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专利名称：：巴戟天中药材或其提取物中巴戟天寡糖的含量测定方法
技术领域：
：本发明提供了一种巴戟天寡糖的检测方法，其为一种含有多个寡糖成分的寡糖混合物的含量测定方法，尤其是指在巴戟天中药材(包括中药饮片)或巴戟天中药材的提取物中的巴戟天寡糖的高效液相含量测定方法。
背景技术：
：在制药领域，对于某种成分的含量测定，采用高效液相的色谱分析是很常规的方法，本领域技术人员常常设定某一成分为对照品，在标的物中参照该对照品进行某成分的分析测定，对于含有多种中药有效成分且需要同时对该多种中药成分进行定性和定量测定的时候，往往根据该多种成分找出其一一对应的多种对照品，再依次进行测定，这种对统一标的物进行逐一测定的缺点是不可避免的，操作繁琐、耗时费力、效率低下，同一化学部位中各成分相对含量标准各自独立、互不相关，如此难免会造成一定程度的偏差，无法更有效、精确地控制质量。对含巴戟天寡糖的巴戟天药材或饮片或其制成的巴戟天中药材的提取物而言，其有效成分为寡糖类物质，该寡糖物质是3—9糖的混合物，若采用化学显色反应，显示与其它糖类(单糖、双糖、多糖)相同的反应特征，因此，数据证明对于检测巴戟天寡糖，选择HPLC的色谱鉴别更具有专属性，而且为了测定的结果更加科学和严谨，需要研发出一种能在测定该化学部位总量的同时还能鉴别出其中各个成分、并给出各个成分相对含量、尽量减少对照品的种类、操作简单的高效液相含量测定方法。
发明内容目前在含有巴戟天寡糖的巴戟天药材(包括饮片)或以巴戟天药材制成的提取物中，其质量监控方面没有规范成熟的含测方法，本发明的目的是提供一种巴戟天寡糖的含量测定方法，使用该方法以及该方法中的技术指标，可以很好的监控含有巴戟天寡糖的巴戟天药材或其制成的提取物的质量，使中药质量稳定可控，保障疗效，能更好地服务社会。本发明的目的是开发一种含有巴戟天寡糖成分的巴戟天药材(包括饮片)或其制成的提取物的质量控制方法，该方法简便、高效，适合科研、市场销售、市场监督、临床应用和工业化生产中质量检测的需要。本发明提供了一种巴戟天寡糖的含量测定方法，该巴戟天寡糖至少含有菊淀粉型寡糖5聚体，并且存在于巴戟天中药材(包括饮片)或其提取物中，该含量测定方法包括(1)釆用高效液相色谱法进行测定；色谱条件是以含有乙腈的水溶液为流动相，采用示差检测器或蒸发光散射检测器检测；(2)对照品溶液的制备称取菊淀粉型寡糖5聚体作为对照品，加水或步骤(1)中所述的流动相制成对照品溶液；(3)供试品溶液的制备取巴戟天寡糖样品，加水或步骤(1)中的流动相溶解，取上清液，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；所述的巴戟天寡糖样品由以下方法制得，取巴戟天药材(或饮片)，用水提取出浸出物，该浸出物为巴戟天中药材的提取物，该浸出物上活性碳柱层析，先用水洗脱至还原糖检出(硫酸-苯酚法)呈阴性，再用20-50°/。乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，经浓縮干燥得到巴戟天寡糖样品；(4)测定分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；(5)计算，按供试品图谱中各个色谱峰与菊淀粉型寡糖5聚体对照品相对保留时间，鉴定总寡糖中各个寡糖的存在；按外标法以峰面积计算该巴戟天寡糖中所含有的菊淀粉型寡糖n聚体的含量，n为39的任一或其混合，进而确定该巴戟天寡糖中各菊淀粉型寡糖n聚体的相对含量比例，再将菊淀粉型寡糖n聚体的含量进行加和，即得所述的巴戟天总寡糖的含量。上述所采用的巴戟天中药材既包括不经任何加工的中药材原料，也包括经过加工的饮片，以及还包括经过本领域公知的炮制工艺得到的巴戟天饮片。上述巴戟天寡糖为具有抗抑郁作用的活性成分，包括菊淀粉型寡糖3糖9糖，即，本发明所述的巴戟天寡糖是至少含有菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)的寡糖，或同时含有菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)以及菊淀粉型寡糖3聚体(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(4糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(9糖)任意或其组合的混合物。在本发明的优选实施例中，上述方法中步骤(1)中色谱柱优选采用氨基柱(氨基色谱柱)或C18反相柱;例如InertsilNH2柱(5pm，4.6x250mm)，采用的检测器为示差检测器或蒸发光散射检测器，所述的流动相一般选择含有40-80%(体积)的乙腈的水溶液；优选为体积比3:11:l的乙腈与水的混合溶液。上述的巴戟天寡糖在含有菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)的同时，优选还含有菊淀粉型寡糖34、69聚体中任一寡糖或其混合物。优选地，本发明所述的巴戟天寡糖是含有菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)、菊淀粉型寡糖3聚体(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(4糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(9糖)的混合物。一般而言，可以将菊淀粉型寡糖n聚体简称为n糖，n为39，例如，菊淀粉型寡糖5聚体即为5糖，菊淀粉型寡糖9聚体即为9糖。发明人发现，为了改善色谱图的拖尾现象，使得到的色谱图的峰型完整美观，本发明所述的含量测定方法中采用的含有乙腈的水溶液的流动相优选还含有三乙胺，所述的三乙胺在该流动相中所占的体积一般不超过0.5%;—般可为0.01%-0.5o/o。本发明的供试品溶液的制备中所述的滤过的步骤优选采用的是微孔滤膜，该微孔滤膜的孔径一般可以是0.3、0.45、0.5、0.75um，更优选0.45um。在本发明的优选实施例中，上述含量测定方法步骤(1)所述的流动相最优选为体积比68:32的乙腈和水的混合溶液，该混合溶液中还含有不超过该流动相体积的0.5%的三乙胺；例如，可以是体积比68:32:0.1的乙腈、水和三乙胺的混合溶液作为流动相，得到的图谱和峰型呈现令人惊喜的趋于完美效果。本发明的检测方法中，步骤(3)所采用的水浸出物上活性碳柱层析，优选先用水洗脱，再用大约20-50%乙醇洗脱，更优选水洗脱后，以大约30%乙醇洗脱，经浓縮干燥得到较佳的巴戟天寡糖样品。然后，取巴戟天寡糖样品50-200mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水或步骤(1)中的流动相溶解，稀释至刻度，优选再经微孔滤膜过滤，取续滤液，即可得到供试品溶液。本发明对照品选用菊淀粉型寡糖5聚体，选择菊淀粉型寡糖5聚体作为对照是因为巴戟天寡糖是39聚体寡糖的混合物，在研究确定的HPLC色谱条件下，5糖相对保留时间居中、色谱峰峰高或峰面积适中，以其标定其它3-4、6-9糖，各糖与5糖峰相对位置差较均匀，可减少以色谱图峰面积或峰高积分计算相对含量和总寡糖含量时存在的系统偏差。同时，采用5糖能够使得其他糖(即，3、4、6、7、8和9糖)的HPLC的峰型清晰、分离度较好、准确度高。步骤(3)的供试品溶液优选为每50-200mg巴戟天寡糖样品加入水或流动相10ml得到的溶液，在制备供试品溶液的过程中，溶解过程中还经历了超声，溶解后用0.45um微孔滤膜滤过的过程，取续滤液即为供试品溶液；所述的供试品如为巴戟天寡糖原料药，则直接制备供试品溶液；如为中药材或中药材提取物，则按下述方法处理得到供试品巴戟天寡糖对含有巴戟天寡糖的中药材(或中药饮片)，用水提取出浸出物，浸出物上活性碳柱层析，先用水洗脱至还原糖检出(硫酸-苯酚法)呈阴性，再用20-50°/。乙醇洗脱，优选30%乙醇洗脱。收集乙醇洗脱部分，经浓縮干燥得到巴戟天寡糖样品；对含有巴戟天寡糖的中药提取物，则直接上活性炭柱层析，然后按上述方法处理。在本发明的另一实施例中，所述的含量测定方法包括(1)采用高效液相色谱法进行测定；色谱条件是釆用氨基柱；以乙腈水三乙胺的体积比68:32:O.l为流动相；检测器为示差检测器;柱温40。C，检测器温度40'C;理论板数按菊淀粉型寡糖5聚体计算不低于2000;(2)对照品溶液的制备，称取菊淀粉型寡糖5聚体作为对照品，加水制成每lml含lmg的对照品溶液；(3)供试品溶液的制备，取经过上述采用巴戟天药材提取得到含有巴戟天寡糖的提取物再经由活性炭柱层析得到的巴戟天寡糖样品50-200mg，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，功率100W频率40KHz下超声10分钟，静置，取上清液，用0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；(4)测定，分别吸取对照品溶液与供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定；(5)计算，按供试品图谱中各个色谱峰与菊淀粉型寡糖5聚体对照品相对保留时间，鉴定总寡糖中各个寡糖的存在；按外标法以峰面积分别计算菊淀粉型寡糖39聚体的含量，进而确定总寡糖中各个寡糖的相对含量比例，再将菊淀粉型寡糖39聚体的含量进行加和，即得巴戟天总寡糖的含量。本发明在寡糖混合物中以其中的菊淀粉型寡糖5聚体这种成分作为对照品，采用高效液相色谱法，利用示差检测器或蒸发光散射检测器来测定寡糖含量的方法。其创新点在于以该菊淀粉型寡糖5聚体这种成分为基准，将该成分的保留时间定为1，其他聚合体色谱峰的保留时间相应换算成相对保留时间，用相对保留时间鉴别5糖外的其它寡糖的存在，再按外标法以峰面积分别计算各成分以及总的寡糖的含量，即可得到较为稳定且准确的巴戟天寡糖的含量。这样可以以一种对照品来测定多个结构类似的化合物的含量，提高了含量测定的精确性，简化了操作步骤，减少了对照品数量，縮短了测定时间，重复性好，适用性高。以下述实例来说明但不限制该专利.-该液相色谱图中供试品图谱中5糖色谱峰的保留时间，应与菊淀粉型寡糖5聚体对照品保留时间一致，与菊淀粉寡糖5聚体相比，还应出现相对保留时间为0.50-0.70的菊淀粉型寡糖3聚体峰；0.700.90的菊淀粉型寡糖4聚体峰；1.101.40的菊淀粉型寡糖6聚体峰；1.50~1.83的菊淀粉型寡糖7聚体峰；1.832.50的菊淀粉型寡糖8聚体峰；1.853.40的菊淀粉型寡糖9聚体峰，再按外标法以峰面积分别计算各寡糖的含量。本发明的色谱条件的选择是基于大量的实验数据，选择各方面指标包括峰型、分离度、峰面积、重现性等等，综合评价得出的最佳的色谱柱、流动相、检测器以及柱温等条件。具体如下对照品菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)的HPLC分析取含量测定项下5糖对照品供试液20u1，在本发明所述的色谱条件下进行HPLC分析，记录色谱图，数据相对保留时间17.502，峰面积118018，峰面积(％)100.0000。巴戟天寡糖的HPLC分析取含量测定项下巴戟天寡糖供试液20W，在上述的色谱条件下进行HPLC分析，记录色谱图，图中的峰由左至右依次为17号色谱峰，经HPLC-MS-MS等波谱学方法确定依次(由左至右)为菊淀粉型寡糖3聚体(C18H32016，简称3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(C24H42021，简称4糖)、菊淀粉型寡糖5聚体(C3QH52026，简称5糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(C36H62031，简称6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(C42H72036，简称7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(C48H82041，简称8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(C54H92046，简称9糖)。其中5糖色谱峰的保留时间与对照品保留时间一致。39聚合体色谱峰的保留时间，图谱解析如下，数据见表l。(表中Resolution:分离度，T.Plate存理论塔板数，Ret.Time:保留时间，Area:面积)表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>213.25914274615.22224.4964409.893317.40516372917.45994.5544637.704422.77317466318.62584.6134873.221530.17315232316.24354.9024956.905639.83612133712.93924.8014754.490752.7059479810.10925.0425691.831色谱鉴别结果对上述结果进行统计分析，得到39糖各色谱峰相对保留时间的最大值、最小值及平均值，见表2。表2巴戟天寡糖各色谱峰的相对保留时间统计值糖名称相对保留时间最大值最小值平均值3糖0.5770.5720.5744糖0.7600.7570.7585糖1.0001.0001.0006糖1.3161.3111.3147糖1.7551.7401.7488糖2.3302.2892.3169糖3.0983.0533.075溶剂的HPLC分析取纯水溶剂，或取流动相溶液，照供试品溶液制备方法处理，分别取20u1，注入HPLC，测定，上述色谱条件下进行HPLC分析，记录色谱图。色谱图与含巴戟天样品色谱图对照，结果显示空白样品色谱图中，在与巴戟天寡糖5糖对照品色谱图相应的保留时间处、及与含巴戟天寡糖样品的色谱图中相应各寡糖相对保留时间处，均未见色谱峰。表明不存在空白溶剂干扰。巴戟天寡糖，为菊淀粉型寡糖3聚体(C18H32016，简称3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(C24H42021，简称4糖)、菊淀粉型寡糖5聚体(C3QH52026，简称5糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(C36H62031，简称6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(C42H72036，简称7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(C48H8204I，简称8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(C54H92046，简称9糖)的混合物。本发明建立了该巴戟天寡糖的HPLC含量测定方法。实验说明如下1仪器与试剂-岛津20AT高效液相色谱系统RID-10A示差检测器LCsolution色谱工作站色谱柱Inertsil朋2柱(5um，4.5X250腿)试剂乙腈一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)，水一高纯水，其余试剂均为分析纯对照品:菊淀粉型寡糖5聚体，中国药品生物制品检定所提供，批号200701，纯度99.99%。2.方法与结果-2.l.色谱分析条件色谱柱Inertsil,2柱(5um，4.5X250mm)流动相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)检测器RID-IOA示差检测器温度柱温40。C,检测器温度4(TC流速1.2mL/min;在此条件下，样品中各组分达到基线分离。测得菊淀粉型寡糖5聚体峰理论板数不低于2000。2.2.线性关系考察精密吸取菊淀粉型寡糖5聚体对照品溶液(2.37mg/ml)5、10、15、20、25、30ul，注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，菊淀粉型寡糖5聚体进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=5555523.8X-6336r二0.9999。结果表明，菊淀粉型寡糖5聚体在0.01190.0711mg范围内具良好的线性关系。见表3。表3线性关系的考察<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.3精密度实验精密吸取菊淀粉型寡糖5聚体对照品溶液(2.37mg/ml)10ul，连续进样6次，照上述色谱条件测定，计算平均峰面积和相对标准偏差，见表4。结果表明该方法的精密度良好。表4精密度测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.4.空白试验取纯水溶剂，或流动相溶液，照"含量测定"项下供试品处理方法处理，取20pl，在上述的色谱条件下进行HPLC分析，记录色谱图，结果表明无干扰。2.5.供试品溶液稳定性考察供试品溶液(批号0762)，于制样后0、2、4、8、10、22小时，依法测定，结果表明，供试品溶液在22小时内基本稳定。结果见表5。表5稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.6.重复性试验按正文方法，取同批(0762)样品，平行制样6份，测定，结果见表6，结果表明重复性较好。表6重复性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.7.回收率试验采用加样回收法，精密称取已知含量的同批(0762)(5糖含量54.1mg/g)样品150mg，分别精密加入5糖对照品(7.716mg)，平行制样6份，测定，按下式计算回收率，结果表明本方法具有良好的准确度，数据见表7。回收率(%)=测出滩总量—样品中彌的含量x酵/。V;加入5糖对照品量表7回收率试验结果Ns样品取样量(g)样品中5糖量(mg)添加5糖量(mg)测得5糖总量(mg)回收率(%)均值(%)RSD(%)10.15028.12815.876100.4220.15058.14415.80299.2430.15118.17716.001101.4040.15068.1507.71615.76598.69100.831.7250.15098.16616.142103.3860.15178.20916.068101.852.8.样品测定结果测定3批样品，结果见表8。表8、样品测定结果批号5糖含量总糖含量(mg/g)(mg/g)0701-1114.0612.70701-2112.0622.50701-3112.3605.33方法耐用性研究3.1色谱柱MERKLichrosorb朋2柱(5um，4.5X250ram)流动相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)检测器RID-IOA示差检测器温度柱温4(TC，检测器温度40'C流速1.2mL/min;结果见表9、10。表9、耐用性结果l批号5糖含量(mg/g)总糖含量(mg/g)0701-1111.6618.9表IO、巴戟天寡糖各色谱峰的相对保留时间糖名称相对保留时间3糖0.68愤0.825糖1.006糖1.227糖1.508糖1.869糖2.303.2色谱柱SEPAXAmethystamino柱(5(orn,4.6x250mm)流动相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)检测器RID-10A示差检测器温度柱温4(TC，检测器温度4(TC流速1.2mL/min;结果见表ll、12。表ll、耐用性结果2批号5糖含量(mg/g)总糖含量(mg/g)0701-2_^_625.1_表12、巴戟天寡糖各色谱峰的相对保留时间糖名称相对保留时间3糖0.634糖0.795糖1.006糖1.267糖1.608糖2.049糖2.614、相对保留时间范围的确定对多批巴戟天寡糖进行了测定，菊淀粉型寡糖39聚体的保留时间相对较为固定，菊淀粉型寡糖3~9聚体相对于5聚体的相对保留时间也较为稳定，见表13。表13、相对保留时间范围糖名称相对保留时间-5%+5%3糖0.5740.550.614糖0.7580.720.805糖1.000//6糖1.3141.251.387糖1.7481.651.838糖2.3162.192.429糖3.0752.903.21经过系统研究，本发明采用菊淀粉性寡糖5聚体为对照品，以3-9糖的峰面积之和计算巴戟天寡糖含量的方法是切实可行的。该方法准确、灵敏、专一、空白辅料对测定无干扰，能有效控制本品含量。本发明的质量控制方法快速便捷，重复性良好，适合实验室的小样检测以及工业化大生产的质量检测。具体实施方式以下结合实施例详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围实施例一.巴戟天药材的含量测定1仪器与试剂岛津20AT高效液相色谱系统LCsolution色谱工作站试剂乙腈一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)，水一高纯水，其余试剂均为分析纯对照品菊淀粉型寡糖5聚体，中国药品生物制品检定所提供，批号200701，纯度99.99%。2.方法与结果2.l.色谱分析条件色谱柱InertsilNH2柱(5拜，4.5x250mm)流动相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)检测器RID-10A示差检测器温度柱温40。C，检测器温度4(TC流速1.2mL/min;在此条件下，样品中各组分达到基线分离。测得菊淀粉型寡糖5聚体峰理论板数不低于2000。对照品溶液的制备取菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)对照品适量，精密称定，加水制成每lml含lmg的溶液，即得。供试品溶液的制备取巴戟天药材20g，照中国药典2005年版一部附录XA项下冷浸法，提取出浸出物，蒸干，干燥物用水溶解，使成浓度为lg/ml的溶液，上活性碳柱层析，先用水洗脱至还原糖检出(硫酸-苯酚法)呈阴性，再用大约6倍柱体积的30%乙醇洗脱。收集30%乙醇洗脱部分，经浓縮干燥得到巴戟天寡糖(样品)。取样品约150mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，经0.45pm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20^d，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积分别计算菊淀粉型寡糖3聚体(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(9糖)的含量，将39糖的含量进行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天药材按干燥品计算，含菊淀粉型寡糖5聚体((33。1152026)不得少于2.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚体-9聚体的总量)以菊淀粉型寡糖5聚体(C30H52O26)计，不得少于10.0%。实施例二.巴戟天药材的提取物1仪器与试剂岛津20AT高效液相色谱系统LCsolution色谱工作站试剂乙腈—色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)，水一高纯水，其余试剂均为分析纯对照品:菊淀粉型寡糖5聚体，中国药品生物制品检定所提供，批号200701，纯度99.99%。2.方法与结果-2.l.色谱分析条件色谱柱,2柱(5pm，4.5x250mm)流动相乙腈水三乙胺(68:32:0.1)检测器RID-10A示差检测器温度柱温4(TC,检测器温度4(TC流速1.2mL/min;在此条件下，样品中各组分达到基线分离。测得菊淀粉型寡糖5聚体峰理论板数不低于2000。对照品溶液的制备取菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)对照品适量，精密称定，加流动相制成每lml含lmg的溶液，即得。供试品溶液的制备取巴戟天药材提取物5g，用水溶解，使成浓度为lg/ml的溶液，上活性碳柱层析，先用水洗脱至还原糖检出(硫酸-苯酚法)呈阴性，再用30%乙醇洗脱。收集30%乙醇洗脱部分，经浓縮干燥得到巴戟天寡糖(样品)。取样品约150mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，经0.45pm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2(Hi1，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积分别计算菊淀粉型寡糖3聚体(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(9糖)的含量，将39糖的含量进行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天药材提取物按干燥品计算，含菊淀粉型寡糖5聚体(C3QH52026)不得少于3.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚体-9聚体的总量)以菊淀粉型寡糖5聚体(C3QH52026)计，不得少于20.0%。实施例三.巴戟天药材的含量测定1仪器与试剂岛津20AT高效液相色谱系统LCsolution色谱工作站试剂乙腈一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)，水一高纯水，其余试剂均为分析纯对照品:菊淀粉型寡糖5聚体，中国药品生物制品检定所提供，批号200701，纯度99.99%。2.方法与结果2.l.色谱分析条件色谱柱NH2柱(5(om，4.5x250mm)流动相乙腈水(40:60)检测器RID-10A示差检测器温度柱温4(TC，检测器温度4(TC流速L0mL/min;在此条件下，样品中各组分达到基线分离。测得菊淀粉型寡糖5聚体峰理论板数不低于2500。对照品溶液的制备取菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)对照品适量，精密称定，加流动相制成每lml含lmg的溶液，即得。供试品溶液的制备取巴戟天药材20g，照中国药典2005年版一部附录XA项下冷浸法，提取出浸出物，蒸干，干燥物用水溶解，使成浓度为lg/ml的溶液，上活性碳柱层析，先用水洗脱至还原糖检出(硫酸-苯酚法)呈阴性，再用大约8倍柱体积的20%乙醇洗脱。收集20%乙醇洗脱部分，经浓縮干燥得到巴戟天寡糖(样品)。取样品约150mg，精密称定，置10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，经0.45pm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20^d,注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积分别计算菊淀粉型寡糖3聚体(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(9糖)的含量，将39糖的含量进行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天药材按干燥品计算，含菊淀粉型寡糖5聚体((:3()1152026)不得少于2.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚体-9聚体的总量)以菊淀粉型寡糖5聚体(C30H52O26)计，不得少于10.0%。实施例四.巴戟天药材的含量测定1仪器与试剂岛津20AT高效液相色谱系统LCsolution色谱工作站试剂乙腈一色谱纯(天津四友生物医学技术开发公司)，水一高纯水，其余试剂均为分析纯对照品:菊淀粉型寡糖5聚体，中国药品生物制品检定所提供，批号200701，纯度99.99%。2.方法与结果2.l.色谱分析条件色谱柱C18柱(5Mm，4.5x250mm)流动相乙腈水三乙胺(78:22:0.2)检测器蒸发光散射检测器温度柱温35。C，检测器温度35'C流速L2mL/min;在此条件下，样品中各组分达到基线分离。测得菊淀粉型寡糖5聚体峰理论板数不低于3000。对照品溶液的制备取菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)对照品适量，精密称定，加水制成每lml含lmg的溶液，即得。供试品溶液的制备取巴戟天药材20g，照中国药典2005年版一部附录XA项下冷浸法，提取出浸出物，蒸干，干燥物用水溶解，使成浓度为lg/ml的溶液，上活性碳柱层析，先用水洗脱至还原糖检出(硫酸-苯酚法)呈阴性，再用大约4倍柱体积的50%乙醇洗脱。收集50%乙醇洗脱部分，经浓縮干燥得到巴戟天寡糖(样品)。取样品约150mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，经0.45pm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2(V1，注入液相色谱仪，测定，按外标法以峰面积分别计算菊淀粉型寡糖3聚体(3糖)、菊淀粉型寡糖4聚体(4糖)、菊淀粉型寡糖5聚体(5糖)、菊淀粉型寡糖6聚体(6糖)、菊淀粉型寡糖7聚体(7糖)、菊淀粉型寡糖8聚体(8糖)和菊淀粉型寡糖9聚体(9糖)的含量，将39糖的含量进行加和，即得巴戟天寡糖有效成分的含量。巴戟天药材按干燥品计算，含菊淀粉型寡糖5聚体((:3。1152026)不得少于2.0%，含巴戟天寡糖(即菊淀粉型寡糖3聚体-9聚体的总量)以菊淀粉型寡糖5聚体(C30H52O26)计，不得少于10.0%。权利要求1.一种巴戟天寡糖的含量测定方法，该巴戟天寡糖至少含有菊淀粉型寡糖5聚体，并且存在于巴戟天中药材或其提取物中，该含量测定方法包括(1)采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件是以含有乙腈的水溶液为流动相，采用示差检测器或蒸发光散射检测器检测；(2)对照品溶液的制备，称取菊淀粉型寡糖5聚体作为对照品，加水或步骤(1)中所述的流动相制成对照品溶液；(3)供试品溶液的制备，取巴戟天寡糖样品，加水或步骤(1)中的流动相溶解，取上清液，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；所述的巴戟天寡糖样品由以下方法制得，取巴戟天药材，用水提取出浸出物，该浸出物为巴戟天中药材的提取物，该浸出物上活性碳柱层析，先用水洗脱至还原糖检出呈阴性，再用20-50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部分，经浓缩干燥得到巴戟天寡糖样品；(4)测定，分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定；(5)计算，按供试品图谱中各个色谱峰与菊淀粉型寡糖5聚体对照品相对保留时间；按外标法以峰面积计算该巴戟天寡糖中所含有的菊淀粉型寡糖n聚体的含量，n为3～9的任一或其混合，进而确定该巴戟天寡糖中各菊淀粉型寡糖n聚体的相对含量比例，再将菊淀粉型寡糖n聚体的含量进行加和，即得所述的巴戟天总寡糖的含量。2.权利要求1所述的含量测定方法，该方法中步骤(1)所述的色谱条件包括采用氨基柱或C18反相柱，所述的流动相含有40-80%体积的乙腈。3.权利要求1所述的含量测定方法，该方法中步骤(1)所述的流动相为体积比3:11:l的乙腈与水的混合溶液。4.权利要求1所述的含量测定方法，其中，所述的巴戟天寡糖还含有菊淀粉型寡糖34、69聚体中任一寡糖或其混合物。5.权利要求l所述的含量测定方法，其中，所述的巴戟天寡糖为含有菊淀粉型寡糖5聚体、菊淀粉型寡糖34聚体、菊淀粉型寡糖69聚体的混合物。6.权利要求l所述的含量测定方法，其中，该方法中步骤(1)所述的流动相为体积比68:32的乙腈和水的混合溶液，该混合溶液中还含有不超过该流动相体积的0.5%的三乙胺。7.权利要求1所述的含量测定方法，其中，该方法中步骤(3)所述的水浸出物上活性碳柱层析，先用水洗脱，再用30%乙醇洗脱，经浓縮干燥得到所述的巴戟天寡糖样品。8.权利要求1所述的含量测定方法，该方法中步骤(3)包括取巴戟天寡糖样品50-200mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水或步骤(1)中的流动相溶解，稀释至刻度，经微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。9.权利要求1所述的含量测定方法，其中，该方法步骤(1)中采用的检测器为示差检测器或蒸发光散射检测器。全文摘要本发明提供了一种巴戟天寡糖的含量测定方法，包括采用高效液相色谱法进行测定；以含有乙腈的水溶液为流动相；按外标法以峰面积分别计算菊淀粉型寡糖3～9聚体的含量，再将菊淀粉型寡糖3～9聚体的含量进行加和，即得巴戟天寡糖的含量；本发明以单一对照品来测定以巴戟天中药材或巴戟天提取物中巴戟天寡糖中多个结构类似的化合物总量的同时，还对所测化学部位中各个成分及其相对含量进行测定，简化了操作步骤，提高了含量测定的精确性，减少了对照品数量，缩短了测定时间，重复性好，适用性高。文档编号G01N30/02GK101334390SQ20081013409公开日2008年12月31日申请日期2008年7月24日优先权日2008年6月26日发明者刘柏刚,华励,薇张,张学著,张绍来,张维钧,鹏彭,银李,李志猛,菁杜,落邱,顾海鸥申请人:北京同仁堂股份有限公司