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专利名称：一种单分子水平上迁移速度的测量方法
技术领域：
本发明主要涉及单分子水平上迁移速度的测量方法。
背景技术：
近几年单分子光学检测技术迅猛发展[盖宏伟，白吉玲，林炳承，分析化学2002，30(7)869-874]，与常规系综分析相比该技术不仅具有最高灵敏度，而且在下述几个方面亦具有优势(1)它可以给出某一物理量在整个研究体系中的分布，而系综法得到的是系统平均值，因此失去大量个体信息；(2)它可以检测某些指定分子随时间的变化行为，具有真正意义上的实时性，而由系综平均得到的结果中大量分子实际上处于不同的时间状态；(3)它将会揭示个体行为和大量分子平均行为的差异，有利于发现新的实验现象，甚至因此建立新的理论。
将单分子检测(SMD)技术与毛细管电泳或微流控芯片相结合，为SMD引入一种极其重要的分离手段，不但现有的分离知识积累可以转移到单分子水平上重新认识，而且使毛细管电泳及微流控芯片技术拥有更广阔的应用前景，尤其在生物学及医学领域。
荧光成像技术是单分子检测技术的分支之一，一般认为具有高通量检测能力，按其激发光路和检测范围可以分类如表1。本文所用光路设计属于远场激发宽场检测类。Ma等[Ma Y，Shortreed MR，Yeung ES，Anal.Chem.2000，72，4640-4645；Ma Y，Shortreed MR，Li H，Huang W，Yeung ES，Electrophoresis，2001，22，421～426]通过改进后的该种方法测量了高通量单分子光谱，初步实现了单分子免疫电泳。Shortreed等[Shortreed MR，Li H，Huang W，Yeung ES，Anal.Chem.2000，72，2879～2885]则将之用于毛细管电泳上，尝试了单分子DNA的筛选。最近Zheng等[Zheng J，Yeung ES，Anal.Chem.2002，74，4536-4547；Zheng J，Yeung ES，Anal.Chem.2003，75，3675～3680]发现在电动力和压力的合同作用下DNA分子发生径向迁移，并据此提出了全新的分离策略。
迁移速度是电泳技术获取的重要参数之一。
以往测量单分子迁移速度多用多帧法，多帧法是指通过计量已知采集频率的多幅荧光照片中同一单个分子的位置而计算该分子迁移速度的方法。多帧法需要跟踪同一分子在不同照片中的位置，检测分子浓度较低的样品时比较适用。对于高浓度分子时则不易跟踪。另外，此方法曝光时间不易过长，以减小分子轨迹的长度，提高测量精度。
传统系综分析以一定距离内样品区带的迁移时间来推算迁移速度。其缺点在于需要样品量较大，花费时间较长(短则数分钟，长则数小时)。

发明内容
本发明提供一种单分子水平上迁移速度的测量方法，不仅可以降低样品的使用量，而且速度快(几秒钟的实验结果即可得到迁移速度值)。
本发明提供的单分子水平上迁移速度的测量方法，由激光器发出连续激光经光学系统聚焦于芯片通道内的待测样品上，所激发出的荧光由显微镜物镜收集到CCD上，其特征在于曝光时间大于8ms，然后用获得的轨迹长度除以曝光时间，得到迁移速度；由于数据采集时间内荧光分子依然迁移，所以荧光光子在EMCCD芯片上对应于DNA分子运动位置处均有响应，形成分子迁移轨迹。
本发明提供的单分子水平上迁移速度的测量方法中，曝光时间可选用8ms～1s。
本发明提供的单分子水平上迁移速度的测量方法中，样品浓度可选用1fM～1pM之间。
本发明提供的单分子水平上迁移速度的测量方法中，光学系统可采用水冷氩离子激光器、一系列反射镜、20厘米焦距透镜、棱镜、488nm全息陷波滤光片和/或514nm滤光片。
本发明提供的单分子水平上迁移速度的测量方法的优点在于不仅可以降低样品的使用量，而且速度快(几秒钟的实验结果即可得到迁移速度值)。
本发明提供的单分子水平上迁移速度的测量方法中，EMCCD增益倍数可选用100～255，优选为255，温度为-20～-60℃。


图1是实验装置图；图2是λDNA分子在该曝光时间内的运行轨迹，轨迹的长度，即迁移距离，标记在每个轨迹上(单位像素)；图3是曝光时间与轨迹长度的直线关系，直线斜率即为λDNA分子的迁移速度；图4是芯片通道。
具体实施例方式
实施例石英芯片置于熔融石英直角棱镜的斜边面上。芯片和棱镜之间滴一滴浸油。每次检测前，用10uL NaOH(1M)，二次水和10uL Gly-Gly缓冲液以一端缓冲池抽真空的方法冲洗通道。分子在通道中的迁移可以由电动力或压力驱动。实验装置图见图1。芯片及棱镜置于荧光显微镜载物台上。水冷氩离子激光器发出的连续激光经一系列反射镜，20厘米焦距透镜和棱镜聚焦于芯片通道内(见图4)，在微通道上表面全反射。至棱镜前激光功率在5mW～140mW之间。样品激发出的荧光由显微镜物镜收集。488nm全息陷波滤光片和/或514nm滤光片安放在EMCCD和物镜之间滤除杂光。EMCCD增益倍数为255，温度为-60℃，曝光时间设置在8ms～1s之间。样品浓度为1fM～1pM之间。
轨迹法的典型结果，曝光时间512ms时λDNA分子的迁移轨迹照片，见图2。每个轨迹上方的数字为测量的轨迹长度(单位像素)。此长度即为分子在曝光时间内的迁移距离。该迁移距离与曝光时间的比即为分子迁移速度。迁移速度相同的分子，曝光时间不同则轨迹长度不同。曝光时间与λDNA分子迁移轨迹长度直线关系见图3。该直线斜率值即为DNA迁移速度。
对比例为比较两种方法的测量结果，用同样的设备，以曝光时间20ms，帧频率11.16Hz的记录结果作多帧法计算。
多帧法和轨迹法测量单个分子迁移速度的测量结果见表1。
表1 多帧法和轨迹法测量单个分子迁移速度的测量结果多帧法 轨迹法速度 均值 斜率 均值标准方差 标准方差(像素/ms) (像素/ms) (像素/ms) (像素/ms)10.14509 0.1601120.10045 0.1358130.16741 0.152840.122770.149870.029430.136370.146870.0105950.17857 0.1492860.1562570.1785权利要求
1.一种单个分子迁移速度的测量方法，由激光器发出连续激光经光学系统聚焦于芯片通道内的待测样品上，所激发出的荧光由显微镜物镜收集到CCD上，其特征在于曝光时间大于8ms，然后用获得的轨迹长度除以曝光时间，得到迁移速度。
2.按照权利要求1所述的单个分子迁移速度的测量方法，其特征在于曝光时间为8ms～1s。
3.按照权利要求1或2所述的单个分子迁移速度的测量方法，其特征在于样品浓度为1fM～1pM之间。
4.按照权利要求1所述的单个分子迁移速度的测量方法，其特征在于光学系统包括水冷氩离子激光器、一系列反射镜、20厘米焦距透镜、棱镜、488nm全息陷波滤光片和/或514nm滤光片。
全文摘要
本发明提供的单分子水平上迁移速度的测量方法，由激光器发出连续激光经光学系统聚焦于芯片通道内的待测样品上，所激发出的荧光由显微镜物镜收集到CCD上，其特征在于曝光时间大于8ms，然后用获得轨迹长度除以曝光时间，得到迁移速度；由于数据采集时间内荧光分子依然迁移，所以荧光光子在EMCCD芯片上对应于DNA分子运动位置处均有响应，形成分子迁移轨迹。本发明提供的单分子水平上的迁移速度测量方法的优点在于不仅可以降低样品的使用量，而且速度快(几秒钟的实验结果即可得到迁移速度值)。
文档编号G01N21/64GK1629619SQ200310119150
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月18日 优先权日2003年12月18日
发明者盖宏伟, 於林芬, 马银法, 林炳承 申请人:中国科学院大连化学物理研究所