)。1.2.2主要试剂1. 2. 2. 1植物总RNA提取试剂盒(商品名Ε. Ζ. N. A ，美国Omega公司产品，货号 R2867-01)购自北京双赢生物公司，其成分及操作步骤参照试剂盒自带说明书。1. 2. 2. 2反转录试剂盒(货号DRR037A)购自大连宝生物公司(TaKaRa)，其成份 包括(l)5XPrimerScript Buffer (主要包括 4 种 dNTP(G、Α、Τ、C)混合物和 Mg2+) ； (2) PrimerScript Enzyme Mix I (主要包括反转录酶及其缓冲液)；(3) Oligo dT Primer ( — 种随机反转录引物)；(4) Random 6 mers (—种随机反转录引物)。1. 2. 2. 3 实时荧光 PCR 试剂盒(Platinum 定量 PCR SuperMix-UDG,货号 C11730-025)购自美国hvitrogen公司，其成份包括(1) 2xPlatinum 定量PCR SuperMix-UDG(主要包括 Platinun^iTaq DNA 聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgCl2、400yM dGTP、400yMdATP、400yM dCTP、800yM dUTP、尿嘧啶 DNA 转葡糖基酶以及稳定剂)；(2) ROX (荧光染料)。2.检测方法2. II1aqMan探针与引物的设计合成根据美国NCBI核酸数据库中PVX全基因组中CP基因序列保守区，设计三条引物和一条TaqMan探针，引物和探针由上海生工合成。本研究中共设计三条引物O条上游引物、1条下游引物)和1条TaqMan探 针，上游引物用PVXF表示，其中上游引物PVXF1序列为5 ’ -TGCCCAAACTGCTGCCTT-3 ’， PVXF2序列为5-GGCCAGGGCACAATCCA-3，下游引物用PVXR表示，序列为5，-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3，；探针用 PVXP 表示，序列为5，(FAM) -CGACTTTGCCAGCCTAGAT GCAG-3，(TAMRA) ；PCR 产物长度 PVXF1/PVXR 为 98bp、PVXFl/PVXR 为 65bp ；三条引物及探针 可以组成两套不同的反应组合，套1为PVXF1/PVXR/PVXP，套2为PVXF2/PVXR/PVXP。2. 2总RNA提取及质量控制用植物总RNA提取试剂盒Ε. Ζ. N. A 从病叶片及健康马铃薯叶片中提取总RNA，植 物总RNA提取步骤参照试剂盒自带说明书；用核酸蛋白分析仪BioWiotometer测定其OD 值，得出其浓度与纯度值，并以此控制核酸质量。2. 3反转录合成cDNA将提取的植物总RNA用反转录试剂盒DRR037A进行反转录操作，以合成 cDNA。反应体系如下在25 μ 1反应体系中加入SXI^rimei^criptTMBufferj μ 1， PrimerScript Enzyme Mix IU. 25 μ 1, Oligo dT Primer (50 μ Μ) >1. 25 μ 1, Random 6 mers(100yM)U. 25 μ 1，适量总RNA (10 μ 1反应体系可最大可使用为500ng)，加DEPC水至 25 μ 1。反应条件为:37°C、15分钟，85°C、5秒，合成cDNA。2. 4实时荧光PCR试验2. 4.1特异性试验2. 4. 1. 1 植物总 RNA 提取用植物总RNA提取试剂盒Ε. Ζ. N. A ,参照“1. 4”中所述方法，从分别感染PVX、 ArMV、PBRSV、PVYM种病毒的叶片及健康马铃薯叶片(CKl)中提取总RNA。2. 4. 1. 2cDNA 合成将“ 1. 6. 1. 1”提取的5个植物总RNA及DEPC水对照(CK2)用反转录试剂盒 DRR037A分别进行反转录合成cDNA。反应体系和条件参照“ 1. 5”所述。2. 4. 1. 3 特异性 PCR 试验将“1. 6. 1. 2”合成的6个cDNA，进行引物探针特异实时荧光PCR试验⑴反应体 系在 25 μ L 体系中分别加入 2xPlatinum 定量 PCR SuperMix-UDG、12. 5 μ 1，R0X、0. 5 μ 1， 上游引物 PVXFl (或 PVXF2) (15 μ Μ)、1 μ 1，下游引物(PVXR) (15 μ Μ)、1 μ 1，探针(PVXP) (10μΜ)、1μ 1，cDNA、2. Ομ 1，补充DEPC水至25μ 1，每个cDNA至少设置2个重复；(3)在 ABI Prism 7000仪器的96孔板中进行反应；(4)循环条件为50°C、2分钟；95°C、2分钟； 95°C、15 秒，60°C、30 秒，45 个循环。2. 4. 2灵敏度试验将“ 1. 6. 1. 1，，中提取的感染马铃薯X病毒(PVX)的植物叶片总RNA，用DEPC水稀 释为KT1 10_1(1、DEPC水11个梯度，并分别进行反转录合成CDNA，然后进行实时荧光PCR 试验。反转录与实时荧光PCR操作参照“1.5”和“1.6. 1. 1”。2. 4. 3两套引物探针的扩增效率对比试验 用同一个PVX病毒cDNA为模板，分别用套1组合(PVXF1/PVXR/PVXP)和套2组合 (PVXF1/PVXR/PVXP)进行实时荧光PCR试验，以比较这两套引物探针的扩增效率。实时荧光PCR 参照 “1. 6. 1. 1”。3结果与分析3. 1特异性试验PCR扩增结果套1 (PVXF1/PV)(R/PVXP)结果见图 1、套 2 (PVXF2/PV)(R/PVXP)结果见图 2。图 1、2 的结果显示，套1引物探针与套2引物探针只有在PVX的CDNA为模板的反应中出现扩增曲 线，其余5种cDNA未出现扩增信号，表明套1、套2引物探针的特异性很好，结果与预计相 符。3. 2灵敏度试验PCR扩增结果从带PVX的叶片中提取植物总RNA，用DEPC处理水稀释为10—1 10_1CI、DEPC水 11个梯度。本试验中所提取RNA浓度与纯度值为71.2(约71ng/l·! 1)，0D260/280 =
2.07，0D260/230 = 2. 21。稀释后各个梯度所对应的RNA浓度分别为7. Ing/μ l、710pg/ μ l、71pg/y 1、7· lpg/μ U710fg/y U71fg/y 1、7· lfg/μ 1、0· 71fg/y 1、0· 071fg/y 1、 0.0071fg/yl、DEPC水。反转录分别合成cDNA后，进行实时荧光PCR扩增。套1结果见图
3、套2结果见图4。PCR扩增的结果表明，当RNA稀释至10,(即0.0071fg/yl)时，检测 不到信号，因此该方法检测的灵敏度可达10_9，即0. 071fg/yl植物总RNA。3. 3两套引物探针的扩增效率对比试验结果套1组合(PVXF1/PVXR/PVXP)和套2组合(PVXF2/PVXR/PVXP)引物探针的扩增效 率对比试验结果见图5。图5的结果表明，这两套引物探针的扩增效率几乎一样。4结论与讨论马铃薯X病毒是一种非常重要的马铃薯病害，严重感病的马铃薯能减产80%以 上。对于该病害的防治措施最主要的是早发现、早防治，为了保护我国马铃薯及相关产业的 健康发展，开发出快速、灵敏检测该病毒的先进的技术，具有较重大现实意义。不同的方法，其检测灵敏度差异较大，如ELISA与PCR凝胶电泳方法，检测的灵敏 度相差100倍以上，PCR凝胶电泳与实时荧光PCR技术灵敏度相关也在100倍以上。本试 验室还进行过大量的试验室证明，采用不同引物探针的实时荧光PCR技术，由于引物的扩 增效率不一样，灵敏度差异也可达到1000倍以上。在实际检测鉴定工作中，为了提高结果 的准确性，经常需要对一个结果进行两个以上的确认试验，不同方法检测灵敏度不一样，很 难保证两个试验的结果完全一样，这就为结果的判断增加了难度，特别是在检测目标含量 极少的情况下，这种难度就会进一步加大。若两套方法检测灵敏度一样或非常接近，这个难 题就迎刃而解。实时荧光PCR检测技术是国际最近几年发展起来的高新检测技术，该技术有机结 合了荧光检测系统PCR扩增系统。与目前已报道的其它检测技术相比，该技术具有巨大的 优越性，主要体现在(1)通过荧光信号，能实时观察PCR过程中待检测样品模板DNA(或 cDNA)扩增情况，无需进行染色、电泳和紫外检测，大大简化了检测程序并缩短检测时间； (2)采用荧光信号放大功能，其检测的灵敏度得到了大大提高；(3)全封闭的操作系统，减 少了 PCR产物对试验室环境的染污和样品间的交叉染污，有效降低和避免了假阳性结果。 实时荧光PCR技术，是目前最准确、最灵敏的技术，其优越性使之在植物检疫中具有广阔的 应用前景。本研究建立了 “半巢式-RT-Realtime PCR"检测马铃薯X病毒(PVX)的方法。该方法既利用了实时荧光PCR方法所固有的简便、快速和高灵敏度特性，同时巧妙地将巢式 PCR的原理，运用到实时荧光PCR技术中。设计上仅仅在一般Realtime PCR的基础上增设 了一条引物，就形成了两套完全独立的检测体系，两套引物探针相互验证，又进一步提高了 准确性。这两套引物探针的扩增效率极高且几乎一样，从而保证了两套系统检测结果的一 致性。试验结果表明，它们检测的灵敏度均可达0. 071fg/yl植物总RNA。
最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
权利要求
1.半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特征在于包括以下步骤制 备而成根据马铃薯X病毒全基因组中外壳蛋白基因序列保守区，设计三条引物和一条TaqMan 探针；(1)从植物叶片中提取总RNA并测定其OD值；(2)将提取的植物总RNA反转录合成cDNA；(3)实时荧光PCR检测，包括引物探针的特异性检测和灵敏度检测。
2.根据权利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特 征在于所述的特异性检测方法为从感染PVX病毒的植物叶片以及其它相应的对照植物叶 片中提取总RNA，将提取的植物总RNA进行反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行引物探针 特异性实时荧光PCR试验；
3.根据权利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特 征在于所述的灵敏度检测方法为将上述步骤O)中提取的感染马铃薯X病毒的植物叶片 总RNA进行梯度稀释，并分别反转录合成CDNA，然后进行实时荧光PCR检验。
4.根据权利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试 剂盒，其特征在于所述的三条引物和一条TaqMan探针，其中一条上游引物序列为 5，-TGCCCAAACTGCTGCCTT-3，；另一条上游引物序列为5，-GGCCAGGGCACAATCCA-3，；下游引 物序列为5，-CAGTGATACGACCTCGAGTGACA-3，；探针序列为5，(FAM)-CGACTTTGCCAGCCTAGA TGCAG-3， (TAMRA)。
5.根据权利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其 特征在于所述的反转录合成cDNA的方法为在反应体系中加入缓冲液、反转录酶及其缓冲 液、随机引物、和植物总RNA，加焦碳酸二乙酯水定容，反应条件为37°C、15分钟，85°C、5 秒，合成cDNA。
6.根据权利要求5所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其 特征在于所述的缓冲液为5 PrimeScript Buffer，缓冲液中含有四种dNTP混合物和Mg2+ ； 所述的反转录酶及其缓冲液为I^rimeScript RT Enzyme Mix I，所述的随机引物为Oligo dT Primer 禾口 Random 6 mers。
7.根据权利要求1所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特 征在于所述的特异性检测，反应体系为分别加入PCR SuperMix-UDG、荧光染料、上游引物、 下游引物、探针和cDNA，补充DEPC水定容；循环条件依次为45-55°C、l-3min ；90-100°C > l-3min ；90_100°C、10_20s ；55_65°C、25_35s。
8.根据权利要求7所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒， 其特征在于所述的PCR SuperMix-UDG为2XPlatinum 定量PCR SuperMix-UDG,主要包括 Platinum Taq DNA 聚合酶、Tris-HCl、KCl、6mM MgC12、400yM dGTP、400yM dATP、400yM dCTP、800 μ M dUTP、尿嘧啶DNA转葡糖基酶以及稳定剂。
9.根据权利要求7所述的半巢式-RT-RealtimePCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，其特 征在于所述的循环条件依次为50°C、2分钟；95°C、2分钟；95°C、15秒，60°C、30秒，45个循 环。
全文摘要
本发明公开了半巢式-RT-Realtime PCR检测马铃薯X病毒的试剂盒，包括TaqMan探针与引物的设计、植物总RNA提取及质量控制、将RNA反转录合成cDNA和实时荧光PCR检测。本方法有机地结合了实时荧光PCR和巢式PCR技术在实时荧光PCR引物的外侧按照巢式PCR的设计原理增设了一条正链引物，反链引物分别与两条正链引物配对形成两套独立的PCR反应，并共用一条TaqMan探针。本发明的优点在于引物极高的扩增效率保证了检测的高灵敏度，有效提高了检测的灵敏度，三条引物形成的两套PCR体系进行相互验证，极大地提高了检测的准确性，简化了操作并缩短了检测周期，全封闭的操作系统减少了污染。
文档编号G01N21/64GK102080132SQ20101056049
公开日2011年6月1日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者张京萱, 李明福, 杨益娥, 栾晶, 粟智平, 耿金培 申请人:烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心