专利名称：神经退行性疾病的监控方法和所用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经退行性疾病的监控方法和所用试剂盒。本发明特别可用于医学领域和免疫学领域。
背景技术：
尽管近五十年来医学有了长足发展，对公共卫生的投资的也相当巨大，但对于某些久已存在的或新近出现的疾�。细竦亟采形薹ㄖ斡Ｌ乇鹦枰岬降氖巧窬诵行约膊。缗两鹕�、多发性硬化(MS)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、肝炎和包括类风湿性关节炎(RA)在内的退行性和炎症性风湿病。
人们对这些疾病按照疾病分类学进行了诊断，已经了解了其病变过程的某些机理和衍变过程，并且给以对症治疗，虽然这些治疗手段通常非常昂贵，但是效果并不尽如人意。
多发性硬化是中枢神经系统多腔的脱髓鞘病理改变，该病变影响到大脑和脊髓的白质，其起病隐匿，病情的发展难以预知，致残率非常高。
在法国，每1000个壮年人中就有1人患有多发性硬化症(100,000个居民中有40到60例)，即有50000个法国人患有此症，而且每年还有2000个新发病例。全世界有2百万例该病患者。
该病在15岁到50岁之间的青壮年起病(特别是20岁到40岁之间)，女性的发病率是男性的两倍。
多发性硬化有三个不同的临床类型间歇型、进展型和间歇进展型。
肌萎缩侧索硬化即沙尔科病是一种进展迅速且病因未明的神经性疾病。该病的特征是大脑、脑干和脊髓前角的运动神经元的退行性病变，而感觉神经元不受影响且智力不受损害，因此这种病人完全清楚他们疾病的发展和机能退化的过程。
和多发性硬化一样，肌萎缩侧索硬化的发病率也很高。肌萎缩侧索硬化的发生率比亨廷顿舞蹈病高5倍。每年死于肌萎缩侧索硬化的病人比死于多发性硬化或亨廷顿舞蹈病的多。
肌萎缩侧索硬化大多数常发生于45岁到70岁之间，男性的发病率比女性高1.5到2倍。该病的患者越来越年轻，有的患者在40岁之前就发病了。
世界上该病的发生率即每年的新发病例数呈增长趋势，增长的原因尚不明确。在法国，每10,000人中就有5人患有该病，每年大约出现1,100个新发病例。
该病发展迅速且总是致命性的。该病呈进行性加重，患者卧床不起，肋间肌和膈肌的病变导致呼吸困难，从而迅速导致死亡(3到5年)。
肌萎缩侧索硬化具有进行性的临床多相性，由此人们想到(这种病具有)生物多相性。
类风湿性关节炎原称萎缩性关节炎，是一种慢性进行性多关节炎症性疾�。窃斐晒侨砉撬鹕说脑颍侨砉撬鹕艘鸸亟诒湫魏凸亟诮┯玻贾峦葱曰苌ナ�。
因而，肌萎缩侧索硬化是一种潜在的严重疾病，症状出现十年后，一半多的病人留下严重的残疾，且使他们的预期寿命减少数年。
在法国，该病的发生率大约为1％，是最常见的慢性炎症性风湿病。法国每年有7,000个新发病例，通常是年轻的女性。
脊椎关节炎(SAR)是一种慢性风湿病，表现为腰骶的病变，造成进行性的关节僵硬。这种免疫炎性疾病与组织相容性抗原B27的过量表达有关(在90％的病例中发现了这种抗原)。
所以从这些疾病的患病人数和公共卫生投入方面来看，其重要性都是不容忽视的。
迄今为止，还没有用来检测这些疾病的进程和/或预测其发展的生物学检验法。这些疾病的诊断目前仅采用临床检查方法，或者辅以其他检查手段来完成。因而，确实需要有一种专门的便利的进展情况诊断法，以便弥补临床上的不足。
发明内容
申请人已经证明，神经退行性疾病的发生与抗原修饰物有关，所述抗原修饰物是由免疫活性细胞整合的，免疫活性细胞本身可生产出A-同种型和/或M-同种型的循环抗体。这些抗体可抗下表1中所列的抗原。表1列出了所述的抗原修饰物和参与这些疾病的慢性发展过程的细菌因子。
表1
因此，这些抗体的检测可作为神经退行性疾病的常规诊断和监控内容的一部分。
检测生物体液中这些抗原的方法包括如下步骤-使所述体液与下列各种抗原接触Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO-His、NO2-Tyr、NO-Phe、NO-Arg、NO-Asn、NO-Met、NO-Cr、NO-BSA、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17、Ig19，和-使所述抗原与相应的抗体选择性地形成的复合物显现。
如表1所示，若检测到抗细菌抗原“Ig”的抗体存在，则该抗体可能是A-同种型和/或M同种型的。
除了牛血清白蛋白被选择性地亚硝酰化以外，非细菌抗原都有利地形成了结合体。
在本发明中，术语“结合抗原”的含义是一种与载体分子特别是牛血清白蛋白结合的抗原，例如Pal、FarCys、NO-Cys等，这种结合可以是直接地，也可以是通过戊二醛或戊二酸酐结合的。如Boullerne等(1995，1996)以及Geffard等(1998)所述，这种结合方法是本技术领域的技术人员所熟知的。
通过声波裂解表1所示细菌的培养物可获得细菌抗原。
生物体液具体可以是血清、血浆、全血、尿液、脑脊液。
所用的方法可以有利地是“三明治”型的。
可借助被标记的A-或M-同种型抗人免疫球蛋白抗体来使选择性地形成的复合物显现，所述标记为例如荧光标记、生物素/链酶抗生物素蛋白系、(放射性)同位素或酶。
借助适当的固体支持物可方便地实施本发明的方法。
任何适于处理细胞悬浮液的装置都可用做固体支持物，优选管、特定的磁性支持体或刚性或柔性的带有微孔的微量滴定板，该微量滴定板由聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯或硝化纤维制成。
如果用含NH2端基的预先活化的微量滴定板，就不需要使抗原与载体分子“结合”。
“带有(放射性)同位素的抗体”这种表述的含义是，在该抗体结构的适当元素例如酪氨酸残基组分上，或在结合在该抗体上的适当基团上带有放射性同位素，通过计算相应于该同位素的放射性，可以将该抗体检测出来。
如果所述抗体与酶结合，则借助适当的试剂就可以定量测量该抗体。
选择底物和试剂，从而使在酶的作用下该底物和试剂发生的一步或多步反应的最终产物是-有色物质或荧光物质，这些物质分散于围绕细胞的液体介质中，它们分别是最后分光光度法或荧光测定检测的对象，或-不溶性有色物质，该物质沉积在细胞上以及细胞所附着的壁上，它们是反射光光度测定法或视觉检测的对象，选择性地将其与标准染色范围相对比。
如果用放射性同位素，例如碘125，可采用任何适宜的方法在γ计数器中测定待检样品的放射性。
如果用酶，通过在所述固体支持物中加入一种溶液而得到有色或荧光产物，所述溶液含有该酶的底物及一种或多种辅助试剂，如上所述，最终可获得溶于该介质的有色产物、不溶性有色产物或可溶性荧光产物。然后借助仪器检测从经过这种处理的样品中发出的光信号，所述仪器分别是适用于不同情况的发射光度计、反射光度计或荧光计。当固体支持物是微量滴定板时，采用生物实验室中常用的自动读数器可以顺序读取同一滴定板所有的孔中的光信号。
酶可以采用碱性磷酸酶，当最后用分光光度计读数时，优选该酶的底物为磷酸对硝基苯酯，当用荧光计读数时，优选底物为4-甲基-2，4-二羟基肉桂基磷酸酯，或采用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯以得到不溶性有色反应产物。类似地β-半乳糖可用做酶，其底物优选为邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷脂。
对于抗下列抗原的抗体的检测尤其有助于多发性硬化的诊断，这些抗原包括PI、Ach、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO2-Tyr、NO-Asn、NO-Met、Ig5(A-同种型抗体)、Ig12(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig13(A-同种型抗体)、Ig16(A-同种型抗体)、Ig17(M-同种型抗体)和Ig19(A-同种型抗体)。抗NO2-Tyr、NO-Tyr、Ach和Ig16(A-同种型抗体)抗原的抗体的量化有助于识别多发性硬化的具体类型(进展型、间歇型、间歇进展型)。
类似地，对于抗下列抗原的抗体的检测有助于肌萎缩侧索硬化的诊断，并可根据抗体滴定的函数来区分上述三类疾�。隹乖∣le、PI、MAD、Aze、NO-Cys、FarCys、Ig3(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig5(A-同种型抗体)、Ig12(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig13(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig16(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig17(A-同种型抗体和M-同种型抗体)。
抗下列抗原的抗体的检测有助于类风湿性关节炎的诊断，这些抗原包括Pal、Ole、Myr、PI、MAD、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Phe、Ig3(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig5(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig12(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig13(M-同种型抗体)和Ig19(A-同种型抗体)。
本说明书和权利要求中将用到以下缩写词BSA°牛血清白蛋白G°戊二醛残基GA°戊二酸酐残基PBS°磷酸盐缓冲液OPD°邻苯二胺H2O2°过氧化氢H2SO4°硫酸PI°磷脂酰肌醇CaCl2°氯化钙NaCl°氯化钠
OD°光密度HSA°人血清白蛋白HSA-EA°结合有乙二胺的人血清白蛋白Ig°免疫球蛋白Ach乙酰胆碱Ole°油酸Pal°棕榈酸Myr°肉豆蔻酸FarCys法呢基半胱氨酸 MDA°丙二醛(脂质过氧化所得的新抗原决定基) (其中R＝蛋白质)NO-Cys°一氧化氮-半胱氨酸(半胱氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Trp°一氧化氮-色氨酸(色氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Asn°一氧化氮-天冬酰氨酸(天冬酰氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Tyr°NO-Trp
(酪氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO2-Tyr°二氧化氮-酪氨酸(过氧亚硝酸盐NO+O2-形成所得的新抗原决定基) NO-His°一氧化氮-组氨酸(组氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Phe°一氧化氮-苯丙氨酸(苯丙氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Met°一氧化氮-蛋氨酸(蛋氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Arg一氧化氮-精氨酸(精氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Cr一氧化氮-肌氨酸(肌氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基)
优选的抗Ig的抗体可与过氧化物酶以常规方式结合。用于显示与抗Ig的抗体结合的过氧化物酶的试剂中含有作为该酶的底物的过氧化氢，而且含有适宜的色原如邻苯二胺、3，3’-二氨基联苯胺或TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)以得到不溶性的最终反应产物，甚至含有对羟基苯丙酸以得到溶于该介质的荧光反应产物。可用硫酸终止此比色反应。
本发明另一个优选的实施方式是可与乙酰胆碱脂酶结合的抗免疫球蛋白抗体的应用。
乙酰胆碱脂酶与该抗体的结合方法优选由法国专利No.2,550,799所述的方法演变而来，或优选采用大致包括以下步骤的方法利用已知技术制备该抗体片段，然后与适当的异双官能团试剂反应进行酶的修饰，最后使由前两个步骤得到的产物相结合。
酶活性的显示优选采用熟知的方法，根据不同的试验，如Anal.Chem.(分析化学)57(1985)1170-1173所描述的方法，可以采用作为该酶的底物的乙酰硫胆碱和埃尔曼氏(Ellman’s)试剂，或采用5，5’-二硫-2-硝基苯甲酸作为色原体。
所述色原体是水溶性盐。
本发明的另一个主题是实施上述方法所用的试剂盒，这种试剂盒有利地含有-下列各种抗原Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO-His、NO2-Tyr、NO-Phe、NO-Arg、NO-Asn、NO-Met、NO-Cr、NO-BSA、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17和Ig19；-选择性地，如上所述的至少一种人的A-同种型和/或M-同种型抗免疫球蛋白抗体。
这种试剂盒还可包括适当的固体支持物。
这个试验特别可以-进行疾病的早期诊断，尤其是针对危险人群，因而不会延误治疗；-监控疾病的进展，从而可以调整治疗方案。
对于抗下列抗原的抗体的检测尤其有助于多发性硬化的诊断，这些抗原包括PI、Ach、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO2-Tyr、NO-Asn、NO-Met、Ig5(A-同种型抗体)、Ig12(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig13(A-同种型抗体)、Ig16(A-同种型抗体)、Ig17(M-同种型抗体)和Ig19(A-同种型抗体)。抗NO2-Tyr、NO-Tyr、Ach和Ig16(A-同种型抗体)抗原的抗体的量化有助于识别多发性硬化的具体类型(进展型、间歇型、间歇进展型)。
类似地，对于抗下列抗原的抗体的检测有助于肌萎缩侧索硬化的诊断，并可根据抗体滴定的函数来区分上述三类疾�。隹乖∣le、PI、MAD、Aze、NO-Cys、FarCys、Ig3(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig5(A-同种型抗体)、Ig12(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig13(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig16(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig17(A-同种型抗体和M-同种型抗体)。
抗下列抗原的抗体的检测有助于类风湿性关节炎的诊断，这些抗原包括Pal、Ole、Myr、PI、MAD、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Phe、Ig3(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig5(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig12(A-同种型抗体和M-同种型抗体)、Ig13(M-同种型抗体)和Ig19(A-同种型抗体)。
本说明书和权利要求中将用到以下缩写词BSA 牛血清白蛋白G戊二醛残基GA 戊二酸酐残基PBS 磷酸盐缓冲液OPD 邻苯二胺H2O2 过氧化氢H2SO4硫酸PI 磷脂酰肌醇CaCl2氯化钙NaCl 氯化钠
OD光密度HSA 人血清白蛋白HSA-EA结合有乙二胺的人血清白蛋白Ig免疫球蛋白Ach 乙酰胆碱Ole 油酸Pal 棕榈酸Myr 肉豆蔻酸FarCys法呢基半胱氨酸 MDA 丙二醛(脂质过氧化所得的新抗原决定基) (其中R＝蛋白质)NO-Cys一氧化氮-半胱氨酸(半胱氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Trp一氧化氮-色氨酸(色氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Asn一氧化氮-天冬酰氨酸(天冬酰氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-TyrNO-Trp
(酪氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO2-Tyr二氧化氮-酪氨酸(过氧亚硝酸盐NO+O2-形成所得的新抗原决定基) NO-His一氧化氮-组氨酸(组氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Phe一氧化氮-苯丙氨酸(苯丙氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Met一氧化氮-蛋氨酸(蛋氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Arg一氧化氮-精氨酸(精氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基) NO-Cr一氧化氮-肌氨酸(肌氨酸亚硝酰化所得的新抗原决定基)
然后用如下方式表示相对于对照组数量的结果抗体滴度＝(血清的OD-对照组的平均OD)/对照组的平均OD第五节抗法呢基-半胱氨酸抗体的检测选用Maxisorp微量滴定板，由FarCys-BSA结合物(根据下面第7节中所描述的针对脂肪酸的技术，用FarCys活化氯甲酸乙酯，再与BSA结合制备而成)在pH9.6的碳酸盐缓冲液中形成20μg/ml的溶液(空白反应BSA)，在每孔中滴入该溶液。将该孔板于4℃下搅拌过夜。用PBS冲洗3次。然后向各孔中加入含有27g/l的氯化钠和2g/l脱脂BSA的PBS缓冲液，37℃下放置1小时，以使蛋白质在各孔的表层饱和。用PBS冲洗3次。
在含有27g/l的氯化钠和2g/l脱脂BSA的PBS缓冲液中将待测血清稀释到1/250，然后将该待测血清加入各孔，在37℃下孵育2小时。用PBS冲洗3次。
最后，由用过氧化物酶标记的人的抗IgM抗体(参考号75061，Sanofi Pasteur有售)在含有Tween和1g/l BSA的PBS缓冲液中形成1/5,000的溶液，然后向各孔中加入该溶液，再在37℃下孵育1小时。用含有Tween的PBS冲洗孔板3次。
翻转孔板清空各孔。向各孔中加入显色剂(在20ml的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，加入过氧化氢10μl和4％的OPD 0.5ml)，然后在暗处显色10分钟。用50μl 4N的硫酸终止反应，在492nm处读取OD值。
然后用如下方式表示相对于对照组数量的结果抗体滴度＝(血清的OD-对照组的平均OD)/对照组的平均OD第六节抗丙二醛抗体的检测选用Maxisorp微量滴定板，由MDA-BSA结合物(根据Amara等(1995)描述的方法制备而成)在pH 9.6的碳酸盐缓冲液中形成80μg/ml的溶液(空白反应BSA)，每孔中滴入该溶液。将该孔板于4℃下搅拌过夜。然后向各孔中加入含有Tween，、10％甘油和5g/l BSA的PBS缓冲液，37℃下放置1小时，以使蛋白质在各孔的表层饱和。用PBS冲洗3次。
在含有Tween和5g/l BSA的PBS缓冲液中将待测血清稀释到1/1,000，然后将该待测血清加入各孔，在37℃下孵育2小时用含有Tween的PBS冲洗孔板3次。
最后，由用过氧化物酶标记的人的抗IgM抗体(参考号75061，Sanofi Pasteur有售)在含有Tween和5g/l BSA的PBS缓冲液中形成1/5,000的溶液，然后向各孔中加入该溶液，再在37℃下孵育1小时。用含有Tween的PBS冲洗孔板3次。
翻转孔板清空各孔。向各孔中加入显色剂(在20ml的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，加入过氧化氢10μl和4％的OPD 0.5ml)，然后在暗处显色10分钟。用50μl 4N的硫酸终止反应，在492nm处读取OD值。
然后用如下方式表示相对于对照组数量的结果抗体滴度＝(血清的OD-对照组的平均OD)/对照组的平均OD第七节抗乙酰胆碱抗体的检测选用Maxisorp微量滴定板，由Ole-BSA、Pal-BSA或Myr-BSA结合物(根据Maneta等(1987)、Amara等(1994)a和b、Constans等(1995)、Boulleme等(1996)描述的方法制备而成)在pH9.6的含0.001M CaCl2的碳酸盐缓冲液形成50μg/ml的溶液(空白反应脱脂BSA)，将该溶液滴入每个孔中。将该孔板于4℃下搅拌过夜。用含0.001M CaCl2的PBS冲洗孔板3次。
在含有0.001M CaCl2和1g/l脱脂BSA的PBS缓冲液中将待测血清稀释到1/1,000，然后将该待测血清加入各孔，在37℃下孵育2小时用含有Tween的PBS冲洗孔板3次。
最后，由用过氧化物酶标记的人的抗IgM抗体(参考号75061，Sanofi Pasteur有售)在含有0.001M CaCl2和1g/l脱脂BSA的PBS缓冲液中形成1/5,000的溶液，然后向各孔中加入该溶液，再在37℃下孵育1小时。用含有Tween的PBS冲洗孔板3次。
翻转孔板清空各孔。向各孔中加入显色剂(在20ml的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，加入过氧化氢10μl和4％的OPD 0.5ml)，然后在暗处显色10分钟。用50μl 4N的硫酸终止反应，在492nm处读取OD值。
然后用如下方式表示相对于对照组数量的结果抗体滴度＝(血清的OD-对照组的平均OD)/对照组的平均OD第8节抗细菌抗原抗体的检测选用Maxisorp微量滴定板。每孔中滴入34μg/ml的细菌抗原溶菌液，该溶菌液由声波裂解相应的细菌(参见表1)培养物并在溶于pH 9.6的碳酸盐缓冲液而获得(空白反应BSA)。将该孔板于4℃下搅拌过夜。然后想各孔中加入含有5g/l BSA的PBS缓冲液，37℃下放置1小时，以使蛋白质在各孔的表层饱和。用用含有Tween的PBS冲洗3次。
在含有Tween和2.5g/l BSA的PBS缓冲液中将待测血清稀释到1/500，然后将该待测血清加入各孔，在37℃下孵育2小时，用含有Tween的PBS冲洗孔板3次。
最后，由用过氧化物酶标记的人的抗IgM抗体(参考号75041和75061，Sanofi Pasteur有售)在含有Tween和2.5g/l BSA的PBS缓冲液中形成1/5,000的溶液，然后向各孔中加入该溶液，再在37℃下孵育1小时。用含有Tween的PBS冲洗孔板3次。
翻转孔板清空各孔。向各孔中加入显色剂(在20ml的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，加入过氧化氢10μl和4％的OPD 0.5ml)，然后在暗处显色10分钟。用50μl 4N的硫酸终止反应，在492nm处读取OD值。
然后用如下方式表示相对于对照组数量的结果抗体滴度＝(血清的OD-对照组的平均OD)/对照组的平均OD实施例1多发性硬化患者循环抗体的定量测定下表1集中了用上述各节的方法对大量受检对象所做的免疫酶试验的结果。
表1
*M-同种型抗体**A-同种型抗体对于多发性硬化，33种抗体中有23种的抗体反应有统计学意义。
作为例子，我们将多发性硬化与作为对照的神经退行性疾病的抗NO-Cys的抗体反应的特异性进行了对比，在这些作为对照的神经退行性疾病中，肌萎缩性侧索硬化、癫痫症和帕金森病的发展迅速。结果表明这种反应在多发性硬化的不同病理类型之间有显著的差异。
下表2显示了16种重要的结合物在多发性硬化(MS)不同类型(P进展型；R间歇型；RP间歇进展型)间的关系。
表2
1秩和检验法*M-同种型2H检验法**A-同种型
图1显示了各型多发性硬化和对照组数据的分布抗原NO2Tyr NOTrp Ach Ig161p2 0.0409 0.0006＜0.0001 0.0491例数MS P 39 38117 109例数MS R 59 54112 107例数MS RP 40 3971 68例数对照组126 148 229 225(1A-同种型抗体；2H检验法)每种结合物以特定的方式鉴别多发性硬化的临床类型抗NO2-Tyr抗体特别适用于鉴别进展型和间歇进展型多发性硬化(这两组样品之间秩和检验的p＝0.0167)。
进展型多发性硬化的检测值较低。
对于鉴别进展型和间歇型多发性硬化，抗NO-Trp抗体是较好的指示剂(秩和检验的p＜0.0001)。
抗Ach抗体适用于鉴别间歇型多发性硬化和另外两型多发性硬化(秩和检验的p＜0.0001)。
抗A-同种型Ig16抗体适用于鉴别进展型和间歇型多发性硬化(秩和检验的p＜0.01)。
这些循环抗体能够用于鉴别各型多发性硬化，重要的是，还能够用于鉴别由一种进展型向另一种类型(间歇型/进展型)的转变。用现有的其他任何临床或研究方法都不可能鉴别这种转变。
实施例2肌萎缩侧索硬化患者循环抗体的定量测定图2-4显示了肌萎缩侧索硬化的3种类型1型，占血清试验(总数为118)的39％，特点是抗原FarCys、Ig3、Ig5、Ig16、Ig12、Ig13的测定值较高，且Ig17的测定值较低(所有这些检测到的Ig抗体都是A-同种型)，见图2；2型，占血清试验的34％，特点是所有21种抗原的测定值均较低(19种抗原的中位数＜0)。只有FarCys和PI的含量与对照组相同，见图3；3型，占血清试验的27％，特点是抗原Ole、Aze、MDA、PI、NO-Cys、Ig3、Ig16、Ig12、Ig13、Ig17的测定值较高，(所有这些检测到的Ig抗体都是M-同种型)，且Ig15的测定值较低(检测到的这种抗体是A-同种型)，见图4。
上述生物学特点对应于肌萎缩侧索硬化的各种进展类型。
此外，在疾病的临床发展过程中，80％的受检患者的疾病类型没有发生改变。
实施例3类风湿性关节炎患者循环抗体的定量测定在类风湿性关节炎(RA)(所有的阶段及发展的整个过程)中，重要的抗体是抗以下抗原的抗体脂肪酸、壬二酸、法呢基半胱氨酸、丙二醛、磷脂酰肌醇、一氧化氮-半胱氨酸、一氧化氮-苯丙氨酸和免疫球蛋白Ig3(A-同种型和M-同种型抗体)、Ig5(A-同种型和M-同种型抗体)、Ig12(A-同种型和M-同种型抗体)、Ig13(M-同种型抗体)、Ig17(M-同种型抗体)和Ig19(A-同种型抗体)，如下表3所示
表3
*M-同种型抗体**A-同种型抗体这表明M-同种型循环抗体的滴度有助于类风湿性关节炎患者的监控。
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权利要求
1.检测生物体液中与神经退行性疾病的发生或发展有关的抗体的方法，该方法包括以下步骤-使所述体液与下列各种抗原接触Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO-His、NO2-Tyr、NO-Phe、NO-Arg、NO-Asn、NO-Met、NO-Cr、NO-BSA、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17、Ig19，和-使所述抗原与相应的抗体选择性地形成的复合物显现。
2.检测生物体液中与神经退行性疾病的发生或发展有关的抗体的方法，该方法包括以下步骤-使所述体液与下列各种抗原接触PI、Ach、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO2-Tyr、NO-Asn、NO-Met、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17和Ig19，和-使所述抗原与相应的抗体选择性地形成的复合物显现。
3.检测生物体液中与神经退行性疾病的发生或发展有关的抗体的方法，该方法包括以下步骤-使所述体液与下列各种抗原接触Ole、PI、MAD、Aze、NO-Cys、FarCys、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16和Ig17，和-使所述抗原与相应的抗体选择性地形成的复合物显现。
4.检测生物体液中与神经退行性疾病的发生或发展有关的抗体的方法，该方法包括以下步骤-使所述体液与下列各种抗原接触Pal、Ole、Myr、PI、MAD、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Phe、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig17和Ig19，和-使所述抗原与相应的抗体选择性地形成的复合物显现。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，除NO-BSA之外的非细菌抗原与载体分子相结合，所述载体分子优选牛血清白蛋白。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，借助M-同种型或者有必要的话借助A-同种型的抗人免疫球蛋白抗体来显示选择性地形成的复合物，所述抗体优选用酶标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的酶为氧化物酶。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，所述方法的实施借助固体支持物，所述固体支持物优选微量滴定板。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述退行性疾病包括多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、类风湿性关节炎或脊椎关节炎。
10.用于实施权利要求1的方法的试剂盒，所述试剂盒装有以下各种抗原Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO-His、NO2-Tyr、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17和Ig19。
11.用于实施权利要求2的方法的试剂盒，所述试剂盒装有以下各种抗原PI、Ach、Aze、NO-Cys、NO-Tyr、NO-Trp、NO2-Tyr、NO-Asn、NO-Met、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17和Ig19。
12.用于实施权利要求3的方法的试剂盒，所述试剂盒装有以下各种抗原Ole、PI、MAD、Aze、NO-Cys、FarCys、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16和Ig17。
13.用于实施权利要求4的方法的试剂盒，所述试剂盒装有以下各种抗原Pal、Ole、Myr、PI、MAD、FarCys、Aze、NO-Cys、NO-Phe、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig17和Ig19。
14.根据权利要求10-13任一项所述的试剂盒，其中，除NO-BSA之外的非细菌抗原与载体分子相结合，所述载体分子优选牛血清白蛋白。
15.根据权利要求10-14任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还装有至少一种M-同种型抗人免疫球蛋白抗体和/或至少一种A-同种型抗人免疫球蛋白抗体。
全文摘要
本发明涉及检测和监控神经退行性疾病的方法，该方法基于对抗所述疾病的抗原的A－同种型或M－同种型抗体的检测。本发明还涉及实施该方法所需的试剂盒。
文档编号G01N33/50GK1511258SQ02806608
公开日2004年7月7日 申请日期2002年3月15日 优先权日2001年3月16日
发明者米歇尔·格法德, 米歇尔 格法德 申请人:Gemac
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