专利名称：金磁微粒标记免疫层析快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫层析分析法，具体涉及采用金磁微粒标记免疫层析的快速检 测方法，主要应用于激素、蛋白质、病毒、毒品、细菌、药物分子、毒素、重金属等检测领域。
背景技术：
现有的胶体金和乳胶颗粒标记的免疫层析分析法已经在临床医学检验中得到了 广泛的应用，其基本原理是以微孔膜为固相载体，包被目标物(即被测物)的抗原或抗体， 加入待检样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细作用是标本中的目标物语膜上的包被的抗原 或抗体结合，通过胶体金与之反应形成胶体金本身的颜色(红色)或者乳胶颗粒的(蓝 色)，可通过肉眼观察检测结果。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，标记物的颜色 很淡几乎用肉眼难以判断结果，同时由于每个检测人视觉上的差异，也很难得到统一的判 断效果，同时对一些待检测样本的定量检测也有很大困难，虽然目前市场上有针对胶体金 等标记的免疫层析试纸条判读的仪器来减少人为原因的差异，但是这种仪器仅能对在固相 载体表面的标记物颜色检测，而对固相载体内部的标记物很难检测到，因此检测的灵敏度 受到很大限制。同时检测的生物样本中可能含有颜色物质会严重影响检测的结果和灵敏 度。
发明内容
本发明提出应用金磁微粒标记免疫层析检测条的快速检测方法，旨在解决传统免 疫层析分析法的检测方法在临床实践中易造成主观差异化、检测精度和灵敏度低、操作繁 复、适用领域窄的问题。本发明的基本指导思想是金磁微粒偶联抗体或配体或抗原以后在与之匹配的工 作液和免疫层析装置中能够快速，定量的高灵敏度地检测被分析物。本发明提出的金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，包括以下步骤1)金磁微粒标记待检目标物的抗体或者配体或者抗原，并溶解在层析工作液中；1. 1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，然后将待检目标物的抗体或配体或抗 原按照与金磁微粒质量比10 500 μ g Img加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0 500C >50 220rpm的空气恒温振荡器中充分反应IOmin 12h ；所述偶联缓冲液为pH = 4-9,0. 005-0. 5M的磷酸盐缓冲液、pH = 3-6,0. 1-3M的 三羟甲基氨基甲烷_盐酸溶液或PH = 6-9,0. 01-3M的醋酸盐缓冲液中的一种，所述金磁微 粒为核壳结构、组装结构、磁性氧化铁组装在核壳结构外层的金磁微粒或者基于以上三种 结构进行表面功能化修饰的金磁微粒；1. 2)于空气恒温振荡器中反应完毕，在磁性分离器上分离2 3min，弃上清，用 清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，得到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微 粒；所述清洗缓冲液为下列任一溶液pH = 4-9,0. 005-0. 5M，且含有0. 5-5% Tween20或者 0. 5-5% Triton X-100 的磷酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-3M 且含有 0. 5-5% Tween20 或者0. 5-5% Triton X-100的三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；pH = 3-6,0. 01-3M且含有 0. 5-5% Tween20 或者 0. 5-5% Triton X-100 的醋酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-10M 且含有 0. 5-5% Tween20 或者 0. 05-2% Triton X-100 的硼酸盐缓冲液；pH = 2-5,0. 01-1M 且含有 0. 5-5% Tween20或者0. 5-5% TritonX-IOO的甘氨酸-盐酸缓冲液；1. 3)封闭加入500ul 2ml的封闭剂到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微 粒中，置于20 80°C、50 220rpm的恒温振荡器中充分混勻5min 12h进行封闭；所述封闭剂是采用上述偶联缓冲液溶解了以下物质的一种或多种牛血清白蛋 白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清、山羊血清；上述组分的终浓度均为 0. 05% -10% ；1. 4)将偶联抗体且封闭完毕的金磁微粒在磁性分离器上分离2 3min，弃上清， 用清洗缓冲液清洗，去除未结合的生物分子，最后将此偶联有抗体且封闭完成的金磁微粒 溶解在层析工作液中；所述层析工作液是缓冲液基液加上效应物，其中缓冲液基液为下列任一溶液pH =4-9,0. 005-0. 5M的磷酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-3M三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液；pH =3-6,0. 01-3M醋酸盐缓冲液；pH = 6-9,0. 1-10M的硼酸盐缓冲液；pH = 2-5,0. 01-1M甘 氨酸-盐酸缓冲液；效应物是以下的一种或者几种(1)柠檬酸，终浓度为0.1%-5%，(2) 三羟甲基氨基甲烷，终浓度为0.1%-5%，(3)脱脂奶粉，终浓度为0.01%-20%，(4)叠氮 化钠，终浓度为0.01%-5%，(5)分子量4000-20000的聚乙二醇，终浓度为0.01%-5%， (6)Tween20，终浓度为 0. 5-5% ；2)制作免疫层析检测条；该免疫层析检测条包括样品垫，结合垫，免疫层析膜，吸 水纸和支撑板；2. 1)免疫层析检测条的各部件的准备和处理所述样品垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；样品垫处 理程序为将样品垫浸泡于样品垫处理液中0.5分钟到2分钟后取出，或者按照 0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例将样品垫处理液均勻喷涂于样品垫上，然后15°C 60°C烘 干或冷冻干燥，待用；所述样品垫处理液为缓冲液基液加上效应物；所述缓冲液基液为下 列溶液中任一溶液pH = 4-9，0. 005-0. 2M的磷酸盐缓冲液；pH = 6_9，0. 01-3M三羟甲基氨 基甲烷-盐酸溶液；PH = 3-6,0. 01-3M醋酸盐缓冲液；pH = 6-9，0. 1-10M的硼酸盐缓冲液； pH = 2-5，0. 01-1M甘氨酸-盐酸缓冲液；所述效应物是以下的一种或者几种(1)分子量 4000-20000的聚乙二醇，终浓度为0. 01% -5%，(2)蔗糖或者海藻糖，终浓度为5% -80%， (3) Triton X-100，终浓度为0. 5-5% ；所述结合垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；结合垫处理程序为 首先将玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型；然后将其浸泡于步骤1)所述的最初的层析工作液 中0. 5分钟到2分钟，或者采用非浸泡方式，而是按照0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例将样 品垫处理液均勻喷涂于裁剪成型的玻璃纤维或聚酯纤维裁上；然后15°C到60°C烘干或冷 冻干燥；然后取经过步骤1. 4)所得的含有偶联抗体或配体或抗原且封闭金磁微粒的层析 工作液按照0. 5ul/20cm2-20ul/20cm2的比例喷涂于的结合垫上；最后15°C 60°C烘干或冷 冻干燥，待用；
所述免疫层析膜的材质为硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜、聚酯膜，或硝酸 纤维素与醋酸纤维素的混合膜之一；针对偶联抗体或配体或抗原选择的不同，免疫层析膜 的处理程序分别为若检测抗原，则金磁微粒偶联与检测抗原特异结合的抗体，首先取与待检目标物 特异结合的另一抗体，按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成 检测带，取多克隆抗体按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成 与所述检测带平行的质检带，然后15°C 60°C烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫 层析膜置于所述封闭剂中浸泡0. 5秒到30分钟，然后15°C 60°C烘干或冷冻干燥，待用；若检查抗体，则金磁微粒偶联检测抗体特异结合的抗原，则首先取与待检目标物 特异结合的另一抗原，按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成 检测带，取多克隆抗体按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成 与所述检测带平行的质检带，然后15°C 60°C烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫 层析膜置于所述封闭剂中浸泡0. 5秒到30分钟，然后15°C 60°C烘干或冷冻干燥，待用；若检测小分子受体，则金磁微粒偶联与待检目标物特异结合的配体，则首先取与 待检目标物特异结合的另一配体，按照0. lul/20cm-20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层 析膜上形成检测带，然后15°C 60°C烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫层析膜置 于所述封闭剂中浸泡0. 5秒到30分钟，然后15°C 60°C烘干或冷冻干燥，待用；2. 2)免疫层析检测条各部件组装成型，即在带有不干胶的支撑板上依次贴上免疫层析膜、样品垫、结合垫和吸水垫，免疫层 析膜设于底衬上的中部，样品垫和吸水垫分别设于支撑板上的两边，结合垫设于加样垫与 层析膜之间，层析膜的另一端接吸水垫，然后用不干胶彻底固定，最后裁切成免疫层析检测 条；3)利用双抗夹心法或竞争法，对被测样品进行目视化判读或磁信号定量检测。上述样品垫，结合垫和免疫层析膜在制作时，经过15°C到60°C烘干或冷冻干燥 后，最好置于4°C待用。上述步骤3)在临床实践过程中，一般对被测样品定性地可目视化判读的同时，也 进行高灵敏度的定量检测。上述步骤3)采用双抗夹心法或竞争法检测方法，对样品进行目视化判读或磁信 号定量检测，其检测原理为待测目标物在点样带与金磁微粒标记抗体形成免疫复合物，该复合物在膜上移动 与固定在膜另一端的特异抗体或者配体发生特异结合，形成固定化的免疫复合物，由于该 免疫复合物携带由标记的金磁微粒，因此形成了检测带的金磁标记信号。与此同时，部分游 离的金磁微粒标记的抗体可以越过固定化抗体或配体或抗原带，结合到远端的包被抗抗体 (二抗)质检带，形成新的金磁微粒结合带，质检带的金磁信号。将样品滴加在样品垫上或者将试纸条的样品垫段浸泡于测试液0. 5分钟到1分钟 后取出(样品液切勿没过结合垫带域)，检测包括可目视化和磁信号的检测。在双抗夹心法 检测中在检测带和控制带有可见的红色或淡红色线表示阳性，如果在控制带有可见的红色 线表示阴性，如果出现控制带无颜色显现则表示测试无效。利用磁信号检测需要使用磁性 免疫阅读仪，在在检测带和控制带有明显的磁信号出现表示阳性，如果在控制带有明显的磁信号表示阴性，如果出现控制带没有明显磁信号显现则表示测试无效。利用竞争法的检测中在检测带和控制带有可见的红色或淡红色线表示阴性，如果 在控制带有可见的红色线表示阳性，如果出现控制带无颜色显现则表示测试无效。利用磁 信号检测需要使用磁性免疫阅读仪，在在检测带和控制带有明显的磁信号出现表示阴性， 如果在控制带有明显的磁信号表示阳性，如果出现控制带没有明显磁信号显现则表示测试 无效。另外，在临床实践总结出，对于一些特殊抗原和物质检测需要应用在偏酸或偏碱 值，比如在消化道疾病方面的，需要在偏酸性的环境中，而在一些药物滥用者的直肠分泌物 的检查可能需要偏碱性的环境，因此需要针对不同的检测对象(样本)，选择适宜值的各种 缓冲液。同理，由于检测样本形式多样，如血清、尿样、唾液。这些多种样本组分复杂，可能 会影响层析的效果。所以，在缓冲液的浓度，以及相应效应物的浓度的选择上，也需要充分 考虑样本形式对免疫层析的干扰。例如，在病人代谢失调的尿液中，一些盐离子浓度会很高 使金磁微粒表面电荷发生变化，影响层析的效果，所以相应要使用较高的表面活性剂的用 量，Tween20的用量可能达到3%以上。再如，环境检测中一些特殊的水溶液样本，可能含有 多种金属成分，这些金属成分或影响配体活性，就需要低缓冲液浓度，比如0. 005的磷酸盐 缓冲液。本发明对金磁微粒的使用，主要是考虑到其如下优点1、金磁微粒作为一种超顺磁性纳米微粒，只有在磁场中才具有磁响应性。这就使 得磁性微粒在溶液中可以自由混合而不会因相互作用而发生聚合。所以在标记或偶联抗 体，封闭过程中省去的离心的复杂过程。2、金磁微粒物理性质非常稳定，在持续一定时间之后仍然可以重复实验测量结 果。是存档备案的理想选材。3、磁场的信号强弱与磁性微粒的磁性强度呈线性关系。这一磁性检测固有的线性 特点保证了分析的高灵敏度和准确性，以及宽广的检测区间。4、生物材料及生物体内极少有磁性物质存在.这一特性克服了常规检测中样品 颜色的干扰。基于上述理论，本发明将免疫反应的高特异性与金磁微粒良好的光学和磁学性质 有机的结合，利用金磁微粒的具有胶体金特殊颜色和聚磁性微粒的超顺磁性，建立快速、特 异、简便、灵敏的免疫层析检测方法，既可以通过金磁微粒的特征颜色进行可目视化的判读 也可通过金磁微粒磁信号的强弱对被测物进行定量检测，方法简单，成本低，适用于血样、 尿样、唾液等样本，应用于激素、蛋白质、病毒、毒品、细菌、环境污染等检测，可在医院、海 关、机场、家庭等场所使用，实现人体与动植物的疾病检测，环境的检测，食品安全检测、以 及毒品和药物滥用检测等。
图1是利用磁免疫色谱分析系统对试纸条上金磁微粒的磁信号的强弱检测阴性 的结果；图2是在免疫试纸条上金磁微粒的可见的颜色检测阳性与阴性的结果；
图3为金磁微粒标记快速免疫层析试纸条结构示意图。从图1，可以看出检测带的磁信号与周围背景相似，而质控带的磁信号明显高于周 围背景显示出阴性结果。附图标号说明1-金磁标结合垫，2-检测线T，3-质控线C，4-吸水材料，5-PVC胶板，6_层析膜 (NC硝酸纤维素膜)，7-样品垫。
具体实施例方式本发明利用金磁微粒的磁学性质和特征颜色和易于偶联生物分子的特性，将金磁 微粒标记抗体或配体或抗原，用然后将此标记物涂覆于一定材质的结合垫上，目标物的另 一抗体(单抗或多抗)包被在免疫层析膜上形成检测带，在此包被膜上同时平行包被抗抗 体(二抗)形成质控带。再将处理过的样品垫，结合垫，免疫层析膜，和吸水垫依次粘贴在支 撑板板上，利用双抗体夹心法和竞争法检测样品中是否含有目标物和定量检测目标物。当 待测样品中含有目标物时，目标物先与金磁微粒标记抗体结合，由于层析作用反应结合物 沿包被层析膜向前移动，当遇到包被抗体时形成抗体一抗原(目标物)一金磁微�？固甯� 合物而富集在检测带上，多余的金磁微粒标记物继续移动到控制带位置，由于二抗与金磁 微粒标记的抗体发生免疫反应，又富集在控制带上，0. 5-20分钟后，取出试纸条，用肉眼在 检测带和质控带上观察结果也可以通过磁性免疫色谱阅读进行结果的定量判读。如果质控 带处都没有颜色或者没有明显的磁信号，说明试纸条有质量问题，测试无效。各种金磁微粒组装型磁性复合微�：秃�/壳型超顺磁性复合微粒，以及对金磁 微粒进行的各种表面功能化修饰。以下结合本发明的技术方案提供实施例。实施例一基于夹心法应用金磁微粒标记快速免疫层析试纸条对早孕检测(健康检测领域)1、金磁微粒标记人绒毛膜促性腺激素HCG的β _抗体，并溶解在层析工作液中1. 1)取金磁微粒，用ρΗ = 7，0. OlM的磷酸盐缓冲液平衡3次，将人绒毛膜促性腺 激素HCG的β -抗体按200 μ g/mg金磁微粒的比例加入经ρΗ = 7，0. OlM的磷酸盐缓冲液 的平衡处理的金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒温振荡器中充分反应30min ；1. 2)反应完毕，在磁性分离器上分离3min，弃上清，用ρΗ = 7，0. OlM的磷酸盐缓 冲液含有0.5% Tween20清洗，去除未结合在金磁微粒表面的蛋白分子；重复以上步骤三 次。1. 3)封闭加入Iml的封闭剂到表面已固定HCG抗体的金磁微粒中，置于35°C、 ISOrpm的空气恒温振荡器中充分混勻2h进行封闭。封闭剂为含有5%的牛血清白蛋白 (BSA)、脱脂奶粉的ρΗ = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液。1. 4)反应完毕，在磁性分离器上分3min，弃上清，用ρΗ = 7，0. OlM的磷酸盐缓冲 液含有0. 5% Tween 20清洗，去除未结合在金磁微粒表面的蛋白分子；重复以上步骤三次； 最后溶解在层析工作液中。这里的层析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液其中含有 以下效应物(l)BSA，最终浓度为1%。(2)脱脂奶粉，最终浓度为2%。(3)蔗糖，最终浓度 为5%。(4)Tween20，最终浓度为5%。
2、免疫层析装置的各个组件的处理。2. 1)样品垫为聚酯纤维。样品垫处理程序为将聚酯纤维裁剪成5cmX5cm然后 浸泡于样品垫处理液中0. 5分钟，然后30°C烘干，置于4°C待用，样品垫处理液是pH = 7， 0. OlM的磷酸盐缓冲液含有蔗糖，最终浓度5%2.2)结合垫的材质为，亲水的玻璃纤维。结合垫处理程序为将结合垫裁剪成 5cmX 5cm然后浸泡于层析工作液中0. 5分钟，然后30°C烘干，然后将0. 5ml步骤1中溶解 在层析工作液中金磁微粒标记人绒毛膜促性腺激素HCG的β -抗体喷涂在5cmX 5cm的结 合垫上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)免疫层析膜的材质为，硝酸纤维素膜。免疫层析膜的处理首先将20ul浓度为 2. 5mg/ml的人绒毛膜促性腺激素HCG的α -抗体喷涂成线在长度为30厘米的免疫层析膜 上形成检测带，和将20ul浓度为2. 5mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂成线在在长度为30 厘米的免疫层析膜上形成质检带，检测带与质检带相隔4毫米。然后35°C到60°C烘干或冷 冻干燥。封闭将包被有抗体的免疫层析膜置于封闭剂中，30°C烘干，置于4°C待用。封闭 剂为含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%的脱脂奶粉的pH= 7，0. OlM的磷酸盐缓冲液。2.4)将样品垫，结合垫，和吸水垫裁剪成一定大小5cmX 3cm，在带有不干胶的支 撑板上依次贴上层析膜、样品垫、结合垫和吸水垫，免疫层析膜设于底衬上的中部，样品垫 和吸水垫分别设于支撑板上的两边，结合垫设于加样垫与层析膜之间，层析膜的另一端接 吸水垫，然后用不干胶彻底固定。最后，将其裁剪宽度为4毫米的试纸条。2.5)样品测试和结果判读。将待检测的妇女尿样滴加在样品垫上3分钟后判读结果，检测包括可目视化和磁 信号的检测。检测中在检测带和控制带有可见的红色或淡红色线表示阳性，如果在控制带 有可见的红色线表示阴性，如果出现控制带无颜色显现则表示测试无效。检测结果如图1 和图2。利用磁信号检测需要使用磁性免疫阅读仪，在检测带和控制带有明显的磁信号出现 表示阳性，如果在控制带有明显的磁信号表示阴性，如果出现控制带明显磁信号显现则表 示测试无效实施例二 基于夹心法应用金磁微粒标记快速免疫层析试纸条检测心肌钙蛋白(疾病检测 领域)1、金磁微粒标记心肌钙蛋白单克隆抗体，并溶解在层析工作液中1. 1)取金磁微粒lmg，用pH = 7，0. OlM的磷酸盐缓冲液平衡3次，将lmg/ml的心 肌钙蛋白单克隆抗体mAb2-19C7，200 μ g加入金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒温振荡器 中充分反应30min ；1. 2)反应完毕，在磁性分离器上分离3min，吸去上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸盐 缓冲液含有0. 5% Tween20清洗，去除未标记的心肌钙蛋白抗体I分子；重复以上步骤三 次。1. 3)封闭加入Iml的封闭剂到表面已固定心肌钙蛋白抗体I的金磁微粒中，置 于35°C、ISOrpm的空气恒温振荡器中充分混勻2h进行封闭。封闭剂为含有5%的牛血清白 蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉、5%小牛血的pH = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液。
1. 4)反应完毕，在磁性分离器上分离3min，弃上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸盐缓 冲液含有0.5% Tween20清洗，去除未结合在金磁微粒表面的抗体分子；重复以上步骤三 次；最后溶解在层析工作液中。这里的层析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液其中含 有以下效应物浓度为2 %的柠檬酸，浓度为1 %的BSA，浓度2 %的脱脂奶粉，浓度为0. 5 %的 叠氮化钠，浓度为2%的聚乙烯吡咯烷酮，浓度为2%的分子量6000的聚乙二醇，浓度5%的 蔗糖，浓度5%的Tween20。2、心肌钙蛋白免疫层析装置的各个组件的处理。2. 1)样品垫为玻璃纤维膜。样品垫处理程序为将玻璃纤维膜裁剪成5cmX5cm， 然后浸泡于样品垫处理液中0. 5分钟取出，然后30°C烘干，置于4°C待用。样品垫处理液是 PH = 7，0. OlM的硼酸盐缓冲液，缓冲液还含有(1)5%的聚乙烯吡咯烷酮，。(2)浓度为5% 的聚乙二醇6000。(3)浓度为5%蔗糖。(4)浓度为5%的Tween20。2. 2)结合垫的材质选用聚酯纤维膜。结合垫处理程序为首先将聚酯纤维膜裁剪 成5cmX5cm浸泡于层析工作液中0. 5分钟取出，然后30°C烘干，然后将0. 5ml金磁微粒标 记心肌钙蛋白抗体喷涂在5cmX5cm的结合垫上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)层析膜的制备心肌钙蛋白检测中层析膜选用硝酸纤维素膜。免疫层析膜的 处理首先将浓度为2. 5mg/ml,20ul将心肌钙蛋白单克隆抗体mAbl_16All喷涂成线在长度 30cm免疫层析膜上形成检测带，和羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂成线在长度30cm免疫层析膜 上形成质检带，检测带与质检带相隔5毫米。然后35°C到60°C烘干或冷冻干燥。封闭将包被有抗体的免疫层析膜置于封闭剂中，30°C烘干，置于4°C待用。封闭 剂为含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉、5%小牛血的pH= 7，0.01M的磷酸盐缓 冲液。2. 4)在支撑板上依次贴上层析膜、样品垫、结合垫和吸水垫，免疫层析膜设于底衬 上的中部，样品垫和吸水垫分别设于支撑板上的两边，结合垫设于加样垫与层析膜之间，层 析膜的另一端接吸水垫，最后用不干胶固定。然后裁剪成宽4毫米宽的试纸条。2.5)样品测试和结果判读。将待检病人的血清样品滴加在样品垫上3分钟后判读结果，检测包括可目视化和 磁信号的检测。检测中在检测带和控制带有可见的红色或淡红色线表示阳性，如果在控制 带有可见的红色线表示阴性，如果出现控制带无颜色显现则表示测试无效。利用磁信号检 测需要使用磁性免疫阅读仪，在检测带和控制带有明显的磁信号出现表示阳性，如果在控 制带有明显的磁信号表示阴性，如果出现控制带明显磁信号显现则表示测试无效。实施例三基于竞争法利用金磁微粒检测食品中的黄曲霉素(食品安全检测领域)1、金磁微粒标记抗黄曲霉素单克隆抗体clone 3A7，并溶解在层析工作液中1. 1)取金磁微粒lmg，用pH = 7，0. OlM的磷酸盐缓冲液平衡3次，将lmg/ml的抗 黄曲霉素单克隆抗体clone 3A7，200 μ g加入金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒温振荡器 中充分反应30min ；1. 2)反应完毕，在磁性分离器上分离3min，吸去上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸盐 缓冲液含有0. 5% Tween20清洗，去除未标记的抗黄曲霉素单克隆抗体clone 3A7 ；重复以 上步骤三次；
1. 3)封闭加入Iml的封闭剂到表面已固定心肌钙蛋白抗体I的金磁微粒中，置 于35°C、ISOrpm的空气恒温振荡器中充分混勻2h进行封闭。封闭剂为含有5%的牛血清白 蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉、5%小牛血的pH= 7，0. OlM的磷酸盐缓冲液；1. 4)反应完毕，在磁性分离器上分离3min，弃上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸盐缓 冲液含有0.5% Tween20清洗，去除未结合在金磁微粒表面的抗体分子；重复以上步骤三 次；最后溶解在层析工作液中。这里的层析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液其中含 有以下效应物浓度为2 %的柠檬酸，浓度为1 %的BSA，浓度2 %的脱脂奶粉，浓度为0. 5 %的 叠氮化钠，浓度为2%的聚乙烯吡咯烷酮，浓度为2%的分子量6000的聚乙二醇，浓度5%的 蔗糖，浓度5%的Tween20。2、黄曲霉素检测免疫层析装置的各个组件的处理。2. 1)样品垫为玻璃纤维膜。样品垫处理程序为将玻璃纤维膜裁剪成5cmX5cm， 然后浸泡于样品垫处理液中0. 5分钟取出，然后30°C烘干，置于4°C待用。样品垫处理液是 PH = 7，0. OlM的硼酸盐缓冲液，缓冲液还含有(1)5%的聚乙烯吡咯烷酮，。(2)浓度为5% 的聚乙二醇6000。(3)浓度为5%蔗糖。(4)浓度为5%的Tween20。2. 2)结合垫的材质选用聚酯纤维膜。结合垫处理程序为首先将聚酯纤维膜裁剪 成5cmX5cm浸泡于层析工作液中0. 5分钟取出，然后30°C烘干，然后将0. 5ml金磁微粒标 记抗黄曲霉素单抗体喷涂在5cmX5cm的结合垫上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)层析膜的制备黄曲霉素检测中层析膜选用硝酸纤维素膜。免疫层析膜的处 理首先将浓度为2. 5mg/ml，20ul将黄曲霉素与牛血清白蛋白的共价偶联物喷涂成线在长 度30cm免疫层析膜上形成检测带，和羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂成线在长度30cm免疫层 析膜上形成质检带，检测带与质检带相隔5毫米。然后35°C到60°C烘干或冷冻干燥。封闭将包被有抗体的免疫层析膜置于封闭剂中，30°C烘干，置于4°C待用。封闭 剂为含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉、5%小牛血的pH = 7，0. OlM的磷酸盐缓 冲液。2. 4)在支撑板上依次贴上层析膜、样品垫、结合垫和吸水垫，免疫层析膜设于底衬 上的中部，样品垫和吸水垫分别设于支撑板上的两边，结合垫设于加样垫与层析膜之间，层 析膜的另一端接吸水垫，最后用不干胶固定。然后裁剪成宽4毫米宽的试纸条。2.5)样品测试和结果判读。将待检样品滴加在样品垫上3分钟后判读结果，检测包括可目视化和磁信号的检 测。检测中在检测带和控制带有可见的红色或淡红色线表示阴性，如果在控制带有可见的 红色线表示阳性，如果出现控制带无颜色显现则表示测试无效。利用磁信号检测需要使用 磁性免疫阅读仪，在检测带和控制带有明显的磁信号出现表示阴性，如果在控制带有明显 的磁信号表示阳性，如果出现控制带明显磁信号显现则表示测试无效。实施例四基于竞争法利用金磁微粒检测吗啡(毒品和药物滥用检测领域)1、金磁微粒标记抗吗啡的单克隆抗体，并溶解在层析工作液中1. 1)取金磁微粒lmg，用pH = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液平衡3次，将lmg/ml的 抗吗啡的单克隆抗体200ug加入金磁微粒中，置于35°C、ISOrpm的恒温振荡器中充分反应 30min ；
1. 2)反应完毕，在磁性分离器上分离3min，吸去上清，用pH = 7，0. OlM的磷酸盐 缓冲液含有0. 5% Tween20清洗，去除未标记的抗吗啡的单克隆抗体；重复以上步骤三次。1. 3)封闭加入Iml的封闭剂到表面已固定心肌钙蛋白抗体I的金磁微粒中，置 于35°C、ISOrpm的空气恒温振荡器中充分混勻2h进行封闭。封闭剂为含有5%的牛血清白 蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉、5%小牛血的pH = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液。1. 4)反应完毕，在磁性分离器上分离3min，弃上清，用pH = 7,0. OlM的磷酸盐缓 冲液含有0.5% Tween20清洗，去除未结合在金磁微粒表面的抗体分子；重复以上步骤三 次；最后溶解在层析工作液中。这里的层析工作液是PH = 7,0. OlM的磷酸盐缓冲液其中含 有以下效应物浓度为2 %的柠檬酸，浓度为1 %的BSA，浓度2 %的脱脂奶粉，浓度为0. 5 %的 叠氮化钠，浓度为2%的聚乙烯吡咯烷酮，浓度为2%的分子量6000的聚乙二醇，浓度5%的 蔗糖，浓度5%的Tween20。2、吗啡检测层析装置的各个组件的处理。2. 1)样品垫为玻璃纤维膜。样品垫处理程序为将玻璃纤维膜裁剪成5cmX5cm， 然后浸泡于样品垫处理液中0. 5分钟取出，然后30°C烘干，置于4°C待用。样品垫处理液是 PH = 7，0. OlM的硼酸盐缓冲液，缓冲液还含有(1)5%的聚乙烯吡咯烷酮，。(2)浓度为5% 的聚乙二醇6000。(3)浓度为5%蔗糖。(4)浓度为5%的Tween20。2. 2)结合垫的材质选用聚酯纤维膜。结合垫处理程序为首先将聚酯纤维膜裁剪 成5cmX5cm浸泡于层析工作液中0. 5分钟取出，然后30°C烘干，然后将0. 5ml金磁微粒标 记抗吗啡单克隆抗体喷涂在5cmX5cm的结合垫上。然后30°C烘干，置于4°C待用。2. 3)层析膜的制备吗啡检测中层析膜选用硝酸纤维素膜。免疫层析膜的处理首 先将浓度为2. 5mg/ml,20ul将吗啡与牛血清白蛋白的共价偶联物喷涂成线在长度30cm免 疫层析膜上形成检测带，和羊抗鼠IgG多克隆抗体喷涂成线在长度30cm免疫层析膜上形成 质检带，检测带与质检带相隔5毫米。然后35°C到60°C烘干或冷冻干燥。封闭将包被有抗体的免疫层析膜置于封闭剂中，30°C烘干，置于4°C待用。封闭 剂为含有5%的牛血清白蛋白(BSA)、5%脱脂奶粉、5%小牛血的pH = 7，0. OlM的磷酸盐缓 冲液。2. 4)在支撑板上依次贴上层析膜、样品垫、结合垫和吸水垫，免疫层析膜设于底衬 上的中部，样品垫和吸水垫分别设于支撑板上的两边，结合垫设于加样垫与层析膜之间，层 析膜的另一端接吸水垫，最后用不干胶固定。然后裁剪成宽4毫米宽的试纸条。2.5)样品测试和结果判读。将待检样品滴加在样品垫上3分钟后判读结果，检测包括可目视化和磁信号的检 测。检测中在检测带和控制带有可见的红色或淡红色线表示阴性，如果在控制带有可见的 红色线表示阳性，如果出现控制带无颜色显现则表示测试无效。利用磁信号检测需要使用 磁性免疫阅读仪，在检测带和控制带有明显的磁信号出现表示阴性，如果在控制带有明显 的磁信号表示阳性，如果出现控制带明显磁信号显现则表示测试无效。
权利要求
一种金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，包括以下步骤1)金磁微粒标记待检目标物的抗体或者配体或者抗原，并溶解在层析工作液中；1.1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，然后将待检目标物的抗体或配体或抗原按照与金磁微粒质量比10～500μg∶1mg加入经平衡处理后的金磁微粒中，置于0～50℃、50～220rpm的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；所述偶联缓冲液为pH＝4 9，0.005 0.5M的磷酸盐缓冲液、pH＝3 6，0.1 3M的三羟甲基氨基甲烷 盐酸溶液或pH＝6 9，0.01 3M的醋酸盐缓冲液中的一种，所述金磁微粒为核壳结构、组装结构、磁性氧化铁组装在核壳结构外层的金磁微粒或者基于以上三种结构进行表面功能化修饰的金磁微粒；1.2)于空气恒温振荡器中反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，得到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微粒；所述清洗缓冲液为下列任一溶液pH＝4 9，0.005 0.5M，且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％Triton X 100的磷酸盐缓冲液；pH＝6 9，0.1 3M且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％Triton X 100的三羟甲基氨基甲烷 盐酸溶液；pH＝3 6，0.01 3M且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％Triton X 100的醋酸盐缓冲液；pH＝6 9，0.1 10M且含有0.5 5％Tween20或者0.05 2％Triton X 100的硼酸盐缓冲液；pH＝2 5，0.01 1M且含有0.5 5％Tween20或者0.5 5％TritonX 100的甘氨酸 盐酸缓冲液；1.3)封闭加入500ul～2ml的封闭剂到表面已固定抗体或配体或抗原的金磁微粒中，置于20～80℃、50～220rpm的恒温振荡器中充分混匀5min～12h进行封闭；所述封闭剂是采用上述偶联缓冲液溶解了以下物质的一种或多种牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清、山羊血清；上述组分的终浓度均为0.05％ 10％；1.4)将偶联抗体且封闭完毕的金磁微粒在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除未结合的生物分子，最后将此偶联有抗体且封闭完成的金磁微粒溶解在层析工作液中；所述层析工作液是缓冲液基液加上效应物，其中缓冲液基液为下列任一溶液pH＝4 9，0.005 0.5M的磷酸盐缓冲液；pH＝6 9，0.1 3M三羟甲基氨基甲烷 盐酸溶液；pH＝3 6，0.01 3M醋酸盐缓冲液；pH＝6 9，0.1 10M的硼酸盐缓冲液；pH＝2 5，0.01 1M甘氨酸 盐酸缓冲液；效应物是以下的一种或者几种(1)柠檬酸，终浓度为0.1％ 5％，(2)三羟甲基氨基甲烷，终浓度为0.1％ 5％，(3)脱脂奶粉，终浓度为0.01％ 20％，(4)叠氮化钠，终浓度为0.01％ 5％，(5)分子量4000 20000的聚乙二醇，终浓度为0.01％ 5％，(6)Tween20，终浓度为0.5 5％；2)制作免疫层析检测条；该免疫层析检测条包括样品垫，结合垫，免疫层析膜，吸水纸和支撑板；2.1)免疫层析检测条的各部件的准备和处理所述样品垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；样品垫处理程序为将样品垫浸泡于样品垫处理液中0.5分钟到2分钟后取出，或者按照0.5ul/20cm2 20ul/20cm2的比例将样品垫处理液均匀喷涂于样品垫上，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；所述样品垫处理液为缓冲液基液加上效应物；所述缓冲液基液为下列溶液中任一溶液pH＝4 9，0.005 0.2M的磷酸盐缓冲液；pH＝6 9，0.01 3M三羟甲基氨基甲烷 盐酸溶液；pH＝3 6，0.01 3M醋酸盐缓冲液；pH＝6 9，0.1 10M的硼酸盐缓冲液；pH＝2 5，0.01 1M甘氨酸 盐酸缓冲液；所述效应物是以下的一种或者几种(1)分子量4000 20000的聚乙二醇，终浓度为0.01％ 5％，(2)蔗糖或者海藻糖，终浓度为5％ 80％，(3)Triton X 100，终浓度为0.5 5％；所述结合垫的材质为疏水性或亲水的玻璃纤维或聚酯纤维；结合垫处理程序为首先将玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型；然后将其浸泡于步骤1)所述的最初的层析工作液中0.5分钟到2分钟，或者采用非浸泡方式，而是按照0.5ul/20cm2 20ul/20cm2的比例将样品垫处理液均匀喷涂于裁剪成型的玻璃纤维或聚酯纤维裁上；然后15℃到60℃烘干或冷冻干燥；然后取经过步骤1.4)所得的含有偶联抗体或配体或抗原且封闭金磁微粒的层析工作液按照0.5ul/20cm2 20ul/20cm2的比例喷涂于的结合垫上；最后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；所述免疫层析膜的材质为硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜、聚酯膜，或硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合膜之一；针对偶联抗体或配体或抗原选择的不同，免疫层析膜的处理程序分别为若检测抗原，则金磁微粒偶联与检测抗原特异结合的抗体，首先取与待检目标物特异结合的另一抗体，按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成检测带，取多克隆抗体按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成与所述检测带平行的质检带，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫层析膜置于所述封闭剂中浸泡0.5秒到30分钟，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；若检查抗体，则金磁微粒偶联检测抗体特异结合的抗原，则首先取与待检目标物特异结合的另一抗原，按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成检测带，取多克隆抗体按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成与所述检测带平行的质检带，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫层析膜置于所述封闭剂中浸泡0.5秒到30分钟，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；若检测小分子受体，则金磁微粒偶联与待检目标物特异结合的配体，则首先取与待检目标物特异结合的另一配体，按照0.1ul/20cm 20ul/20cm的比例喷涂成线在免疫层析膜上形成检测带，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥；之后将包被有抗体的免疫层析膜置于所述封闭剂中浸泡0.5秒到30分钟，然后15℃～60℃烘干或冷冻干燥，待用；2.2)免疫层析检测条各部件组装成型，即在带有不干胶的支撑板上依次贴上免疫层析膜、样品垫、结合垫和吸水垫，免疫层析膜设于底衬上的中部，样品垫和吸水垫分别设于支撑板上的两边，结合垫设于加样垫与层析膜之间，层析膜的另一端接吸水垫，然后用不干胶彻底固定，最后裁切成免疫层析检测条；3)利用双抗夹心法或竞争法，对被测样品进行目视化判读或磁信号定量检测。
2.根据权利要求1所述的金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，其特征在于所述样 品垫，结合垫和免疫层析膜在制作时，经过15°C到60°C烘干或冷冻干燥后，置于4°C待用。
3.根据权利要求2所述的金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，其特征在于步骤3) 在对被测样品定性地可目视化判读的同时，进行高灵敏度的定量检测。
4.根据权利要求1至3任一所述的金磁微粒标记免疫层析检测条，用于人体与动植物的疾病检测，环境的检测，食品安全检测、以及毒品和药物滥用检测。
全文摘要
本发明提供一种金磁微粒标记免疫层析快速检测方法，旨在解决传统免疫层析分析法的检测方法在临床实践中易造成主观差异化、检测精度和灵敏度低、操作繁复、适用领域窄的问题。该检测方法的基本思想是金磁微粒偶联抗体或配体或抗原以后在与之匹配的工作液和免疫层析装置中能够快速，定量的高灵敏度地检测被分析物。本发明既可以通过金磁微粒的特征颜色进行可目视化的判读也可通过金磁微粒磁信号的强弱对被测物进行定量检测，方法简单，成本低，能够实现人体与动植物的疾病检测，环境的检测，食品安全检测、以及毒品和药物滥用检测等。
文档编号G01N33/76GK101893627SQ20101022244
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者崔亚丽, 惠文利, 石峰 申请人:崔亚丽
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