专利名称：一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片及其制备方法和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种检测血清样本中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片及其制备方法 和使用方法。
背景技术：
登革热是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。临床特征为起病急骤，高 热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。登革热 病毒属B组虫媒病毒，现在归入披盖病毒科(togaviridae)黄热病毒属(flavivirus)。病 毒颗粒呈哑铃状(700X20 40nm)、棒状或球形(直径为20 50nm)。髓核为单股线状核 糖核酸(RNA)。病毒颗粒与乙型脑炎病毒相似，最外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有 型和群特异性抗原，用中和试验可鉴定其型别。登革病毒可分为4个血清型，与其他B组虫 媒病毒如乙型脑炎病毒可交叉免疫反应。免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或 抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体 的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合 物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记抗体_抗体_固相抗原 复合物，加底物显色，判断抗体含量。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平 台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸 研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩 短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测人血清中的登革热抗体，其 定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测血清中登革热抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包 括编码微球、登革热E2蛋白抗原、标准品、待检样品、生物素标记的二抗、链亲和素-藻红 蛋白，及相关的缓冲溶液，悬浮芯片系统检测荧光值。本发明提供上述检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，具体 为编码微球为带有羧基的微球，用登革热E2蛋白包被编码微球，鼠抗登革热IgG为标准 品、人血清样品作为待检样品、生物素标记的检测物为生物素化的SPA(Biotin-SPA)和生 物素化羊抗鼠IgG、用链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)作为荧光信号检测物，以上试剂均用相 关缓冲溶液稀释，所述编码微球优选031号羧基编码微球。本发明提供一种采用上述蛋白悬浮芯片检测血清样本中登革热抗体的间接免疫学检测方法，在检测过程中所有反应可在96微孔滤板上或在微量离心管中进行，其中包括 下列步骤(1)将登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被编码微球；(2)每孔或管中加入 含有已包被捕获抗原，即登革热E2蛋白抗原包被的编码微球的工作溶液，用清洗液清洗； (3)加入待测血清样品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的检测物，孵育后清洗；(5)加入 链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(6)加入检测缓冲液后混勻，(7)用悬浮芯片系 统读取MFI数值(即平均荧光强度)并分析数据判定检测结果阴性或阳性。该方法中，采用生物素标记的SPA作为检测抗体，并且其与登革热E2蛋白的 组合组成间接法检测体系；包被编码微球的捕获抗原登革热E2蛋白抗原用量为0. 1 ΙΟΟμ g/1. 25X IO6个编码微球或0. 02 400ng/2500 5000个微球/测试；标记检测 抗体SPA的生物素为羧基活性的生物素，并采用2mg/mL生物素化的检测抗体Bio-SPA以 1 2500稀释作为检测抗体进行检测。本发明还提供一种采用上述蛋白悬浮芯片定量检测血清样本中登革热抗体的方 法，该方法包括下列步骤(1)加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比稀释，(2)将系 列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应荧光值(MFI) ； (3)制作样品浓度对应MFI值的 剂量-反应标准曲线，(4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(5)可根据剂量-反应 曲线判定方法的动态检测范围，未知浓度样品可根据剂量-反应方程计算出检测样品的浓 度。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗 微球大小约5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分 析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。其在以下悬浮芯片 系统中完成检测，标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应，反应后，利用机器自动 将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中 设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目； 一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定 微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物， 则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的 微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待 测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应， 克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用 激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重 复性好等特点。本发明人经过大量和深入的研究，对登革热抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条 件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点1、抗原包被量的改进登革热E2蛋白的包被量是否合适是成功检测的关键，本发明对包被微球的抗原 包被量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原 包被量很低，本发明的登革热E2蛋白抗原包被量为0. 1 100 μ g/1. 25X IO6个微球，即 0. 02 400ngl·! g/2500 5000个微球/测试，而一般的ELISA试验所需抗原的包被量为
4lyg/测试。2、生物素标记的改进通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素 因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加 入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现 象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG(分子量 150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约27 μ L。3、检测的灵敏度及动态范围本发明的血清样品登革热抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法和悬浮芯片的灵敏 度为18. 3ng/mL ；并且悬浮芯片方法动态检测范围为4. 14 265ng/mL。4、方法的特异性本发明通过选用登革热的E2蛋白为包被抗原，以鼠抗登革热IgG为待测抗体，以 生物素化-SPA为检测物。本研究试验证明，在存在兔抗土拉血清、兔抗禽流感H5血清、兔 抗西尼罗抗体等干扰抗体存在条件下本方法具有良好的特异性。5、样品的检测能力本发明评价了悬浮芯片方法对人血清的检测能力。通过人血清的检测，初步证实 了该方法在检测人血清中登革热抗体的实用性。
图1为031号微球包被登革热E2蛋白检测登革热抗体示意图；图2为蛋白悬浮芯片方法检测鼠抗登革热IgG剂量-反应标准曲线。
具体实施例方式本发明涉及的检测登革热抗体的蛋白悬浮芯片制备方法、检测及定量方法通过下 面的具体实施方式
作进一步说明，但本发明不以任何方式受该实施例的限定。一、材料1.蛋白悬浮芯片的相关缓冲液(I)PBS 缓冲液(pH7. 4) =NaCl 137mmol/L ；KCl 2. 7mmol/L ；Na2HPO4IOmmo 1/L ； KH2PO4 2mmol/L0 用 800mL 蒸馏水溶解 8gNaCl，0. 2gKCl, 1. 44g Na2HPO4 禾口 0. 24g KH2PO40 用 HCl调节溶液的pH值至7. 4，加水至IL0分装后在15psi (1. 05kg/cm2)高压蒸汽20分钟， 或过滤除菌，保存于室温。(2)微球清洗液:PBS(ρΗ7· 4) ,0. 05% TWEEN-20。(3)微球活化缓冲液 IOOmM NaH2PO4 :3g NaH2PO4, 5N NaOH 1. 5mL，定容于 25OmL, pH 6. 2。(4)微球包被缓冲液 0· 05M MES，pH 5. 0 2. 44g MES，5N NaOHO. 15mL，定容于 250mL。(5)微球保存液PBS-TBN :PBS，0. 1%BSA,0. 02% TWEEN,0. 05%叠氮化物，pH 7. 4。(6)微球封闭液 PBS-BN =PBS, 1% BSA,0. 05%叠氮化物，ρΗ7· 4。(7)检测缓冲液:PBS, 1 % BSA, ρΗ7· 4。
(8)抗体稀释液 PBS，ρΗ7· 4。。(9)微球稀释液:PBS,1% BSA, ρΗ7· 4。(10)样品稀释液 PVX :PBS,0. 5% PVA,0. 8% PVP ；(11)生物素化检测物稀释液PBS-TBN(PBS，0. 1% BSA, 0. 02% TWEEN-20,0. 05% NaN3, pH7. 4)。(12) SA-PE 稀释液:PBS (ρΗ7· 4), 1% BSA。2.抗原与抗体本发明所使用抗原登革热E2蛋白，其可购自军事医学科学院微生物流行病研究 所。本发明所使用待测抗体为鼠抗登革热E2IgG，其可购自军事医学科学院微生物流 行病研究所，检测抗体为生物素化羊抗鼠IgG和生物素化SPA，羊抗鼠IgG和SPA，其可购自 北京欣经科生物有限公司。二、待测样品的制备1、目标分析物样品的制备目标分析物为鼠抗登革热IgG，干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检 测物外的其它抗体或其它蛋白质，包括兔抗土拉血清、兔抗禽流感H5血清、兔抗西尼罗抗 体、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等。将上述待分析样品均溶于样品稀释液液中，4°C保存。鼠抗登 革热E2IgG的储备液浓度为1. 06 μ g/mL。将待分析的鼠抗登革热IgG用样品稀释液以4倍倍比系列稀释为不同浓度样品， 以绘制样品检测剂量_反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样 品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。2、人血清样本的处理将人血清样本用样品稀释1 10稀释，例如人血清样本5 μ L加样品稀释液50 μ L 混勻后，作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。实施例1、检测登革热抗体的蛋白悬浮芯片的制备1、捕获抗原包被编码微球本发明采用的031号编码微球购自美国Bio-Rad公司，编码微球用于标记可以捕 获登革热抗体的登革热Ε2蛋白抗原，即利用登革热Ε2蛋白包被微球。Α、编码微球的活化取100 μ L (1. 25 X IO6个)编码微球到1. 5mL离心管中，14000 X g离心，小心吸出并 弃去上清液。加入100 μ L的微球清洗缓冲液悬�。鸬床⒊�14000 Xg离心，小心吸出 并弃去上清液。加入100 μ L的微球活化缓冲液，接着先加入10 μ L新鲜配置的EDC(50mg/ mL)，再加入10 μ L新鲜配置的50mg/mL的Sulfo-NHS，高速震荡30秒后用铝箔包裹，在室 温震摇20分钟。加入150 μ L的PBS (ρΗ7. 4)，震荡后，14000 Xg离心，小心吸出并弃去上清 液。加入100 μ L的PBS (ρΗ7. 4)悬浮编码微球。B、用抗原包被编码微球取捕获抗原登革热Ε2蛋白抗原1 50 μ g加入到活化后的编码微球中，用PBS缓 冲液定容至500 μ L，室温震摇2小时。14000 Xg离心，小心吸出并弃去上清液。用500 μ L 的PBS缓冲液洗一次，14000 Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入250 μ L的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000Xg离心，小心吸出并弃去上清液。加入500 μ L 的微球保存液洗涤编码微球，16000Xg离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150yL的微 球保存液悬浮编码微球，于4°C避光保存备用。C、包被微球的计数吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0. 10mm;l/400mm2)在普通显微镜下计数。 根据公式(每个大格数Xio4X稀释倍数X体积(mL))计算微球数量。2、检测抗体标记生物素A、生物素的标记分别配制好浓度为IOmM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积 的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分 装，-20°C冻存备用。B、抗体的用量以标记2mg/mL的IgG (分子量150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约 27 μ 1。实施例2、悬浮芯片制备法条件的优化1、微球包被抗原包被量的选择分另Ij以 1 μ g、5y g、10y g、15y g、20y g、25y g、30y g、35y g、40y g、45y g、50y g 的量包被100 μ L编码为031号的微球。经检测效果比较，以1 50 μ g/1. 25X IO6个编码 微球即0. 2 200ng/250() 5000个微球/包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存 待用。如图1所示，包被登革热E2蛋白抗原的031号微球均落在其正确检测区域内，并且 获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的悬浮芯片检测系统可成功用于登革热 抗体的检测。2、生物素化抗体的优化本发明分别用氨基活性的生物素，例如LC-酰胼(hydrazide)-生物素和羧基活性 的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素标记检测抗体，经质控过程检测效 果比较，本实验中Sulfo-NHS-生物素标记检测抗体检测效果较好，检测效果的方法采用本 领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述的方法。本发明人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的羊抗鼠抗体以1 1000稀释作 为检测抗体进行检测鼠血清中登革热抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-羊抗鼠 抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果；2mg/mL生物素化的SPAWl 2500稀释作 为检测人血清中登革热抗体，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-SPA可获得高检测值和 低背景值的检测效果。实施例3、样品的制备、检测及结果判定1、待测样品制备用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白悬浮芯片检测。2、样品的检测及结果判定检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下1)每孔加入50 μ L含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2)加入50 μ L检测样品，混勻后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；
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3)加入50 μ L适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混勻后室温避光 震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；5)加入125 μ L的检测缓冲液，经蜗旋重悬混勻；6)用悬浮芯片系统读取MFI数值并分析数据。3、检测结果判定根据试验研究结果与相关研究报道，本发明定义蛋白悬浮芯片方法检测登革热抗 体的最低检出限(L0D值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中， Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即 Cutoff值为=MFI (空白对照)+3倍标准差。若检测结果高于Cutoff对应荧光强度值则判 定为登革热抗体检测结果阳性；若检测结果低于Cutoff对应荧光强度值则判定为结登革 热体检测结果阴性。实施例4、悬浮芯片对登革热E2蛋白抗原的特异性试验应用悬浮芯片检测方法分别对鼠抗登革热E2IgG、兔抗结核IgG、兔抗SARS IgG, 兔抗禽登革热H5m血清、兔抗鼠疫IgG、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨等进行检测，根据实施例3中 检测结果判定标准，仅兔鼠抗登革热E2IgG为阳性，其余干扰抗体或蛋白均为阴性。说明本 发明所建立的登革热抗体的悬浮芯片检测方法与其它测试抗体均不发生交叉反应或非特 异反应。实施例5、对血清样品中登革热抗体的悬浮芯片定量检测1、鼠抗登革热E2IgG标准曲线样品制备用样品稀释液将鼠抗登革热E2IgG标准品由1. 06 μ g/mL以4倍倍比梯度稀释至 0. 004ng/mL成系列浓度样品。2、剂量-反应标准曲线的绘制按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统检测结 果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表抗体的浓度(ng/mL)，Y轴代表 悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对 数关系设定，图2中鼠抗登革热E2的浓度(ng/mL)分别为做4倍比稀释范围为S1 0. 004， S2 0. 0162，S3 0. 647，S4 0. 259，S5 1. 04，S6 4. 14，S7 16. 56，S9 :265，SlO :1060。悬浮 芯片系统根据检测结果拟合鼠抗登革热E2IgG剂量-反应标准曲线方程为FI = -2. 98016+(8993. 39+2. 98016)/[(1+(Cone/13386. 5Γ1.3289T.849933、本发明悬浮芯片法检测血清中鼠抗登革热E2IgG的灵敏度和动态范围根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即蛋白悬浮芯片方法检 测鼠抗登革热E2IgG的灵敏度为18. 3ng/mL (Cutoff = 65，MFI (空白对照)=55. 75，标准 差=3. 0606)。本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根 据标准曲线随着鼠抗登革热E2抗体浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当鼠抗登革 热E2抗体浓度超过265ng/mL时，抗原抗体的免疫反应未达到饱和状态，MFI值还没进入平 台期，说明样品中的待检物浓度还没达到使MFI值饱和的浓度，需要高浓度的样品再检测， 但受样品浓度只能达到265ng/mL的限制未能确定最高检测限，但可初步判定本发明即悬浮芯片定量检测鼠抗登革热E2IgG的动态范围为4. 14 265ng/mL。实施例6、人血清样品的检测1、人血清样品的准备将人血清样品用样品稀释液1 10稀释(人血清样本5 μ L加样品稀释液50 μ L 混勻)后用于蛋白悬浮芯片检测。2、人血清样品的检测1)每孔加入50 μ L含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；2)加入50 μ L待检测人血清样品，混勻后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并 抽滤；3)加入50 μ L适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化羊抗人抗体，混勻后室 温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；4)加入50 μ L的SA-PE，混勻后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；5)加入125 μ L的检测缓冲液，经蜗旋重悬混勻；6)用悬浮芯片系统读取MFI数值，根据标准曲线，确定待检测人血清中登革热抗 体的浓度。经过多次重复试验，生物素化SPA稀释比例选用1 2500稀释，SA-PE稀释比例 选用1 300稀释，经过对94份人血清的检测，所得的MFI值的均值与其标准差的3倍之 和为作为判断阴阳性的界值，即C utoff值为792，检测得到的MFI值如果大于792，即血清 中的登革热抗体浓度过高，可视为登革热抗体阳性可能被登革热病毒感染，如果MFI值小 于792，即血清中的登革热抗体浓度低正常值可判断为登革热抗体阴性，未感染登革热病毒 或登革热病毒隐性携带者。
权利要求
一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片，其特征在于，该芯片包括编码微球，作为包被微球抗原是登革热E2蛋白抗原，生物素标记的羊抗鼠IgG和/或SPA作为检测抗体，链亲和素 藻红蛋白作为信号检测物和相关缓冲溶液。
2.一种检测登革热抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，其特征在于，该制备方法具体为 在相关缓冲溶液中，编码微球用登革热E2蛋白抗原包被、用生物素标记的检测抗体为羊抗 鼠IgG和/或SPA、加入链亲和素-藻红蛋白作为信号检测物。
3.如权利要求2所述的检测登革热抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，其特征在于，所 述编码微球优选为031号编码微球。
4.一种采用上述蛋白悬浮芯片检测血清样本中登革热抗体的间接免疫学检测方法，其 特征在于，该方法包括下列步骤1)将登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被编码微球；2)向检测载体内加入含已包被捕获抗原编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；3)加入待测血清样品，孵育后清洗；4)加入用生物素标记的检测抗体，孵育后清洗；5)加入链亲和素_藻红蛋白，孵育后清洗；6)加入检测缓冲液后混合均勻；7)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度数值并分析数据判定检测结果。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，采用生物素标记的SPA作为检测抗体， 并且其与登革热E2蛋白的组合组成间接法检测体系。
6.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中包被所述编码微球的登 革热E2蛋白抗原用量为0. 1 100 μ g/1. 25 X IO6个编码微球或0. 02 400ng/2500 5000个微球/测试。
7.一种采用蛋白悬浮芯片定量检测血清样本中登革热抗体的方法，其特征在于，该方 法包括下列步骤1)加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释；2)将系列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应荧光值；3)制作样品浓度对应荧光值的剂量-反应曲线；4)用分析软件拟合剂量_反应曲线和方程；5)根据剂量_反应曲线判定动态检测范围，根据剂量_反应方程判断样本中登革热抗 体的浓度。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中梯度倍比稀释为4倍。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中加入的阳性检测样品为鼠抗 登革热E2IgG。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用2mg/mL生物素化的检 测抗体Bio-羊抗鼠抗体以1 1000稀释作为检测抗体进行检测。
全文摘要
本发明涉及一种检测血清样本中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片及其制备方法和使用方法。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了以登革热抗体为代表的病毒抗体蛋白悬浮芯片检测的开放性检测模式化平台。
文档编号G01N33/569GK101915836SQ20101023567
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者孙肖红, 曹晓梅, 杨宇, 杨永莉, 王静, 胡孔新 申请人:中国检验检疫科学研究院
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