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专利名称：一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种游离色氨酸含量的检测方法，更具体地说，涉及一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法。
背景技术：
在天然的20种氨基酸中，色氨酸具有至关重要的意义，例如血清中色氨酸含量的非正常偏高被认为是某些疾病产生的关键影响要素，如慢性肝炎、帕金森病、再生障碍性贫血和肌肉萎缩等。所以发展有效地在活体内识别和检测色氨酸含量，尤其是应用于血清样本中色氨酸含量的检测方法具有临床上的意义。然而，设计合成出具有高选择性和有效地识别该类重要的生物小分子的探针在目·前是一个极具挑战的课题，经过科学工作者数十年的不懈努力，氨基酸分子荧光探针在基础理论研究方面取得了巨大的进步，实现了对特定目标氨基酸的高选择性的检测。但是，目前绝大部分的氨基酸识别探针要真正应用到现实生产生活中，科学工作者还需解决如下问题
I.基于弱作用识别过程对氨基酸的识别，其中提高识别过程的选择性是重点，因为氨基酸及其衍生物都具有相似的结构，从而具有相同的弱作用识别位点，达到对单一氨基酸分子的识别在目前的研究中还有待解决。2.现在大部分高选择性的氨基酸探针都是基于共价键反应型机理，对于氨基酸的识别过程同时也伴随着氨基酸分子结构的变化，识别过程不可逆，不利于现实意义上的检测应用。3.小肽和蛋白质对氨基酸识别过程的干扰目前研究的较少，大部分生物样本中都会含有氨基酸、小肽和蛋白质，真正的构筑研究生命体系生物小分子的探针刻不容缓。

发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明目的是提供一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法。具体是将具有蓝色荧光发射的三苯胺基团作为荧光团和芳香堆积作用位点，协同天然的酰胺基团作为氢键授受体，构筑具有特殊亲疏水空腔的四面体笼状结构，不仅可以在20种天然氨基酸中高选择性的识别色氨酸，小肽的存在对荧光识别过程没有干扰，而且还将其应用到生物活体细胞成像研究，最为有利的是实现了对血清样本中游离色氨酸含量的荧光法检测，通过荧光定量检测生物体内的色氨酸。为了实现上述发明目的，本发明采取的技术方案是一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，所述探针为含有式A的配合物，
[^LJ(A)
式A中，L为含有三苯胺基团作为荧光团，功能酰胺基团作为氢键作用位点的配体，具有如下B分子结构式；
权利要求
1.一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于探针含有式A的配合物，[MmLJ(A) 式A中，L为含有三苯胺基团作为荧光团，功能酰胺基团作为氢键作用位点的配体，具有如下B分子结构式；
2.根据权利要求I所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于包括以下步骤 (a)、按照荧光法对于色氨酸的识别方法； 称取根据权利要求I所述的探针材料，配制成c μ M的100 ml有机/水混合溶剂的标准探针溶液，再配置2.0 X 10_2 M的色氨酸有机/水混合溶剂的溶液；量取标准探针溶液2 ml,向其中逐渐加入上述配制的色氨酸溶液，至色氨酸含量达到7.5mM后，荧光增强直至平衡； (b)、按照荧光法对色氨酸的选择性识别测试方法；取探针材料C μ M,加入色氨酸达到7. 5 mM,其它19种天然氨基酸,包括lie, Arg,Ala, Val, Leu, Pro, Met, Thr, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Ser, Gly, Cys, His, Phe 和 Tyr 分别加入15 mM,同时，含有5个色氨酸残基的13肽(ILPWKWPffff PWRR-NH2)加入80 mM,在350nm处激发，测试其荧光发射谱图； (C)、按照荧光法得到色氨酸含量的标准曲线方法；称取根据权利要求I所述的探针材料，配制成c μ M的100 ml有机/水混合溶剂的标准探针溶液，再配置2.0 X 10_2 M的色氨酸有机/水混合溶剂的溶液； 量取标准探针溶液2 ml,加入计算量的色氨酸溶液,配制成标准测试溶液；上述溶液在350 nm处激发，测得荧光发射谱图，然后以色氨酸的加入量为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，得到标准曲线； (d)、荧光法直接检测血清样本中色氨酸含量的技术； 血清样本从合作医院取来后，未经任何处理，直接用微量注射器加入到含有C μ M 2 ml的有机/水混合溶剂的标准探针溶液，在350 nm处激发，测得荧光增强曲线，按照荧光标准曲线计算样本中所含游离色氨酸的浓度。
3.根据权利要求2所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于所述浓度C为10 μ M至20 μ Μ，浓度太低荧光发射峰较差，浓度太高则发生自淬灭。
4.根据权利要求2所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于所述探针材料所用有机/水混合溶剂选自DMF和水，其比例为9:1或8:2。
5.根据权利要求2所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于所述配制色氨酸所用有机/水混合溶剂选自DMF和水，其比例为I: I或4:6。
全文摘要
一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，涉及一种游离色氨酸含量的检测方法。本发明提供了一种基于荧光功能化的金属有机四面体化合物应用于天然氨基酸和血清样本中游离色氨酸识别和检测并实现生物细胞成像应用的方法。该方法是以三苯胺为母体构筑出的三三齿配体与硝酸铈自组装得到四面体化合物为材料，该材料能够在20种天然氨基酸中高选择性的识别色氨酸，响应范围在0～0.1mM；另外，该材料还能够有效地区分游离的和结合的色氨酸，实现在血清样本中对游离色氨酸含量的检测，也很好的实现了在活体细胞成像上的应用。因此，该材料提供了一种灵敏度高、操作简单的测试血清样本中游离色氨酸含量的方法。
文档编号G01N21/64GK102914527SQ20121039076
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月16日 优先权日2012年10月16日
发明者何成, 王健, 武鹏彦, 刘晓花, 段然 申请人:大连理工大学