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专利名称：蜂胶超临界CO₂萃取物GC-MS指纹图谱及构建方法
技术领域：
本发明涉及保健食品活性成分检测方法领域，尤其涉及利用固相微萃取及GC-MS 联用技术构建蜂胶超临界(X)2萃取物指纹图谱信息及构建方法。
背景技术：
蜂胶中含有丰富的黄酮类和萜烯类等活性物质，具有独特的保健功能和医学价 值。一般一群5万飞万只的蜜蜂，一年大约只能生产蜂胶10(Tl50g，我国年产蜂胶仅仅 300吨左右，因此蜂胶是一种稀缺资源。大量的研究表明，超临界(X)2萃取技术是获取蜂胶 中高活性组分的重要手段，已经被应用于生产实际。与传统的乙醇萃取物相比，蜂胶的超临 界0)2萃取物组分种类更为丰富，尤其是含有大量具有抗癌效果的萜烯类、酯类物质，其免 疫活性更为显著。通过GC-MS分析证明，蜂胶超临界CO2萃取物中含有120多种组分。但 是目前有关蜂胶超临界(X)2萃取物真伪鉴别技术的研究相对滞后，难以遏制市场上以次充 好的现象。如何建立一种相对简便且科学的分析方法，是识别是否为蜂胶超临界(X)2萃取 物的重要依据，对于促进蜂胶超临界(X)2萃取物制品的规范化生产有着重要的意义。
目前用于鉴别蜂胶真伪的有效方法很少。对于蜂胶原料而言，有两个标准可以用 于对原料对鉴别一个是商业部颁发的标准代号为SB/T10096-92的蜂胶，另一个是国家农 业部颁发的标准代号为NY/T5136-2002的无公害食品蜂胶。对于蜂胶有机溶剂萃取物而 言，有人建立了液相色谱(HPLC)指纹图谱(周萍等，不同产地蜂胶HPLC指纹图谱测定及真 伪判定，中国蜂业，2009,60 (10) 5-8 ；朱恩圆等，蜂胶HPLC指纹图谱及质量控制，中国中药 杂志，2005，30 (18) 1423-1425)。蜂胶超临界CO2萃取物的主要成分是挥发性较强的萜烯类 和酯类物质，有人探讨过蜂胶超临界(X)2萃取物气相色谱(GC)指纹图谱的建立(马海乐等， 蜂胶超临界(X)2萃取物的GC指纹图谱研究，养蜂科技2005. (1)，36-38)，但是由于GC分析 中，采用氯仿溶解、离心并对上清液用微孔滤膜过滤的方法对样品进行提�。�这种样品处理 方法对蜂胶超临界(X)2萃取物中最具活性的萜烯类物质难以提取出来，导致采用GC指纹图 谱甄别蜂胶超临界(X)2萃取物的真伪有一定的局限性。
针对上述现状，本发明选用固相微萃取(SPME)对蜂胶超临界CO2萃取物中的主要 易挥发性活性成分进行高效富集，采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定其化学组成。 以我国9个蜂胶主要产地的11个蜂胶样品为研究对象，建立国产蜂胶超临界(X)2萃取物的 GC-MS指纹图谱。发明内容
本发明的目的是提供一种用GC-MS指纹图谱鉴别蜂胶超临界(X)2萃取物的方法， 并可将蜂胶超临界(X)2萃取物指纹图谱作为其质量控制及真伪鉴别的指标之一，本发明通 过比较全国9个蜂胶主要产地的11个蜂胶超临界(X)2萃取物样品建立指纹图谱，用以进行 国内不同产地蜂胶超临界(X)2萃取物的质量真伪的鉴别。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下，所述蜂胶超临界(X)2萃取物标准图谱，其共有峰有8个，图谱总长度为60min，具体如下1号峰，苯甲酰基乙烯二乙酸，平均保留时间RT为9. 56min,相对峰面积为 2. 04% 16· 48% ；2号峰，苯甲醇，平均保留时间RT为13. 3%iin，相对峰面积为13. 97% 59. 59% ； 3号峰，1- -j^一炔，平均保留时间RT为16. 38min，相对峰面积为0. 44% 1. 98% ； 4号峰，苯乙醇，平均保留时间RT为16. 81min，相对峰面积为2. 64%^26. 79% ； 5号峰，乙酸苯甲酯，平均保留时间RT为19. 32min，相对峰面积为0. 44% 3. 58% ； 6号峰，3-苯基-2-丙烯醛，平均保留时间RT为24. 24min,相对峰面积为 0. 09% 0· 96% ；7号峰， -荜澄茄油烯，平均保留时间RT为28. 90min，相对峰面积为0. 1Ρ/Γ0. 96% ； 8号峰，苯甲酸苯甲酯，平均保留时间RT为43. 97min，相对峰面积为0. 03% 0. 42%。
所述蜂胶超临界(X)2萃取物标准图谱的构建方法，按照下述步骤进行(1)供试品的制备；(2)固相微萃取方法；(3)气相色谱-质谱分析；(4)建立指纹图■i並 曰ο
其中所述供试品的制备过程如下即将蜂胶样品置于-20°C的冰箱内冷冻过夜， 将冷冻过后的蜂胶样品用高速粉碎机粉碎过20目筛网；称取粉碎过后的蜂胶样品置于超 临界(X)2萃取釜中萃取4 h后得到蜂胶的超临界CO2萃取物(每个样品进行3次平行萃�。� 将萃取物混合均勻)。
其中所述的蜂胶超临界CO2萃取的条件萃取釜温度35 °C、压力25 MPa，分离釜 温度40 °C、压力6、MPa，C02流量2(T30 L-^10上样量根据超临界萃取装置的萃取釜的 不同而定。
其中所述的固相微萃取方法如下蜂胶超临界(X)2萃取物用砚钵砚碎，称取样品 置于样品瓶中封口，60°c平衡lOmin。然后插入装有萃取头的手动进样器，60°C下顶空吸附 30min，270°C下解吸 lOmin。
其中所述的气相色谱-质谱分析，气相色谱条件毛细管柱HP 5MS柱 (60mX0. 25謹i. d.，膜厚0. 32 μ m)；柱温升温程序起始温度40 °C，20°C/min升至60°C， 保持5min，然后以3 V /min升至沘0 °C，保持lOmin。进样口 270 V ；载气He，流速1. O mL/min ；不分流进样。质谱分析条件电子轰击离子源(EI)；电子能量70eV ；灯丝发射电流 200 μ A ；离子源温度230 V ；接口温度沘0 °C ；扫描质量范围2(T510amu。各组分经过NIST 标准谱库检索和Wiley谱库相匹配，按面积归一化法计算含量。
其中所述的指纹图谱建立，将不同地区蜂胶超临界(X)2萃取物的GC-MS图谱进行 比对，提取其共有峰，组成蜂胶超临界(X)2萃取物的GC-MS指纹图谱。
本发明的优点如下1、固相微萃取(SPME)是一种蜂胶挥发性萜烯类物质高效富集方法，且具有无需有机溶 剂、简单、快速、分析样品量少等特点，能够尽可能减少被分析挥发性成分的损失。
2、以蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS分析结果建立起来的指纹图谱，代表着蜂胶超 临界(X)2萃取物主要活性物质，能有效地表征蜂胶超临界(X)2萃取物的质量。
3、本发明具有方便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握等优点。检测一个样品所需时间仅需一个半小时，所得蜂胶超临界(X)2萃取物挥发性成分达120余种。


图1为黑龙江1号样品总离子流色谱图， 图2为黑龙江2号样品总离子流色谱图，图3为黑龙江3号样品总离子流色谱图， 图4为河北样品总离子流色谱图， 图5为山东样品总离子流色谱图， 图6为河南1号样品总离子流色谱图， 图7为湖北2号样品总离子流色谱图， 图8为湖南2号样品总离子流色谱图， 图9为四川2号样品总离子流色谱图， 图10为云南2号样品总离子流色谱图， 图11为海南样品总离子色谱流图。
具体实施方式
本发明所使用的手动固相微萃取(SPME)装置(美国Supelco公司)萃取纤维头为 75 μ m碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMQ萃取头，使用前先将萃取头在气相色谱仪进 样口 270°C老化30min ；Thermo ITQ1100气相色谱-质谱联用仪为美国Hiermo Fisher公 司生产；超临界(X)2提取设备为南通华安超临界萃取有限公司生产。
本发明所使用的蜂胶样品由河南省维康蜂业有限公司、三门峡黄河蜂业公司、黑 龙江神顶峰黑蜂产品有限公司、云南白塔蜂业有限公司和海南卓津蜂业有限公司提供。
下面结合实施例和附图对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施不限 于此。
实施例1蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS标准指纹图谱的建立方法 1、供试品的制备蜂胶样品置于-20°c的冰箱内冷冻过夜，将冷冻过后的蜂胶样品用高速粉碎机粉碎过 20目筛网，称取粉碎过后的蜂胶样品200 g置于超临界(X)2萃取釜中萃取4 h后得到蜂胶 的超临界(X)2萃取物(每个样品进行3次平行萃�。�将萃取物混合均勻)。
蜂胶超临界(X)2萃取的条件萃取釜温度35 °C、压力25 MPa,分离釜温度40 °C、 压力 6 8 MPa, CO2 流量 20 30 L · 1Γ1。
、固相微萃取方法蜂胶超临界(X)2萃取物用砚钵砚碎，称取1. OOOg样品置于15mL样品瓶中封口，60°C平 衡lOmin。然后插入装有萃取头的手动进样器，60°C下顶空吸附30min，270°C下解吸lOmin。
、GC-MS分析与指纹图谱的建立方法气相色谱条件毛细管柱HP 5MS柱(60mX 0.25mm i. d.，膜厚0. 32 μ m)。
柱温升温程序起始温度40°C，200C /min升至60°C，保持5min，然后以3°C /min 升至280°C，保持lOmin。进样口 270°C ；载气He，流速1. O mL/min ；不分流进样。
质谱条件电子轰击离子源(EI)；电子能量70eV;灯丝发射电流200 μ A ；离子源温度230°C ；接口温度280°C ；扫描质量范围2(T510amu。各组分经过NIST标准谱库检索和 Wiley谱库相匹配，按面积归一化法计算含量。
将不同地区蜂胶超临界(X)2萃取物的GC图谱进行比对，提取其共有峰，组成蜂胶 超临界(X)2萃取物的GC指纹图谱。
实施例2检测11批次蜂胶超临界CO2萃取物的指纹图谱取蜂胶超临界(X)2萃取物11批次，按实施例1的方法进行检测，得11批样品的GC-MS 图谱，如图1至图11所示。通过11批次GC-MS图谱的比较，提取共有峰，确定其特征共有 峰。
建立的蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱中共有8个特征共有峰，现将其中1 批次黑龙江2号样品图谱的化合物成分分析，保留时间、峰面积以及相对峰面积列出，具体 如下1号峰，苯甲酰基乙烯二乙酸，保留时间RT为9. 60min，相对峰面积为16. 84% ； 2号峰，苯甲醇，保留时间RT为13. 6%iin，相对峰面积为58. 59% ； 3号峰，1- -j^一炔，保留时间RT为16. 4min，相对峰面积0. 85% ； 4号峰，苯乙醇，保留时间RT为16. 93min，相对峰面积3. 43% ； 5号峰，乙酸苯甲酯，保留时间RT为19. 31min，相对峰面积1. 13% ； 6号峰，3-苯基-2-丙烯醛，保留时间RT为24. 26min,相对峰面积0. 09% ； 7号峰， -荜澄茄油烯，保留时间RT为28. 90min，相对峰面积为0. 72% ； 8号峰，苯甲酸苯甲酯，保留时间RT为43. 97min，相对峰面积为0. 4%。
本发明的原理是根据蜂胶超临界(X)2萃取物挥发性成分，建立起GC-MS指纹图谱， 从色谱的整体面貌特征上把握蜂胶的品种和质量情况。
依据国家药品监督管理局对建立指纹图谱的技术要求，经分析表明11种样品的 GC-MS图谱的差异较�。�达到建立指纹图谱的技术要求。
权利要求
1.蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱，其共有峰有8个，图谱总长度为60min，具 体如下1号峰，苯甲酰基乙烯二乙酸，平均保留时间RT为9. 56min,相对峰面积为 2. 04% 16· 48% ；2号峰，苯甲醇，平均保留时间RT为13. 3%iin，相对峰面积为13. 97% 59. 59% ；3号峰，1- -j^一炔，平均保留时间RT为16. 38min，相对峰面积为0. 44% 1. 98% ；4号峰，苯乙醇，平均保留时间RT为16. 81min，相对峰面积为2. 64%^26. 79% ；5号峰，乙酸苯甲酯，平均保留时间RT为19. 32min，相对峰面积为0. 44% 3. 58% ；6号峰，3-苯基-2-丙烯醛，平均保留时间RT为24. 24min,相对峰面积为 0. 09% 0· 96% ；7号峰， -荜澄茄油烯，平均保留时间RT为28. 90min，相对峰面积为0. 1Ρ/Γ0. 96% ；8号峰，苯甲酸苯甲酯，平均保留时间RT为43. 97min，相对峰面积为0. 03% 0. 42%。
2.权利要求1所述的蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱的构建方法，按照下述步 骤进行供试品的制备、固相微萃取方法、气相色谱-质谱分析、建立指纹图谱。
3.权利要求2所述的蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱的构建方法，其中所述供 试品的制备过程如下即将蜂胶样品置于-20°C的冰箱内冷冻过夜，将冷冻过后的蜂胶样 品用高速粉碎机粉碎过20目筛网；称取粉碎过后的蜂胶样品置于超临界CO2萃取釜中萃 取4 h后得到蜂胶的超临界CO2萃取物；其中每个样品进行3次平行萃�。�将萃取物混合均 勻。
4.权利要求3所述的蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱的构建方法，其中所述的 蜂胶超临界CO2萃取的条件萃取釜温度35 °C、压力25 MPa，分离釜温度40 °C、压力6 8 MPa, CO2流量2(T30 L · IT1 ；上样量根据超临界萃取装置的萃取釜的不同而定。
5.权利要求2所述的蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱的构建方法，其中所述 的固相微萃取方法如下蜂胶超临界(X)2萃取物用砚钵砚碎，称取样品置于样品瓶中封口， 60°C平衡IOmin ；然后插入装有萃取头的手动进样器，60°C下顶空吸附30min，270°C下解吸 IOmin0
6.权利要求2所述的蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱的构建方法，其中所述 的气相色谱-质谱分析的气相色谱条件为毛细管柱HP 5MS柱；柱温升温程序起始温 度40 °C，20°C/min升至60°C，保持5min，然后以3 °C/min升至沘0 °C，保持IOmin;进 样口 270 0C ；载气He，流速1. O mL/min ；不分流进样；质谱分析条件电子轰击离子源；电 子能量70eV;灯丝发射电流200 μ A ；离子源温度230 °C;接口温度观0 °C ；扫描质量范围 20^510amu ；各组分经过NIST标准谱库检索和Wiley谱库相匹配，按面积归一化法计算含 量。
7.权利要求2所述的蜂胶超临界(X)2萃取物GC-MS指纹图谱的构建方法，其中所述的 指纹图谱建立指将不同地区蜂胶超临界(X)2萃取物的GC-MS图谱进行比对，提取其共有峰， 组成蜂胶超临界(X)2萃取物的GC-MS指纹图谱。
全文摘要
本发明涉及功能食品活性成分检测方法领域，公开了一种蜂胶超临界CO2萃取物GC-MS指纹图谱及构建方法。该蜂胶超临界CO2萃取物GC-MS指纹图谱，其共有峰有8个，图谱总长度为60min。按照下述步骤构建得到；将蜂胶样品置于超临界CO2萃取釜中萃取后得到蜂胶的超临界CO2萃取物；称取蜂胶样品置于样品瓶中进行固相微萃取；再进行GC-MS分析；最后将不同地区蜂胶超临界CO2萃取物的GC-MS图谱进行比对，提取其共有峰，组成蜂胶超临界CO2萃取物的GC-MS指纹图谱。本发明具有方便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握等优点。检测样品时间短，所得蜂胶超临界CO2萃取物挥发性成分达120余种。
文档编号G01N30/88GK102043031SQ201010548519
公开日2011年5月4日 申请日期2010年11月18日 优先权日2010年11月18日
发明者任晓锋, 曲文娟, 王蓓, 马海乐, 骆琳 申请人:江苏大学