专利名称：作物种子碱性脂肪酶活性平板快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种种子中碱性脂肪酶活性的平板检测方法。
背景技术：
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一种甘油酯水解酶，可以水解脂肪分子中的甘油酯键，将脂肪(甘油三酯)水解为甘油及游离脂肪酸，是脂肪分解代谢中第一个参与反应的酶，所以一般认为是脂肪水解的调速酶，对脂肪的转化速率起着调控作用。其催化反应如下
脂肪酶广泛存在于动、植物及微生物中，对其脂类的消化和吸收过程中起重要作用。作物种子中的脂肪酶，按其最适PH范围可分为酸性、中性和碱性三类。脂肪经不同类型的脂肪酶水解后同样生成甘油和游离脂肪酸。
以水稻为例，稻谷中脂类含量约为3％，85％分布在稻谷的种皮和胚中。稻谷脂肪极易受储藏影响。稻谷在氧气及高温条件下储藏以后，脂肪极易发生水解、氧化，致使稻谷品质劣变。稻谷脂类的变化被认为是导致稻谷陈化的最主要因素。稻谷脂肪酶则是稻谷储藏过程中脂肪酸败变质的主要原因之一。随着稻谷的储藏，脂肪的分解，游离脂肪酸含量增加，脂肪酸组成发生变化，严重影响了稻谷的食用品质和营养品质。
长期以来，稻谷种子脂类与陈化的研究始终受到人们的关注，脂肪酶的研究主要集中于中性脂肪酶与大米的风味。但对水稻种子碱性脂肪酶的研究由于其含量极少而很少有人重视，只是2001年印度科学家Kanchan Bhardwaj等在PlantPhysiology上发表一篇关于水稻种子碱性脂肪酶的分离纯化和特性研究的文章，该碱性脂肪酶既具有脂肪酶活性又具有磷脂酶A2的活性，其所用的碱性脂肪酶检测方法为放射性同位素标记法，而对水稻等作物种子碱性脂肪酶与稻谷储藏陈化变质的关系未有研究。笔者通过许多实验证明碱性脂肪酶能攻击储存性脂肪和脂肪酶之间的膜相结构，而导致储存性脂肪和中性脂肪酶之间的充分接触，其缺失能延缓稻谷储藏陈化变质，是稻谷储藏的关键酶。
对于水稻等作物种子碱性脂肪酶的检测，除了上述放射性同位素标记法，目前，还没有其他的测定方法。对于微生物碱性脂肪酶检测方法则大致有碱滴定方法或用分光光度法两类。
碱滴定方法原理脂肪在脂肪酶的作用下产生游离脂肪酸，再利用酸碱中和反应使酸碱指示剂终点变色。缺点该方法只能用于大量整粒材料粉碎，且必须离心取上清，才能加底物反应，该方法的稳定性易受pH缓冲液，耗碱体积小及指示剂终点变色不明显影响。
分光光度法原理脂肪在脂肪酶的作用下产生游离脂肪酸，再利用脂肪酸与铜离子形成铜皂，经萃取后进行比色测定。缺点该方法也只能用于大量整粒材料粉碎，且必须离心取上清，才能加底物反应。在测定时，乳化体系、底物、体系的pH条件、温度、反应时间和稳定时间的变化，可能会使测定结果差别较大。另外，象PVA的聚合度、乳化液制备时的搅拌速度、体系的离子强度及终止剂的不同等也会影响测定结果，并且由于反应过程的复杂性，还会带进许多随机误差，难以确保测定的精密度。
发明内容
通过对水稻等作物碱性脂肪酶活性测定方法的研究和比较，建立了一种快速、直观、灵敏的固体琼脂平板脂肪酶活性测定方法。本发明的测定水稻等作物种子碱性脂肪酶的酶活的快速检测方法主要原理利用作物种子碱性脂肪酶在一定条件下分解三酰甘油酯，所释放出的游离脂肪酸使指示剂(维多利亚蓝)变色的原理，根据变色圈直径的大小对酶活性进行粗略分析，特别适合于作物种子碱性脂肪酶缺失材料的筛选和其酶提纯过程中大批量样品酶活性的估测以及酶活性条带和其它蛋白质条带的区分。
本发明的技术方案如下作物种子碱性脂肪酶活性快速检测方法，包括以下步骤(1)、取种子中的碱性脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液配制粗酶液；(2)、制作固体琼脂检测平板；(3)、在固体琼脂平板上打孔，加粗酶液，定时观察孔周围的变色情况，有变色圈则表示碱性脂肪酶活性高，无变色圈则表示碱性脂肪酶缺失。
所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)、粗酶液的制备取稻胚20-40粒放入研钵中，加入150-300 1PH7.0-7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；玉米胚则取1～4粒，双子叶作物大豆、花生等取种子子叶10～20mg放入研钵中，加入800-1200 1PH7.0-7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；(2)、琼脂平板的制作组方比例琼脂粉0.3～1.0g，橄榄油或三丁酸甘油脂1～2ml，2～5％聚乙烯醇3～4ml，1～2％维多利亚蓝0.5～1.0ml，0.02～0.1mol/l，PH9～11的NaOH-Gly缓冲液40～50ml；(3)、脂肪酶活性的测定在固体琼脂平板上打孔，将粗酶液加入孔中，置于25-40℃恒温培养箱中进行酶解反应，定时观察孔周围的变色情况，有变色圈则表示碱性脂肪酶活性高，无变色圈则表示碱性脂肪酶缺失。
所述的检测方法，其特征在于步骤(1)、(2)、(3)为(1)、粗酶液的制备取稻胚30粒放入研钵中，加入200 1PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；玉米胚则取1～2粒，双子叶作物大豆、花生等取种子子叶10～20mg放入研钵中，加入1000 1PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；(2)、琼脂平板的制作组方比例琼脂粉0.5g，三丁酸甘油脂1.25ml，3％聚乙烯醇3.75ml，1％维多利亚蓝0.5ml，0.05mol/l、PH10.0的NaOH-Gly缓冲液45ml；(3)、脂肪酶活性的测定在固体琼脂平板上打孔，后用注射针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与平皿底部紧贴，将粗酶液约100l加入孔中，置于30℃恒温培养箱中进行酶解反应。
本发明的脂肪酶的酶活的快速检测方法优点①、能直接取水稻等作物种子胚、糊粉层、子叶等材料，用量少，无需离心。
②、利用脂肪酶在一定条件下分解三丁酸甘油酯所释放出利用作物种子碱性脂肪酶在一定条件下分解三酰甘油酯所释放出的游离脂肪酸使指示剂(维多利亚蓝)变色的原理，根据变色圈直径的大小对酶活性进行粗略分析，这样做具有过程简单、快速、稳定性好、直观、灵敏等特点。因为提供脂肪酶存在和缺失的阴、阳对照，对结果判别一目了然。用于选育种子碱性脂肪酶缺失的水稻等作物品种，可从根本上解决稻谷陈化变质的问题。
③、不需复杂的实验条件和高精密的试验仪器。易于制成试剂盒，便于携带和推广。对使用者来说，不要求较高的文化，步骤简单，并可根据对照进行结果判断，易于操作；④、本快速显色方法也可用于其它作物如大豆、玉米、花生等种子碱性脂肪酶活性检测。
本发明的脂肪酶的酶活的快速检测方法用途①、可供农作物育种者在选择碱性脂肪酶缺失的材料、品系、品种中，根据碱性脂肪酶酶活性有无判断碱性脂肪酶基因的表达情况，决定该材料的利用价值。
②、粮食部门(特别是国家、地方、部队专用粮贮备库)中长期种子库、农民贮粮大户作为检测其耐贮藏性，加工品质的依据。
③、该方法可以作为科研单位对脂肪酶酶(含碱性脂肪酶酶)的研究。
④、食品、医药行业作为原料质量标准之一；种子部门作为品种储藏特性鉴定的指标之一。
具体实施例方式
一、粗酶的提取取稻胚20～30粒(玉米胚则取1～2粒，双子叶作物大豆、花生等取种子子叶10～20mg)放入研钵中，加入200～1000 1PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液。
二、琼脂平板的制作琼脂粉0.3～1.0g，橄榄油或三丁酸甘油脂1～2ml，聚乙烯醇(2～5％)3～4ml，维多利亚蓝(1～2％)0.5～1.0ml，40～50mlNaOH-Gly(0.02～0.1mol/l，PH9～11)缓冲液，微波加热溶解后振荡倒并倾倒到平皿上凝固形成琼脂平板。
三、脂肪酶活性的测定在固体琼脂平板上打孔，后用注射针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与平皿底部紧贴，将粗酶液约100～200l加入孔中，置于30℃～40℃恒温培养箱中进行酶解反应，定时观察孔周围的变色情况。有变色圈则表示碱性脂肪酶活性高，无变色圈则表示碱性脂肪酶缺失。
权利要求
1.作物种子碱性脂肪酶活性快速检测方法，包括以下步骤(1)、取种子中的碱性脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液配制粗酶液；(2)、制作固体琼脂检测平板；(3)、在固体琼脂平板上打孔，加粗酶液，定时观察孔周围的变色情况，有变色圈则表示碱性脂肪酶活性高，无变色圈则表示碱性脂肪酶缺失。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)、粗酶液的制备取稻胚20-40粒放入研钵中，加入150-300l PH7.0-7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；玉米胚则取1～4粒，双子叶作物大豆、花生等取种子子叶10～20mg放入研钵中，加入800-1200l PH7.07.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；(2)、琼脂平板的制作组方比例琼脂粉0.3～1.0g，橄榄油或三丁酸甘油脂1～2ml，2～5％聚乙烯醇3～4ml，1～2％维多利亚蓝0.5～1.0ml，0.02～0.1mol/l，PH9～11的NaOH-Gly缓冲液40～50ml；(3)、脂肪酶活性的测定在固体琼脂平板上打孔，将粗酶液加入孔中，置于25-40℃恒温培养箱中进行酶解反应，定时观察孔周围的变色情况，有变色圈则表示碱性脂肪酶活性高，无变色圈则表示碱性脂肪酶缺失。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤(1)、(2)、(3)为(1)、粗酶液的制备取稻胚30粒放入研钵中，加入200l PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；玉米胚则取1～2粒，双子叶作物大豆、花生等取种子子叶10～20mg放入研钵中，加入1000l PH7.5 Tris-HCl缓冲液，充分研磨后，即粗酶液；(2)、琼脂平板的制作组方比例琼脂粉0.5g，三丁酸甘油脂1.25ml，3％聚乙烯醇3.75ml，1％维多利亚蓝0.5ml，0.05mol/l、PH10.0的NaOH-Gly缓冲液45ml；(3)、脂肪酶活性的测定在固体琼脂平板上打孔，后用注射针头将孔内琼脂挑出，在酒精灯上烘烤背面，使琼脂与平皿底部紧贴，将粗酶液约1001加入孔中，置于30℃恒温培养箱中进行酶解反应。
全文摘要
本发明公开了一种作物种子碱性脂肪酶活性快速检测方法，其操作步骤是先取种子中的碱性脂肪酶富集部位，用Tris－HCl缓冲液配制粗酶液；然后加到固体琼脂平板的孔中，进行酶解反应，定时观察孔周围的变色情况，有变色圈则表示碱性脂肪酶活性高，无变色圈则表示碱性脂肪酶缺失。可用于其它作物如大豆、玉米、花生等种子碱性脂肪酶活性检测。不需复杂的实验条件和高精密的试验仪器，易于制成试剂盒，便于携带和推广。
文档编号G01N1/28GK1773262SQ20051009515
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月27日 优先权日2005年10月27日
发明者张瑛, 吴跃进, 余增亮, 何成芳, 蒋家月, 刘洁, 吴瑾华, 陈叶萌 申请人:中国科学院等离子体物理研究所
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